Efectul factorului de creștere a nervilor asupra susținerii memoriei spațiale depinde de inervația colinergică a hipocampului

Pentru mai multe informatii:ali.ma@wecistanche.com

Abstract

Terapia genică a factorului de creștere a nervilor (NGF) a fost utilizată în studiile clinice ale bolii Alzheimer. Înțelegerea mecanismului de bază al modului în care influențează NGFmemoriepoate ajuta la dezvoltarea de noi strategii de tratament. Atât NGF cât și sistemul colinergic joacă roluri importante în învățare șimemorie. NGF este esențial pentru menținerea inervației colinergice a hipocampusului, dar depinde dacă efectul de susținere al NGF asupra învățării șimemorieeste dependentă în mod specific de inervația colinergică intactă a hipocampului. Aici caracterizăm comportamentul și măsurătorile hipocampului ale volumului, neurogenezei, potențialării pe termen lung și inervației colinergice, la șoarecii cu deficit de Ngf specifici creierului. Rezultatele noastre arată că șoarecii knockout prezintă anxietate crescută, învățare spațială și memorie afectată, scăderea volumului hipocampului adult, neurogeneza, potențare pe termen scurt și inervație colinergică. Supraexprimarea Ngf în hipocampul șoarecilor knockout ai genei Ngf salvați spațialmemorieși inervațiile colinergice parțial restaurate, dar nu și anxietatea. Depleția selectivă a inervației colinergice a hipocampului a dus la afectarea spațialămemorie. Cu toate acestea, supraexpresia Ngf în hipocamp nu a reușit să salveze spațialememoriela șoarecii cu epuizare selectivă a fibrelor colinergice din hipocamp. În concluzie, demonstrăm impactul deficienței de Ngf în creier și furnizăm dovezi că efectul NGF asupra spațiuluimemoriese bazează pe inervațiile colinergice intacte din hipocamp. Rezultatele sugerează că țintirea colinergică adecvată poate fi o cerință critică pentru utilizarea cu succes a terapiei genice NGF a bolii Alzheimer.

Wei Zheng Eu1, Yu-Ju Chen1, Wei-Ting Chen1, Kuan-Yu Wu1, Cheng-Yu Tsai1, Sin-Jhong Cheng2,

Roderick N. Carter3 și Guo-Jen Huang 1,4,5

Introducere

Factorul de creștere a nervilor (NGF), un factor de creștere neurotrofic identificat pentru prima dată în anii 1950, promovează creșterea neuriților și stimulează diferențierea celulelor nervoase în experimentele de cultură1–3. În creier, cea mai mare expresie a ARNm Ngf se găsește în hipocamp4. NGF activează doi receptori: receptorul NGF cu afinitate scăzută (receptorul neurotrofic comun, p75) și receptorul NGF cu afinitate mare (TrkA), care sunt ambii exprimați în neuronii colinergici bazali ai creierului anterior5,6 și sunt cunoscuți că inervează structura hipocampului7. Dovezile sugerează că NGF este eliberat din celulele țintă și declanșează căi de semnalizare retrograd de-a lungul axonului8. Există o legătură puternică între NGF și sistemul colinergic din hipocamp. Injectarea NGF în ventriculii laterali crește activitatea colin acetiltransferazei (ChAT) în hipocamp9. Mai mult, s-a demonstrat că NGF protejează neuronii colinergici bazali ai creierului anterior după lezarea axonală a fibrelor care se proiectează hipocampului10.

Click pentru Cistanche tubulosa beneficii și efecte secundare pentru memorie

Au fost propuse mai multe ipoteze pentru cauza bolii Alzheimer. Una dintre ele este ipoteza NGF11. De la începutul anilor 1980, mai multe rapoarte au arătat că disfuncția colinergică semnificativă apare la vârstnicii dementați și că degenerarea neuronală colinergică este asociată cu deficite cognitive în boala Alzheimer1.

Noul radiotrasor 18F-fluoroetoxi benzen pentru tomografie cu emisie de pozitroni (PET) a furnizat dovezi mai recente că există o pierdere terminală colinergică mai corticală la pacienții cu boala Alzheimer13. Studiile pe animale oferă, de asemenea, dovezi că densitatea inervațiilor colinergice scade la șobolanii în vârstă și la șoarecii transgenici asemănător bolii Alzheimer14,15. Mai mult decât atât, șoarecii în vârstă anti-NGF prezintă fenotipuri asemănătoare bolii Alzheimer, cum ar fi pierderea neuronală, deficitele colinergice și tulburările de memorie spațială16. Un studiu recent sugerează că calea metabolică a NGF este afectată la pacienții cu boala Alzheimer, constatând că mașina moleculară pentru maturarea proNGF este redusă, în timp ce cea pentru degradarea NGF matur este îmbunătățită17.

Sistemul colinergic central este implicat în învățare18,19 și NGF pare să joace un rol important în sprijinirea acestui lucru. Infuzia intraventriculară de NGF poate salva atât depleția colinergică ușoară în hipocamp, cât și deficitele de memorie la șoarecii mutanți heterozigoți Ngf plus /-20. Dovezile arată, de asemenea, că NGF modulează puterea proiecțiilor colinergice la hipocamp și afectează plasticitatea neuronală și reținerea comportamentului de învățare spațială21. Cu toate acestea, rămâne necunoscut dacă efectele NGF asupra învățării depind de aceste proiecții colinergice la hipocamp. Clarificarea acestui lucru poate oferi o mai bună înțelegere pentru dezvoltarea unui tratament pentru boala Alzheimer. În acest studiu, am abordat această întrebare utilizând șoareci knockout condiționat (cKO) Ngf specifici creierului pentru a dezvălui importanța NGF în anxietate și memoria spațială. Mai mult, am constatat că efectul NGF asupra memoriei spațiale, dar nu și anxietatea, necesită proiecția colinergică la hipocamp.

Materiale și metode

animale

Experimentele au fost efectuate pe cohorte echilibrate în funcție de sex de 12-șoareci Ngf cKO în vârstă de o săptămână și șoareci de tip sălbatic (WT). S-au folosit șoareci floxați cu Ngf de la Centrul Național pentru Animale de Laborator, Taiwan (RMRC 13175) și șoareci Sox1::Cre (nr. cod CDB0525K)22 pentru a genera Ngf flox/flox; Sox1::Cre soareci in acest studiu. Ngf flox/flox; Șoarecii Sox1::Cre (cKO) și Ngf flox/flox (WT) utilizați în acest studiu au fost colegi de așternut generați prin încrucișarea Ngf flox/flox; Șoareci Sox1::Cre cu șoareci Ngf flox/flox homozigoți. Șoarecii masculi C57BL/6Narl în vârstă de douăsprezece săptămâni au fost utilizați pentru denervarea colinergică a hipocampului. Șoarecii s-au crescut în condiții specifice fără agenți patogeni certificate AAALAC. Au fost găzduiți într-un ciclu lumină-întuneric de 12:12 la o temperatură de 22 de grade și un nivel de umiditate de 60-70 la sută. Animalele aveau acces ad libitum la hrană și apă. Toate procedurile au fost efectuate în conformitate cu reglementările locale și au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea Chang Gung (Număr de permis: CGU105-033).

Teste de comportament

Pentru testele comportamentale, mișcarea animalelor a fost înregistrată și urmărită folosind un sistem de înregistrare video. Șoarecii pentru efectuarea analizei comportamentale au fost randomizați într-o cușcă separată pentru testare, cu așternut, hrană și apă, înainte de a fi transferați înapoi în cușca de acasă. Toate labirinturile sunt realizate din acril; nu există așternut în labirint în timpul testului. Toate datele comportamentale au fost înregistrate și achiziționate automat de software-ul Ethovision.

Câmp deschis

Șoarecii au fost plasați într-un câmp deschis rotund cu raza =45 cm și cerc interior cu raza =30cm. Au fost lăsați să se miște liber timp de 5 minute și au fost urmăriți de software-ul Ethovision.

Labirint plus ridicat

Aparatul folosit pentru testul labirint plus elevat (EPM) a constat din două brațe deschise (30 × 5 cm) și două brațe închise de aceeași dimensiune, cu pereți înalți de 15 cm. Labirintul a fost ridicat la 38 cm deasupra podelei. Șoarecii au fost plasați în EPM timp de 5 minute cu lumină slabă și a fost măsurat timpul petrecut în brațul deschis.

Labirint de apă Morris

Aceasta a fost efectuată într-un rezervor de labirint de apă rotund (110 cm în diametru, 50 cm adâncime) situat într-o cameră luminoasă. Piscina a fost umplută până la o adâncime de 15 cm cu apă făcută opaca prin adăugarea de vopsea albă, netoxică. O platformă pătrată de evacuare (9 × 9 cm) a fost scufundată la 0,5 am sub suprafața apei, într-o poziție fixă ​​într-unul dintre cadrane. Șoarecii au fost antrenați timp de 4 zile. În fiecare zi de antrenament, șoarecii au primit patru teste de antrenament. Intervalul dintre încercări a fost de 15 minute. La fiecare probă, șoarecii au fost plasați în bazin într-una din cele patru locații de pornire. Șoarecilor li s-a permis să înoate/căuteze timp de maximum 90 de secunde sau până când au găsit platforma și li sa permis să rămână pe platformă timp de 30 de secunde. Dacă mouse-ul nu a reușit să găsească platforma într-o anumită încercare, mouse-ul a fost ghidat către platformă. La opt zile după ultima încercare, pentru testul de memorie, platforma a fost scoasă din bazin, iar mouse-ul a fost lăsat în anii 90 să o caute. Achiziția și analiza datelor au fost efectuate automat, inclusiv lungimea traseului de înot a încercărilor de antrenament și timpul procentual petrecut în cadranul țintă pentru testul de memorie.

Recunoașterea obiectelor inedite

Șoarecilor li s-a permis să se familiarizeze cu doi cilindri acrilici albi identici (înălțime =9cm, diametru= 5 cm) timp de 15 minute pe zi, timp de 2 zile. Obiectele se aflau într-o locație fixă ​​într-o cameră albă. În timpul fazei de testare din a treia zi, unul dintre obiectele expuse a fost înlocuit cu un pahar gri (înălțime=8,7 cm, diametru=5cm) fixat cu capul în jos în cameră, iar celălalt obiect a fost înlocuit cu un cilindru acrilic alb nou, dar identic. Timpul petrecut explorând fiecare dintre obiecte a fost colectat și analizat de software-ul Ethovision.

Analiza volumetrică a hipocampului

Toate scanările imagistice prin rezonanță magnetică (IRM) au fost efectuate utilizând ClinScan 70/3{0 USR (Bruker BioSpin, Ettlingen, Germania) cu o bobină cu matrice fază adaptată pentru capul mouse-ului. A fost aleasă o secvență de gradient-eco tridimensională (3D) pentru a achiziționa imagini multi-slice ale creierului cu următorii parametri: timp de repetiție=30 ms;timp ecou=15 ms; unghi de întoarcere=20";număr de medii=5; grosimea feliei =0,2 mm; rezoluție în plan=256×256; dimensiune voxel=59×59 ×200μm².Timpul total de achiziție a fost de aproximativ 15 minute cu 1-2 procente de izofluran ca anestezic. Volumul hipocampului a fost măsurat cu PMOD 3.2 (PMOD Technologies. Elveția) Hipocampii au fost conturați manual în 13 sau 14 felii coronale per animal; volumul fiecărei felii a fost obținut prin înmulțirea zonei conturate cu grosimea feliei (0,2 mm) Volumul total al creierului a fost măsurat folosind zone conturate manual pe 19 felii sagitale per animal, multiplicând zona conturată la grosimea feliei (0,2). mm).Imaginile au fost analizate în aceleași condiții în mod orb.

cuantificarea ARNm

Țesutul hipocampal a fost colectat de la șoareci WT și cKO, apoi omogenizat în Trizol, urmat de extracția cu fenol-cloroform a ARN total. ADNc a fost apoi făcut folosind transcriptază inversă SuperScript Ill (Invitrogen). Experimentele au fost efectuate în dublu exemplar. Nivelurile de expresie genică au fost apoi calculate cu metoda △ACt și normalizate față de un control Gapdh. Ng-Atacant: 5'-TTCTA TACTG GCCGC AGTGA-3; Ngf-Reverse 5-TTAGT CCAGT GGGCT TCAGG-3'

Testul corticosteronului

Probele de sânge au fost colectate între orele 7:30 și 8:00 pm prin puncție în vena facială și au fost colectate în tuburi Microvette" CB300 LH. Plasma a fost separată de sânge integral prin centrifugare și a fost depozitată în tuburi de centrifugă la{{5} }"C până la analiză. Pentru analiză, probele au fost diluate în tampon (1/40), apoi analizate cu un kit EIA de corticosteron (Enzo Life Sciences) conform instrucțiunilor producătorului, așa cum a fost descris anterior.

Prepararea vectorului viral și injecții intra-hipocampale

Pentru experimentul de supraexpresie Ngf, fragmente de ADN care au codificat Ngf (RefSeq NM 013609) sau îmbunătățite. Proteinele fluorescente verzi (eGFP) au fost create prin PCR și subclonate în site-ul Note al unui construct de virus AAV9. Vectorii AAV9 recombinanți au fost produși printr-o metodă standard de transfecție cu triplă plasmidă și au fost purificați prin două runde de centrifugare Csd. Titrurile de vector fizic ale AAV au fost cuantificate prin măsurarea numărului de genomi de vector împachetate folosind o metodă PCR în timp real.

Pentru injecțiile cu vector viral, intervenția chirurgicală a fost efectuată sub anestezie (un amestec Zoletil-Rompun). Șoarecii au primit injecții bilaterale de vectori virali în hipocamp într-un volum de 1,5 ul sub ghidare stereotaxică. Au existat patru locuri de injectare în total (pentru hipocampul dorsal, anterior-posterior(AP)-22 mm. Medial-lateral (ML)±2.0 mm din bregma și dorsal-ventral ( DV)-1,8 mm de la dura; pentru hipocampus ventral, AP-3.{0mm, ML ±3.0 și DV-3 .3mm). Concentrația finală a vectorului AAV injectat a fost de 3,1 × 10 12vg/ml.

Imunohistochimie/hibridare și cuantificare in situ

Toate secțiunile pentru etichetarea Ki67, Doublecortin (DCX,5-Bromo-2'-deoxiuridină (BrdU)/NeuN și ChAT au fost tăiate la o grosime de 4{0μm pe un microtom glisant Secțiunile au fost montate pe lame SuperFrost și uscate peste noapte. Ulterior, lamele au fost incubate în tampon citric 0,01 mol/L timp de 20 min la 90*C, 3% HaO, timp de 10 minute, clătite în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și incubat peste noapte la temperatura camerei cu anticorp de iepure anti-Ki67 (1:3000, Abcam), anticorp de iepure anti-DCX (1:4000, Abcam) și anticorp anti-ChAT (1:200, Abcam). A doua zi, un A fost utilizată procedura standard a trusei IgG ABC de iepure (Vector Lab) iar lamele au reacționat timp de 5-10min cu o tabletă Sigma DAB. Secțiunile au fost apoi acoperite cu DPX.

Pentru dubla marcare BrdU/NeuN, secțiunile au fost incubate în HCI 2N timp de 15 minute la 37"C, neutralizate în borat de sodiu (Sigma) timp de 10min (pH 8,5) și spălate de trei ori în PBS înainte de incubare cu șobolan. anti-BrdU (1:1500, Abcam) și anti-NeuN de șoarece (1:1000, Millipore). După trei spălări în PBS (5 min fiecare), secțiunile au fost incubate cu anticorpul secundar fluorescent (1:250, Alex Fluor 488). și Texas Red, Invitrogen) timp de 2 ore în 0,3% Triton/PBS cu 2% ser de capră.

Pentru hibridizarea Ngf in situ, s-au folosit sonda Ngf (Număr de catalog 565131) și Kitul de reactiv RNAscope 2.5 HD Brown (Diagnostic celular avansat, SUA) și colorarea a fost efectuată conform manualului produsului. Pe scurt, lamele au fost incubate în tampon de recuperare 1 x timp de 5 minute la 100 grade C, 3 procente H, O, timp de 10 minute și clătite în tampon de spălare 1 x. Lamele au fost apoi incubate în protează timp de 20 min și, ulterior, sonda țintă timp de 2 ore la 40"C. După o serie de amplificare, DAB a fost folosit pentru a vizualiza ARN-ul.

Celulele marcate cu DCX, Ki67-și BrdU/NeuN dublu etichetate au fost numărate pe fiecare a opta secțiune prin întreaga întindere rostrocaudală a stratului de celule granulare (șase secțiuni per animal). Numărul de celule numărate a fost apoi înmulțit cu 16, pentru a obține o estimare a numărului total de celule DCX, Ki67 și BrdU pozitive din girusul dentat. Toate lamele au fost randomizate și codificate înainte de analiza cantitativă. Somatele celulare marcate cu ChAT au fost numărate pe fiecare a doua secțiune prin extinderea rostrocaudală a nucleului membrului vertical al benzii diagonale (VDB) și septul medial (MS) (patru secțiuni per animal). Pentru o imagine reprezentativă a etichetării duble BrdU/NeuN, a fost obținută mai întâi o imagine z-stack (șapte felii în stivă) sub obiectiv x40, urmată de deconvoluție 3D cu modul iterativ rapid folosind software-ul Axiovision Microimaging (Carl Zeiss).

Fibrele colinergice au fost vizualizate în colorarea ChAT și examinate în câmp întunecat, sub obiectiv ×10 (Axio Imager 2, capturat de Nikon D5100). Densitatea fibrelor a fost cuantificată ca intensitate medie (Valoare medie de gri) a semnalului prag sub zona hipocampului cu Imaginea 142g (NIH), densitatea fibrelor colinergice hipocampale a fost cuantificată unilateral pe fiecare a opta secțiune prin întreaga extindere rostrocaudală a întregului hipocamp.

Electrofiziologie în felii hipocampale

Feliile de hipocamp (450 um grosime) au fost tăiate transversal cu un feliator de țesut vibrant (DSK Microslicer DTK-1000; Dosaka EM, Kyoto, Japonia). Feliile au fost lăsate să se recupereze timp de cel puțin 120 de minute și au fost transferate într-o cameră de înregistrare de tip imersiune montată pe un microscop vertical (BX51Wl; Olympus Optical, Kyoto, Japonia) echipată cu un video microscopic cu interferență diferențială cu infraroșu și contrast. Lichidul cefalorahidian artificial oxigenat (5% CO,/95% O) care conține 0,1 mM picrotoxină a fost perfuzat în camera de înregistrare la o viteză de 1-2 ml/min. Un electrod de stimulare bipolar din oțel inoxidabil (Frederick Haer Company, Bowdoinham, ME) (impedanță de 10 Meg-ohm) și o pipetă de sticlă umplută cu 3 M NaCl au fost poziționate în stratul radiatum al CA1 pentru evocarea și înregistrarea potențialelor postsinaptice excitatorii de câmp (fEPSPs). )activitate, respectiv. Facilitarea pulsului pereche (PPF) a fost investigată la diferite intervale interstimulus și fiecare interval interstimulus a aplicat două impulsuri de curent de scurtă durată (40 μs) la fiecare 20 de secunde de cel puțin patru ori. Rapoartele pantelor inițiale de la al doilea răspuns fEPSP/primul răspuns fPSP au fost măsurate pentru analiza datelor. Pentru experimentele de potențare pe termen lung (LTP), activitatea fPSP de bază stabilă a fost evocată la fiecare 20 de secunde timp de cel puțin 20 de minute, apoi stimularea de înaltă frecvență (HFS)-LTP a fost indusă folosind 5 trenuri de 100 de impulsuri la 100 Hz cu un interval între deformari. de 20 de ani. Urmele electrofiziologice au fost amplificate cu un amplificator (Multiclamp 700 B; Axon Instruments, Union City, CA). Toate semnalele au fost filtrate trece-jos la 1 kHz și digitizate la 10 kHz folosind o interfață CED Micro 1401 MKII (Cambridge Electronic Design). Datele au fost colectate folosind software-ul Signal (Cambridge Electronic Design, Cambridge, Marea Britanie). Răspunsurile sinaptice au fost normalizate la media liniei de bază. Valorile de potențare pe termen scurt (STP) și LTP au fost determinate prin medierea a 5 min de valori normalizate a pantei la 10-15 min și, respectiv, 55-60 min post-HFS. Experimentatorii care au efectuat electrofiziologia au fost orbiți de grupul de șoareci.

Denervarea colinergică a hipocampului

Anticorpul murin p{{0}}cu Saporin conjugat (mu p{75-SAP) (ATS Bio, San Diego) a fost utilizat în denervarea colinergică. Apoi, s-au administrat 0,2 ug de mu p75-SAP per loc, iar locurile de injectare au fost similare cu locurile de injectare a vectorului viral (patru locuri de injectare per animal).

analize statistice

Media ± SEM a fost determinată pentru fiecare grup. Analiza statistică a fost efectuată folosind software-ul Graphpad Prism. Datele au fost analizate printr-o analiză a varianței sau testul t, după caz. Metoda Bonferroni a fost efectuată atunci când a fost cazul. Diferențele au fost considerate semnificative atunci când p a fost<>

Rezultate

Scăderea neurogenezei hipocampului, a densității fibrelor colinergice și a volumului la șoarecii Ngf KO specifici sistemului nervos

O provocare majoră pentru studiul funcțiilor NGF la șoarecii adulți este aceea că modelele convenționale KO mor prematur. Până în prezent, cele mai multe rapoarte au folosit blocanți NGF, cum ar fi ARN interferenți mici sau anticorpi, pentru a evalua efectul NGF52. Pentru a studia rolul NGF în creier, am încrucișat șoareci floxați cu Ngf cu șoareci Sox: Cre, care exprimă Cre în tubul neural de la E1127. Acești șoareci cKO specifici țesuturilor ne permit să investigăm funcțiile Ngf în creier (Fig. 1A). În primul rând, expresia ARNm Mgf din hipocamp a fost măsurată prin PCR cantitativă. Rezultatele arată o scădere robustă a expresiei Ngf la șoarecii cKO (p<0.0001, tuo="8.24)(Fig.1B)." to="" further="" confirm="" the="" specificity="" of="" this="" brain="" cko,="" we="" measured="" ngf="" mrna="" levels="" in="" the="" whole="" brain,="" liver,="" and="" musde="" from="" wt="" and="" cko="" mice,="" and="" our="" results="" confirm="" the="" specificity="" of="" ko="" (supplementary="" fig.="">

Infuzia de NGF în ventriculii laterali crește atât supraviețuirea neuronilor nou-născuți, cât și activitatea colinergică în hipocamp8. Prin urmare, am întrebat dacă șoarecii cu deficit de Ngf au niveluri mai scăzute de neurogeneză hipocampală adulților și inervație colinergică. Pentru a detecta neurogeneza adulților, am injectat BrdU (200 mg/kg, o injecție, intraperitoneal) în șoareci adulți WT și Ngf cKO (în jur de 13 săptămâni). Șoarecii au fost uciși la 34 de zile după această injecție cu BrdU pentru a evalua supraviețuirea neuronală. Am colorat țesutul cerebral pentru Ki67 (un marker de proliferare celulară), DCX (un marker pentru neuronii imaturi) și colorarea dublă pentru BrdU și NeuN (marker neuronal). Pentru a evalua densitatea fibrelor colinergice, am colorat pentru ChAT, enzima responsabilă de sinteza acetilcolinei. Am detectat semnificativ mai puțin Ki67 (p=0.0016, t(16)=3.8) și DCX (p < 0.0001,="" t(16)="8.14)" număr="" de="" celule="" pozitive="" în="" girusul="" dentat="" al="" hipocampului="" la="" șoarecii="" ngf="" cko="" în="" comparație="" cu="" șoarecii="" wt.="" pentru="" dubla="" etichetare="" brdu="" și="" neun,="" șoarecii="" ngf="" cko="" au="" prezentat,="" de="" asemenea,="" o="" tendință="" pentru="" un="" nivel="" mai="" scăzut="" de="" brdu="" plus="" eun="" plus="" numărul="" de="" celule="" (p="0.054," t="" (14)="2.09)" (fig.="" 1c).="" împreună,="" aceste="" date="" demonstrează="" că="" un="" deficit="" de="" ngf="" în="" creier="" are="" ca="" rezultat="" scăderea="" neurogenezei="" hipocampului="" adult.="" corticosteronul="" plasmatic="" este="" un="" factor="" major="" în="" controlul="" neurogenezei="" adulte29="" și,="" astfel,="" pentru="" a="" determina="" dacă="" neurogeneza="" scăzută="" la="" șoarecii="" ngf="" cko="" se="" datorează="" corticosteronului="" plasmatic="" crescut,="" am="" măsurat="" nivelul="" bazal="" de="" corticosteron="" plasmatic="" de="" la="" șoarecii="" wt="" și="" cko.="" nu="" a="" existat="" o="" diferență="" semnificativă="" în="" corticosteronul="" plasmatic="" bazal="" (p="0.24," t="" (9)="1.25)," sugerând="" că="" efectul="" ngf="" asupra="" neurogenezei="" nu="" este="" cauzat="" de="" diferența="" dintre="" corticosteronul="" plasmatic="" (="" suplimentar="" fig.="">

Lucrări anterioare au arătat că proiecțiile colinergice către hipocamp provin din prosencefalul bazal30. Astfel, am evaluat dacă există modificări ale proiecțiilor septohipocampale colinergice la șoarecii Ngf cKO. Rezultatele noastre de la colorarea ChAT arată că densitatea fibrelor colinergice este dramatic scăzută în hipocampul șoarecilor Ngf cKO (a scăzut cu aproximativ 76 la sută, p < 0,0001,="" t(8)="9.56)" (fig.="" 1d),="" dar="" nu="" și="" alte="" regiuni="" corticale,="" cum="" ar="" fi="" cortexul="" prefrontal="" medial="" (p="0.12," t(8)="1.73)" și="" cortexul="" de="" asociere="" temporală="" (p="0.2," t(16)="" )="1.31)" (figura="" suplimentară="" s2a,="" b).="" împreună,="" aceste="" date="" indică="" faptul="" că="" ngf="" este="" necesar="" pentru="" susținerea="" proiecțiilor="" colinergice="" la="" hipocamp,="" dar="" nu="" și="" la="" cortex.="" apoi,="" am="" analizat="" numărul="" de="" celule="" neuronale="" colinergice="" din="" vdb="" din="" broca="" și="" ms,="" de="" unde="" proiectează="" fibre="" colinergice="" către="" hipocamp31,32.="" șoarecii="" ngf="" cko="" prezintă="" o="" scădere="" mică="" (aproximativ="" 20="" la="" sută="" scăzut)="" a="" numărului="" de="" celule="" chat="" în="" ms="" și="" vdb="" (p="0.022," t="" (16)="2.52)" (figura="" suplimentară="" s2c)="">

În timpul secționării țesutului cerebral, am descoperit că hipocampul șoarecilor cKO părea a fi mic. Pentru a confirma acest lucru, am efectuat o scanare RMN și rezultatele noastre confirmă că Ngf cKO are hipocampi mai mici decât WT (p < 0.0001,="" t(12)="12)." pentru="" a="" verifica="" în="" continuare="" acest="" lucru,="" am="" disecat="" hipocampul="" și="" am="" măsurat="" greutatea="" și="" am="" constatat="" că="" hipocampii="" șoarecilor="" cko="" au="" o="" greutate="" mai="" ușoară="" în="" comparație="" cu="" șoarecii="" wt="" (p="0.01," t="" (23)="2." 79)="" (fig.="">

Scăderea răspunsului la anxietate și a învățării spațiale la șoarecii Ngf cKO

Blocarea NGF endogen afectează reținerea memoriei spațiale21 și perturbă semnalizarea colinergică, în timp ce ștergerea sistemului colinergic al creierului anterior influențează anxietatea și învățarea spațială18,33. Pentru a înțelege mai bine efectele Ngf cKO asupra anxietății și învățării, am supus șoarecii la câmp deschis, EPM, testarea labirintului de apă și recunoașterea obiectelor noi.

Ștergerea Ngf a crescut comportamentul asemănător anxietății și a scăzut învățarea și memoria spațială, fără a afecta recunoașterea obiectului nou. În testul pe câmp deschis, șoarecii cKO au cheltuit mai puțin în zona centrală (p=0,04, t(40)=2,09), fără nicio diferență în distanța totală parcursă (p {{7 }}.31, t(40)=1.01) (Fig. 2A). În EPM, șoarecii cKO au petrecut mai mult timp în brațul deschis (p=0,001, t(40)=3,43), dar nu au prezentat o diferență semnificativă în distanța totală (p {{{ 18}}.25, t(40)=1.15) (Fig. 2B). În testul labirintului cu apă, șoarecii Ngf cKO au avut rezultate mai proaste în secțiunea de antrenament (p=0.001, F(1,16)=15.65). O săptămână mai târziu, am efectuat un test de memorie. Șoarecii au fost plasați în labirintul de apă, dar cu platforma îndepărtată. Șoarecii Ngf cKO au petrecut mai puțin timp în cadranul țintă (p=0.01, t (16)=2.79) (Fig. 2C). Pentru recunoașterea obiectelor noi, nu există nicio diferență în DI (p=0.41, t(20)=0.82). Împreună, aceste date indică faptul că NGF joacă un rol în medierea anxietății și a învățării/memoriei spațiale.

Hipocampal LTP a fost considerat pe scară largă un model sinaptic al memoriei34, iar perfuziile directe intraseptale de NGF facilitează inducerea LTP21. Pentru a examina efectul NGF asupra plasticității sinaptice, am măsurat LTP prin înregistrarea electrofiziologică ex vivo în calea colaterală a hipocampului CA1 Schaffer a feliilor de creier la șoarecii WT și Ngf cKO. Rezultatele noastre au arătat că HFS a produs o creștere persistentă a pantei fEPSP-urilor în neuronii CA1 atât ai șoarecilor WT, cât și ai Ngf cKO, dar nicio diferență în LTP (Fig. 2D). Cu toate acestea, după cinci trenuri de stimul tetanizant HFS, STP a scăzut semnificativ în grupul Ngf cKO (10-15 min după HFS, p=0.006, t (10)=3.39) ( Fig. 2E). Pentru a confirma în continuare efectul asupra transmiterii presinaptice, am examinat plasticitatea sinaptică pe termen scurt de către PPF. Rapoartele pulsului pereche (PPR) au fost similare între șoarecii Ngf cKO și WT. Cu toate acestea, observăm o tendință de PPR îmbunătățită din probele de Ngf cKO folosind un interval interstimul de 50 ms (p=0.094, t (18)=1.76) (Fig. 2F), sugerând că transmisia presinaptică poate să fi fost modificată la șoarecii Ngf cKO.

Supraexprimarea Ngf în hipocampul șoarecilor cKO salvează memoria spațială, dar nu și anxietatea

Pentru a determina dacă fenotipurile comportamentale pe care le-am observat la șoarecii Ngf cKO pot fi inversate prin supra-exprimarea Ngf în hipocamp, am injectat vector viral AAV-CB (actină de pui)-Ngf (supraexpresie) sau vector viral AAV-CB-eGFP ( control) în hipocampul șoarecilor Ngf cKO. La paisprezece zile după operație, i-am supus pe toți șoarecii la teste comportamentale. Rezultatele nu arată nicio diferență semnificativă în testul în câmp deschis (timp în zona centrală, p=0,59, t(37)=0,54) și EPM (timpul în braț deschis, p {{12} }.76, t(37)=0.29) (Fig. 3A, B). Pentru labirintul de apă, nu a fost găsită nicio diferență în secțiunea de antrenament (p=0.54, F(1,15)=0.39). Cu toate acestea, șoarecii cKO cu supraexpresie Ngf au petrecut mai mult timp în zona țintă în comparație cu grupul de control (p=0.008, t (15)=3.01) (Fig. 3C, D). După recoltarea țesutului cerebral, am confirmat supraexprimarea Ngf prin hibridizare in situ și PCR în timp real (Fig. 3E, F). De asemenea, am detectat un nivel semnificativ mai mare de fibre colinergice în hipocampul șoarecilor care supraexprimă Ngf (p=0.001, t (10)=4.19) (Fig. 3G, H). Aceste rezultate sugerează că șoarecii Ngf cKO cu supraexpresie Ngf hipocampală pot restabili inervațiile colinergice și memoria spațială, dar nu și anxietatea.

Memoria spațială afectată la șoareci cu denervare colinergică în hipocamp

Șoarecii Ngf cKO au prezentat o scădere severă a inervației fibrelor colinergice din hipocamp, care a fost restabilită prin supraexprimarea Ngf din hipocamp. Acest lucru s-a corelat cu restabilirea performanței memoriei spațiale (fără o îmbunătățire a anxietății). Prin urmare, am abordat dacă epuizarea fibrelor colinergice în mod selectiv în hipocamp influențează anxietatea sau memoria spațială în labirintul de apă.

Un raport anterior a arătat că anti-p75NTRSaporin este o imunotoxină colinergică specifică la șoareci35. În acest scop, am injectat anti-p75NTRSaporină (sau vehicul PBS ca control) în hipocampul șoarecilor C57. La paisprezece zile după operație, am supus aceste două grupuri de șoareci la teste comportamentale. Nu am găsit nicio diferență semnificativă atât în ​​testul în câmp deschis (timp în zona centrală, p=0,5, t(15) {{10}},68) și EPM (timp în brațele deschise). , p=0.51, t(14)=0.66) (Fig. 4A, B). Pentru labirintul de apă, nu a fost găsită nicio diferență în secțiunea de antrenament (p=0.49, F(1,14)=0.49); totuși, șoarecii injectați cu anti-p75NTRSaporină în hipocamp au petrecut mai puțin timp în zona țintă în comparație cu controlul PBS (p=0.035, t (14)=2.33) (Fig. 4C, D). După recoltarea țesutului cerebral, am confirmat că denervarea colinergică a avut loc în hipocamp prin colorare ChAT (p <0,0001, t(10)="11,85)," arătând="" de="" asemenea="" că="" fibrele="" colinergice="" din="" cortex="" au="" fost="" cruțate="" (p="" {{="" {37}}.184,="" t(14)="1.39)" (fig.="" 4e).="" aceste="" rezultate="" demonstrează="" că="" sistemul="" colinergic="" al="" hipocampului="" este="" necesar="" pentru="" menținerea="" funcției="" memoriei="" spațiale,="" fără="" a="" avea="" un="" impact="" asupra="">

Efectul NGF asupra memoriei spațiale depinde de sistemul colinergic al hipocampului

Apoi am abordat dacă beneficiul memoriei spațiale câștigat prin supraexprimarea Ngf în hipocampul șoarecilor Ngf cKO depinde de inervația colinergică a hipocampului intactă. Am injectat atât vectori virali anti-p75NTRSaporin, cât și AAV-Ngf în hipocampul șoarecilor Ngf cKO. Pentru grupul de control, am injectat atât vectori virali anti-p75NTRSaporin, cât și AAV-eGFP. La paisprezece zile după operație, am evaluat atât anxietatea, cât și memoria spațială. Rezultatele nu au arătat nicio diferență între AAV-Ngf și AAV-eGFP în testul în câmp deschis (timp în zona centrală, p=0,6, t(33)=0,51) și EPM (timp în brațele deschise, p=0.92, t(33)=0.09) (Fig. 5A, B). Pentru învățarea spațială și memorie, nu au existat diferențe între grupuri, atât în ​​secțiunea de antrenament (p=0.94, F(1,36)=0.004) cât și în testul de memorie (p {{{ 26}}.44, t(36)=0.77) (Fig. 5C, D). După recoltarea țesutului cerebral, am evaluat densitatea fibrelor colinergice hipocampale prin colorare ChAT și ambele grupuri au prezentat o epuizare severă a fibrelor colinergice hipocampului, deși un nivel ușor mai mare de densitate a fibrelor a fost găsit la șoarecii AAV-Ngf comparativ cu șoarecii AAV-eGFP (p.=0.01, t(12)=2.83) (Fig. 5E, F). PCR în timp real a confirmat că grupul AAV-Ngf a crescut dramatic expresia Ngf în comparație cu grupul de control (p=0.0004, t (12)=4.89) (Fig. 5G). Aceste date sugerează că efectul benefic al NGF asupra memoriei spațiale necesită o inervație colinergică intactă a hipocampului.

Discuţie

În acest studiu, ne-am propus să investigăm rolurile NGF din hipocamp și ale sistemului colinergic asupra anxietății, învățării și memoriei. Am arătat că șoarecii cu ștergere Ngf specifică creierului (Mgf ckO) prezintă anxietate crescută și un deficit în învățarea spațială. Șoarecii Ngf cKO au prezentat, de asemenea, niveluri mai scăzute de neurogeneză adultă, volum mai mic al hipocampului, STP afectat și o epuizare dramatică a inervațiilor colinergice în hipocamp. Supraexprimarea Ngf în hipocampul șoarecilor KO a genei Ngf a salvat memoria spațială, dar nu a crescut anxietatea. Interesant, am observat, de asemenea, o restabilire parțială a inervației colinergice în hipocamp în urma supraexprimării Ngf în această structură. Pentru a stabili dacă efectul NGF asupra memoriei spațiale depinde de aceste inervații colinergice, am epuizat mai întâi fibrele colinergice hipocampale la șoarecii WT C57 prin injectarea unei imunotoxine colinergice în hipocamp și am confirmat că fibrele colinergice hipocampale susțin memoria spațială. Apoi, pe șoarecii de fundal Ngf cKO, am epuizat fibrele colinergice hipocampale, dar am crescut expresia Ngf simultan prin utilizarea AAV-Ngf, care au fost comparați cu șoareci similari cu epuizare colinergică, dar injectați cu controlul AAV-eGFP. Rezultatul a arătat că re-exprimarea nivelurilor ridicate de Ngf în hipocamp nu a îmbunătățit memoria spațială. Astfel, arătăm că efectul restaurator al NGF în Ngf cKO depinde de inervațiile colinergice hipocampale intacte și nu de un alt mecanism.

S-a demonstrat că NGF furnizat în mod exogen crește supraviețuirea neuronilor nou-născuți28 și învățarea spațială36 la rozătoare, în timp ce blocarea NGF de către anticorpi afectează memoria spațială21. În concordanță cu un rol de susținere pentru NGF în acești parametri, am arătat că ștergerea Ngf specifică sistemului nervos central prezintă o reducere a proliferării celulare și a neurogenezei. În testele de comportament, am observat și afectarea anxietății și a învățării/memoriei spațiale.

Un studiu anterior Ngf KO a furnizat dovezi care arată că NGF este nelipsit pentru învățare și memorie37. Cu toate acestea, autorii nu au efectuat un test de sondă (secțiunea de memorie), ci în schimb a fost efectuată învățarea inversă. În plus, 60% din fibrele colinergice hipocampale au rămas încă la șoarecii Ngff/f-Nes::Cre în acel studiu. În modelul nostru de șoareci, detectăm doar 20% din fibrele colinergice rămase în șoarecii Ngff/f–Sox1::Cre. Această discrepanță poate explica diferența de comportament pe care am observat-o, deoarece experimentul nostru oferă dovezi că inervațiile colinergice din hipocamp sunt necesare pentru efectul NGF asupra memoriei spațiale. Fenotipul de anxietate pe care l-am observat la șoarecii Ngf cKO nu poate fi inversat prin supraexprimarea Ngf hipocampal. O posibilitate pentru aceasta este că fenotipul de anxietate pe care l-am observat la șoarecii Ngf cKO a fost o consecință a inactivării Ngf într-un stadiu incipient. Alternativ, NGF poate acționa în afara hipocampului pentru a modula anxietatea. Cu toate acestea, observăm regenerarea fibrelor colinergice și o îmbunătățire a reținerii memoriei spațiale la șoarecii hipocampali care supraexprimă Ngf, iar acest rezultat este în concordanță cu un studiu anterior la șobolani în vârstă38.

Am descoperit că leziunea colinergică a hipocampului nu a afectat anxietatea, ci a afectat memoria spațială. Rezultatele noastre sunt în contradicție cu rapoartele anterioare care au arătat microinfuzia unui inhibitor de acetilcolinesterază sau antagoniști ai receptorilor muscarinici M1 și M2 în modulul de anxietate al hipocampului39,40. Cu toate acestea, rezultatele noastre sunt în concordanță cu un raport care nu a găsit niciun efect asupra anxietății în urma unei reduceri a inervației colinergice a hipocampului care a fost obținută prin injectarea de imunotoxină în MS și VDB de Broca41. Pentru învățarea și memoria spațială, mai multe studii sugerează că activitatea ChAT este asociată cu învățarea spațială18,35,42,43, dar alte lucrări nu au arătat niciun efect în învățarea și memoria spațială după leziunea imunotoxină44,45. În experimentul nostru, am descoperit că epuizarea inervației colinergice a hipocampului a afectat memoria spațială, fără a afecta achiziția. Aceste discrepanțe între studii s-ar putea datora diferitelor protocoale comportamentale, vârstei, tulpinii și metodelor de inhibare a sistemului colinergic din hipocamp.

O interacțiune între NGF și sistemul colinergic a fost studiată de mult timp. Pierderea TrkA, precum și ștergerea Ngf, reduce neuronii colinergici în SM și inervațiile colinergice în regiunile corticale și pocampusul șoldului37,46. Rezultate similare au fost observate în modelul nostru cu deficit de Ngf, cu aproximativ 76 la sută din fibrele colinergice hipocampale fiind denervate. Pentru a ști dacă aceste fibre colinergice au contribuit la efectul NGF în învățarea spațială, am crescut expresia Ngf, epuizând în același timp inervațiile colinergice la șoarecii Ngf cKO prin injecție intra-hipocampală cu AAV-Ngf mixt (sau AAV-eGFP pentru grupul de control) și anti-p75NTRSaporină. Rezultatele arată că am crescut dramatic expresia Ngf și, de asemenea, am epuizat cu succes aceste inervații colinergice. Deși densitatea fibrelor colinergice în grupul AAV-Ngf plus anti-p75NTRSaporin a fost puțin mai mare decât grupul AAV-eGFP plus anti-p75NTRSaporin, ambele grupuri au atins 90% din epuizarea fibrelor colinergice în hipocamp în comparație cu șoarecii WT netrați. Nu a fost observată nicio diferență în memoria spațială între aceste grupuri, sugerând că simpla creștere a expresiei Ngf fără inervarea colinergică a hipocampului nu este suficientă pentru a restabili memoria spațială.

Aici folosim șoareci KO condiționati Ngf specifici creierului pentru a dezvălui importanța NGF în reglarea volumului hipocampului, comportamentului, plasticității sinaptice, neurogenezei și inervației colinergice. Mai mult, demonstrăm că efectul NGF hipocampal asupra memoriei spațiale depinde de un sistem colinergic intact. Terapia genică Ngf a fost testată la pacienții cu boala Alzheimer, dar nu s-au găsit efecte în ultimul studiu clinic de fază 247. Cu toate acestea, date recente din studiul clinic anterior de fază 1 cu procedură chirurgicală identică, analizând țesutul post-mortem, au descoperit că AAV-Ngf injectat nu a implicat direct neuronii colinergici țintă48. Datele noastre oferă dovezi că AAV-Ngf poate fi ineficient fără reinervarea colinergică. Studiul nostru, în combinație cu această observație post-mortem recentă, sugerează că este încă prea devreme pentru a concluziona că terapia NGF este ineficientă pentru boala Alzheimer.

Referințe

1 Levi-Montalcini, R. & Hamburger, V. Efectele selective de stimulare a creșterii ale sarcomului de șoarece asupra sistemului nervos senzorial și simpatic al embrionului de pui. J. Exp. Zool. 116, 321–361 (1951).

2. Levi-Montalcini, R. Efectele transplantului de tumori de șoarece asupra sistemului nervos. Ann. NY Acad. Sci. 55, 330–344 (1952).

3. Cohen, S., Levi-Montalcini, R. & Hamburger, V. Un factor de stimulare a creșterii nervoase izolat din sarcoamele 37 și 180. Proc. Natl Acad. Sci. SUA 40, 1014–1018 (1954).

4. Shelton, DL și Reichardt, LF Studii privind expresia genei factorului de creștere a nervului beta (NGF) în sistemul nervos central: nivelul și distribuția regională a ARNm NGF sugerează că NGF funcționează ca un factor trofic pentru mai multe populații distincte de neuroni . Proc. Natl Acad. Sci. SUA 83, 2714–2718 (1986).

5. Lee, TH și colab. Localizarea factorului de creștere a nervilor, imunoreactivitatea trkA și P75 în formarea hipocampului și a creierului bazal al șobolanilor adulți. Neuroscience 83, 335–349 (1998).

6. Sobreviela, T. et al. Profiluri imunoreactive TrkA în sistemul nervos central: colocalizare cu neuroni care conțin receptorul factorului de creștere a nervilor p75, acetiltransferaza colină și serotonina. J. Comp. Neurol. 350, 587–611 (1994).

7. Mesulam, MM, Mufson, EJ, Wainer, BH și Levey, AI Căile colinergice centrale la șobolan: o prezentare generală bazată pe o nomenclatură alternativă (Ch1- Ch6). Neuroscience 10, 1185–1201 (1983).

8. Ehlers, MD, Kaplan, DR, Price, DL & Koliatsos, VE Transportul retrograd stimulat de NGF al trkA în sistemul nervos al mamiferelor. J. Cell. Biol. 130, 149–156 (1995).

9. Vantini, G. şi colab. Factorul de creștere a nervilor induce o creștere dependentă de doză și de lungă durată a activității colin acetiltransferazei în zona septală și hipocampul șobolanilor nevătămați. Acta Neurobiol. Exp. (Războaie.) 50, 323–331 (1990). 10. Hefti, F. Factorul de creștere a nervilor promovează supraviețuirea neuronilor colinergici septali după secțiunile fimbriale. J. Neurosci. 6, 2155–2162 (1986).

11. Iulia, MF & Cuello, AC Disfuncția metabolică a factorului de creștere a nervilor în boala Alzheimer și sindromul Down. Trends Pharmacol. Sci. 35, 338–348 (2014).

12. Bartus, RT, Dean, RL3rd., Beer, B. & Lippa, AS Ipoteza colinergică a disfuncției memoriei geriatrice. Science 217, 408–414 (1982).

13. Aghourian, M. et al. Cuantificarea denervației colinergice a creierului în boala Alzheimer folosind imagistica PET cu [(18)F]-FEOBV. Mol. Psihiatrie 22, 1531–1538 (2017).

14. Hu, L., Wong, TP, Cote, SL, Bell, KF și Cuello, AC Impactul plăcilor Abeta asupra butoanelor presinaptice colinergice corticale și non-colinergice la șoarecii transgenici asemănător bolii Alzheimer. Neuroscience 121, 421–432 (2003).

15. Case, MA, Wong, TP, De Koninck, Y., Ribeiro-da-Silva, A. & Cuello, AC Îmbătrânirea determină o pierdere preferențială a inervației colinergice a neuronilor piramidali neocorticali caracterizați. Cereb. Cortex 12, 329–337 (2002).

16. Capponi, S. et al. Neurodegenerare asemănătoare Alzheimer la șoarecii transgenici în vârstă de factor de creștere anti-nerv. Proc. Natl Acad. Sci. SUA 97, 6826–6831 (2000).

17. Pentz, R., Iulia, MF, Ducatenzeiler, A., Bennett, DA & Cuello, AC Calea metabolică a NGF a creierului uman este afectată în continuum-ul preclinic și clinic al bolii Alzheimer. Mol. Psihiatrie, 0797-2 (2020).

18. Nilsson, OG și colab. Tulburări de învățare spațială la șobolani cu imunoziune selectivă a sistemului colinergic al creierului anterior. Neuroreport 3, 1005–1008 (1992).

19. Gage, FH & Bjorklund, A. Grefele septale colinergice în formarea hipocampului îmbunătățesc învățarea spațială și memoria la șobolanii în vârstă printr-un mecanism sensibil la atropină. J. Neurosci. 6, 2837–2847 (1986).

20. Chen, KS şi colab. Perturbarea unei singure alele a genei factorului de creștere nervoasă are ca rezultat atrofia neuronilor colinergici bazali ai creierului anterior și deficite de memorie. J. Neurosci. 17, 7288–7296 (1997).

21. Conner, JM şi colab. NGF este esențial pentru plasticitatea și învățarea hipocampului. J. Neurosci. 29, 10883–10889 (2009).

22. Takashima, Y. et al. Celulele neuroepiteliale furnizează o undă tranzitorie inițială de diferențiere a MSC. Celula 129, 1377–1388 (2007).

23. Tsai, CY, Tsai, CY, Arnold, SJ & Huang, GJ Ablația neurogenezei hipocampului la șoareci afectează răspunsul la stres în timpul ciclului întunecat. Nat. comun. 6, 8373 (2015).

24. Crowley, C. şi colab. Șoarecii care nu au factor de creștere a nervilor prezintă pierderea perinatală a neuronilor senzoriali și simpatici, totuși dezvoltă neuroni colinergici bazali ai creierului anterior. Celula 76, 1001–1011 (1994).

25. Kwon, EJ, Skalak, M., Lo Bu, R. & Bhatia, SN Nanoparticule țintite pe neuroni pentru livrarea siRNA la leziuni traumatice ale creierului. ACS Nano. 10, 7926–7933 (2016).

26. da Silva, JT, Evangelista, BG, Veneto, RAG, Seminowicz, DA & Chacur, M. Tratamentul anti-NGF poate reduce durerea neuropatică cronică prin modificarea mediatorilor periferici și a activității creierului la șobolani. Comportament. Pharmacol. 30, 79–88 (2019).

27. Huang, GJ şi colab. Migrarea celulelor cerebeloase ectopice determină dezvoltarea incorectă a celulelor Purkinje și un comportament motor anormal la șoarecii Cxcr4 nul. PLoS ONE 9, e86471 (2014).

28. Frielingsdorf, H., Simpson, DR, Thal, LJ și Pizzo, DP Factorul de creștere a nervilor promovează supraviețuirea noilor neuroni în hipocampul adult. Neurobiol. Dis. 26, 47–55 (2007).

29. Cameron, HA & Gould, E. Nurogeneza adulților este reglată de steroizii suprarenalieni din girusul dentat. Neuroscience 61, 203–209 (1994).

30. Bloem, B. şi colab. Harta topografică între neuronii colinergici bazali ai creierului anterior și cortexul prefrontal medial la șoareci. J. Neurosci. 34, 16234–16246 (2014).

31. Nyakas, C., Luiten, PG, Spencer, DG & Traber, J. Modele detaliate de proiecție ale benzilor septale și diagonale aferente hipocampului la șobolan, cu accent pe inervația CA1 și a girului dentat. Brain Res. Taur. 18, 533–545 (1987).

32. Palacios, G., Garcia-Ladona, J. & Codina, M. Studiu ultrastructural al neuronilor colinergici în nucleul septal medial și membrul vertical al benzii diagonale a lui Broca în creierul bazal al șobolanului. J. Chem. Neuroanat. 4, 205–221 (1991).

33. Martinovich, K. și colab. Rolurile p75(NTR), depresia pe termen lung și transmiterea colinergică în anxietatea și stresul acut. Biol. Psihiatrie 71, 75–83 (2012).

34. Bliss, TV & Collingridge, GL Un model sinaptic al memoriei: potențarea pe termen lung în hipocamp. Nature 361, 31–39 (1993).

35. Berger-Sweeney, J. et al. Imunoleziuni selective ale neuronilor colinergici la șoareci: efecte asupra neuroanatomiei, neurochimiei și comportamentului. J. Neurosci. 21, 8164–8173 (2001).

36. Pelleymounter, MA, Cullen, MJ, Baker, MB, Gollub, M. și Wellman, C. Efectele BDNF și NGF intrahipocampale asupra învățării spațiale la șobolanii Long Evans în vârstă. Mol. Chim. neuropathol. 29, 211–226 (1996).

37. Muller, M. şi colab. Pierderea semnalizării NGF-TrkA din SNC nu este suficientă pentru a induce tulburări cognitive la șoarecii adulți tineri sau de vârstă medie. J. Neurosci. 32, 14885–14898 (2012).

38. Fischer, W. şi colab. Ameliorarea atrofiei neuronilor colinergici și afectarea memoriei spațiale la șobolanii în vârstă prin factorul de creștere a nervilor. Nature 329, 65–68 (1987).

39. Degroot, A. & Treit, D. Sistemele colinergice hipocampale dorsale și ventrale modulează anxietatea în testele plus-labirint și șoc-sondă. Brain Res. 949, 60–70 (2002).

40. File, SE, Gonzalez, LE & Andrews, N. Acetilcolina endogenă în hipocampul dorsal reduce anxietatea prin acțiuni asupra receptorilor nicotinici și muscarinici1. Comportament. Neurosci. 112, 352–359 (1998).

41. McHugh, SB și colab. Depleția hipocampului de acetilcolină nu are niciun efect asupra anxietății, preferinței de noutate spațială sau recompensei diferențiale pentru ratele scăzute de performanță de răspuns (DRL) la șobolani. Comportament. Neurosci. 129, 491–501 (2015).

42. Dunbar, GL, Rylett, RJ, Schmidt, BM, Sinclair, RC & Williams, LR Activitatea acetiltransferazei colină hipocampală se corelează cu învățarea spațială la șobolanii în vârstă. Brain Res. 604, 266–272 (1993).

43. Gil-Bea, FJ et al. Hipofuncția colinergică afectează achiziția memoriei, posibil prin arcul hipocampului și reglarea BDNF. Hipocampus 21, 999–1009 (2011).

44. Fletcher, BR, Baxter, MG, Guzowski, JF, Shapiro, ML & Rapp, PR Epuizarea colinergică selectivă a hipocampului scutește atât transcripția Arc indusă comportamental, cât și învățarea și memoria spațială. Hipocampus 17, 227–234 (2007).

45. Baxter, MG & Gallagher, M. Învățare spațială intactă la șobolanii tineri și în vârstă, după îndepărtarea selectivă a aportului colinergic din hipocamp. Comportament. Neurosci. 110, 460–467 (1996).

46. ​​Phillips, HS și colab. Salvarea șoarecilor cu deficit de NGF II: proiecțiile colinergice bazale ale creierului anterior necesită NGF pentru inervația țintă, dar nu și ghidare. Brain Res. Mol. Brain Res. 124, 1–11 (2004).

47. Rafifii, MS et al. Vector viral adeno-asociat (Serotip 2) - factor de creștere a nervilor pentru pacienții cu boala Alzheimer: un studiu clinic randomizat. JAMA Neurol. 75, 834–841 (2018).

48. Castle, MJ et al. Analiza post-mortem într-un studiu clinic al terapiei genice AAV2-NGF pentru boala Alzheimer identifică necesitatea unei eliberări îmbunătățite a vectorului. Zumzet. Gene Ther. 31, 415–422 (2020).