Inducerea imunității antrenate periferice în pancreas incită activitatea antitumorală pentru a controla progresia cancerului pancreatic Partea 2

Discuţie

În timp ce traficul de -glucan a fost caracterizat anterior, tropismul specific al -glucanului către pancreas nu a fost raportat anterior37. Arătăm că particulele de glucan pot circula direct în pancreas și pot fi, de asemenea, fagocitate de macrofage care apoi circulă în pancreas. Relația dintre cavitatea peritoneală și pancreas nu a fost bine definită, iar studiile referitoare la patofiziologia pancreatitei acute (PA) au identificat că macrofagele peritoneale contribuie principal la răspunsul inflamator în AP, susținând astfel o conexiune între peritoneu. iar pancreasul38.

Datele noastre imagistice arată într-adevăr că macrofagele peritoneale care fagocitează WGP marcat cu izotopi circulă în principal către pancreas. Studiile asupra leziunilor hepatice au susținut și mai mult acest model de schimb dinamic de celule între cavitatea peritoneală și organele solide, care este independent de circulație 39. Împreună, acest lucru sugerează că chiar și în condiții homeostatice există un nivel bazal de schimb de celule imune între pancreas. si cavitatea peritoneala care poate fi exploatata in stabilirea particulelor de -glucan.

Macrofagele sunt o parte importantă a sistemului imunitar înnăscut al corpului uman și au funcții puternice de identificare, fagocitare și îndepărtare a bacteriilor și a substanțelor străine. Parodontita, o boală infecțioasă cronică caracterizată prin inflamație gingivală și pierderea osoasă alveolară, este cauza principală a pierderii dinților la adulți. Acum este clar că distrugerea tisulară a parodontitei este cauzată de răspunsul imun al gazdei la infecție, iar macrofagele, ca parte importantă a răspunsului imun al gazdei, joacă un rol important în apariția și dezvoltarea inflamației.

Prin urmare, trebuie să îmbunătățim imunitatea în viața noastră de zi cu zi. În cercetările noastre, am descoperit că Cistanche poate crește imunitatea. Adăugarea de Cistanche în apă clocotită pentru a face ceaiul Cistanche și consumul acestuia de 1-2 ori pe zi poate îmbunătăți funcția imunitară a organismului, deoarece conține ingrediente active, cum ar fi polizaharide, flavonoide, alcaloizi etc., care pot îmbunătăți funcția imună a organismului. În același timp, adăugarea de Cistanche în supă sau terci, o dată sau de două ori pe săptămână, poate crește imunitatea.

Faceți clic pentru a afla produsul pur cistanche

În timp ce acest studiu a investigat particulele -glucan WGP, poate fi, de asemenea, interesant să se investigheze dacă -glucanul solubil derivat din drojdie prezintă un tropism și un mecanism de semnalizare similar în pancreas. Se știe că particulele de -glucani semnalează direct prin Dectin-1, în timp ce se crede că -glucanii solubili funcționează printr-o cale dependentă de CR3-pentru a-și exercita proprietățile antitumorale40,41. Un studiu a arătat că administrarea IP de -glucan solubil a dus la traficul către sângele periferic și APC-uri în peritoneu, splină și măduvă osoasă, indicând faptul că, în ciuda mecanismelor diferite de semnalizare moleculară, poate fi posibilă o capacitate similară de a activa imunitatea antrenată42. Cu toate acestea, având în vedere că datele noastre indică faptul că acest trafic este dependent de Dectin-1, numai glucanul sub formă de particule poate prezenta trafic direct către pancreas, atât prin particule, cât și prin solubil, poate iniția mecanisme de imunitate antrenată.

Mai mult, studiile anterioare care caracterizează traficul de glucan solubil injectat intravenos arată traficul către splină, rinichi și ficat, deși nu menționează tropismul la pancreas43. Deoarece pancreasul nu a fost considerat anterior a fi o țintă a traficului de glucani, nu este clar dacă pancreasul pur și simplu nu a fost niciodată studiat sau dacă traficul pancreatic nu are loc.

Studiile viitoare ar trebui să abordeze biodistribuția atât a glucanului solubil, cât și a particulelor pe diferite căi de administrare.

-Traficul de glucan către pancreas are un impact multifactorial asupra populațiilor imune prezente în pancreas. În primul rând, sosirea glucanului în pancreas are un impact direct asupra populațiilor de macrofage rezidente M2 imunosupresoare prezente în pancreas, despre care se știe că sunt importante în promovarea tumorilor pancreatice. Datele CyTOF și scRNA-Seq au arătat o dispariție aproape completă a populației de macrofage rezidente la 7 zile după administrarea WGP. În mod interesant, dispariția populației de macrofage rezidente coincide direct cu apariția reciprocă a unei populații de macrofage Ly6Clo. Această populație de macrofage Ly6Clo poartă markeri fenotipici similari cu populația rezidentă, deși se înclină mai mult spre un fenotip M1.

Astfel, este probabil ca macrofagele rezidente să vină în contact cu -glucanul care a ajuns în pancreas și aceste celule să devină repolarizate, luând, prin urmare, un fenotip celular diferit, care are ca rezultat formarea unui grup unic. În al doilea rând, sosirea -glucanului în pancreas are ca rezultat o semnalizare amplificată a receptorului de chemokine/chemokine care recrutează Ly6CHi proinflamatorii care infiltrează macrofage derivate din monocite de la periferie către pancreas. La douăzeci și patru de ore după administrarea WGP, nivelurile de CCL2 din lizatele pancreatice întregi sunt crescute de 30-ori. În consecință, arătăm că influxul celular robust dependent de glucan către pancreas este dependent de CCR2.

În timp ce ne concentrăm asupra dinamicii compartimentului mieloid datorită importanței observate a semnalizării CCR2/CCL2, a existat o îmbunătățire inițială interesantă a clusterului 11 în ziua 3 și apoi dispariția în ziua 7 după tratamentul WGP. Clusterul 11 ​​a fost caracterizat ca ILC2 pe baza expresiei mai multor markeri, cum ar fi KLRG1, IL-5, IL-13 și ICOS. ILC2 sunt cunoscute a fi celule rezidente pe termen lung în țesut44. Studii recente au arătat că activarea ILC2 locale de către alarmine specifice țesuturilor induce proliferarea acestora, migrarea ganglionilor limfatici și diseminarea sângelui. S-a demonstrat că ILC2 din mai multe țesuturi, cum ar fi intestinul și plămânul, pătrund în sânge prin extrudare din aceste țesuturi perturbate și migrează în alte țesuturi, cum ar fi ficatul44-46.

Un astfel de mecanism ar putea explica creșterea inițială și apoi dispariția ILC2 în pancreas. Având în vedere că ILC2 au fost recent implicați în răspunsul tumorilor pancreatice la imunoterapie47, se justifică mai multe cercetări care investighează impactul WGP și inițierea imunității antrenate asupra populației ILC2 a pancreasului.

Deși inițierea unui aflux de celule imune proinflamatorii către pancreas este în sine importantă, populațiile de macrofage derivate din monocite care infiltrează CCR2 plus Ly6CHi de la periferie prezintă caracteristici ale imunității antrenate care poartă cele mai importante implicații ca inducerea imunitatea antrenată periferică în pancreas nu a fost încă caracterizată. Această imunitate antrenată indusă este, de asemenea, asociată cu reprogramarea metabolică și epigenetică.

În timp ce CCR2 este cunoscut a fi un receptor important în recrutarea monocitelor, acesta este, de asemenea, primul indiciu că semnalizarea CCR2 pe monocite este necesară pentru stabilirea imunității antrenate periferice. Se remarcă faptul că CCR2 plus monocitele/macrofagele au fost legate de metastaza și progresia tumorii48,49. Cu toate acestea, datele noastre sugerează că recrutarea de CCR2 reprogramate și antrenate plus monocite/macrofage exercită efecte anti-tumorale robuste.

Acest lucru este demonstrat direct de experimentul nostru de amestec, în care șoarecii care au primit CCR2 plus celule mieloide de la șoareci antrenați cu WGP au prezentat o sarcină tumorală semnificativ redusă în comparație cu șoarecii care au primit celule mieloide CCR2- de la același șoarece antrenat.

Pe măsură ce arătăm că imunitatea antrenată periferică a fost stabilită în pancreas, ne întrebăm dacă aceste celule ar putea fi reactivate de celulele tumorale sau de factorii lor secretați. S-a demonstrat că reexpunerea in vivo a celulelor mieloide pancreatice antrenate cu WGP la medii condiționate de tumoră determină viguros un răspuns antrenat. Kalafati și colab. a arătat recent un rol al granulocitelor în mecanismele antitumorale antrenate de imunitate21, cu toate acestea, având în vedere utilizarea modelelor subcutanate de cancer, studiul raportat în prezent este prima instanță care sugerează că celulele mieloide dintr-un anumit organ pot fi antrenate să reacționeze direct la celulele tumorale ale aceluiași organ.

A fost bine stabilit că celulele mieloide sunt capabile să ucidă direct celulele tumorale prin mecanisme de fagocitoză și producție de ROS50–54, iar aici arătăm că antrenamentul WGP reglează semnificativ funcționalitățile directe anti-tumorale ale fagocitozei îmbunătățite a celulelor tumorale și citotoxicitatea mediată de ROS la celule tumorale.

În plus, în timp ce subliniem că mediile condiționate de tumoră pot reactiva celulele mieloide antrenate, identificăm, de asemenea, un factor specific, MIF, în mediile condiționate de tumoră care este implicat în această activare. Aceste date sugerează că inducerea imunității antrenate ar putea participa la mecanismele de imunosupraveghere tumorală. De exemplu, în stadiile incipiente ale dezvoltării tumorii, tumorile secretă factori solubili care pot re-stimula celulele înnăscute antrenate, ducând la eradicarea acestor celule tumorale.

Apoi traducem această înțelegere a potențialului anti-tumoral al celulelor mieloide înnăscute antrenate care intră în pancreas în modele ortotopice ale PDAC, unde observăm o scădere dramatică a sarcinii tumorale și o creștere a supraviețuirii șoarecilor, în cazul în care o singură administrare de WGP. Demonstrăm în continuare că celulele responsabile pentru controlul tumorii sunt în principal antrenate CCR2 plus celule derivate din mieloid. Spre deosebire de alte modele propuse de control al tumorii, care par a fi conduse în întregime de inducerea imunității antrenate central în BM21, în schimb, în ​​acest model, traficul timpuriu de WGP către pancreas și producția rezultată de CCL2 în recruții formați din pancreas. CCR2 plus celule mieloide de la periferie care sunt în principal responsabile pentru efectele antitumorale. Traficul direct de WGP către pancreas repolarizează, de asemenea, macrofagele rezidente în țesuturi M{2-înspre macrofage M1-care pot, de asemenea, împiedica progresia tumorii.

În timp ce reducerea tumorii observată la șoarecii implantați cu tumori KPC care au fost amestecate cu CCR2 plus celule antrenate a fost semnificativă, nu a fost la fel de izbitoare ca la șoarecii cărora li sa administrat IP WGP. Acest lucru susține că efectele antitumorale ale IP WGP sunt duble; recrutarea de CCR2 plus celule mieloide anti-tumorale antrenate în pancreas și repolarizarea macrofagelor rezidente pro-tumorigenice lucrează în mod concertat pentru a provoca răspunsuri înnăscute anti-tumorale care conduc la o sarcină tumorală redusă în modelele de PDAC.

Remarcăm, de asemenea, expresia ridicată a MHCII pe aceste monocite/macrofage antrenate, care joacă probabil un rol în procesarea antigenului tumoral și comunicarea cu celulele T pentru a declanșa răspunsuri imune adaptative împotriva tumorii. Interesant, deși am confirmat că aceste mecanisme antitumorale nu depind de răspunsurile imune adaptative, am observat o creștere semnificativă a celulelor CD8 plus T prezente în tumorile CCR2 plus amestecate. În plus, având în vedere că s-a observat că celulele mieloide din tumori prezintă niveluri ridicate de PD-L1 și că prezența celulelor CCR2 plus antrenate în pancreas părea să recruteze celule CD8 plus T, ne-am gândit că WGP poate potența efectele anti. -terapie PD-L1.

Potrivit literaturii de specialitate, terapia mAb anti-PD-L1 singură nu a avut nici un beneficiu de supraviețuire, în timp ce combinația de WGP și anti-PD-L1 a avut sinergie pentru a produce rezultate de supraviețuire mai bune decât numai WGP55. Acest lucru sugerează că celulele imune înnăscute antrenate pot activa celulele imune adaptative în TME, cu toate acestea, micromediul imunosupresor probabil trebuie să fie depășit în continuare de efectele concomitente ale anti-PD-L1. Este important, în ciuda supraviețuirii îmbunătățite, toți șoarecii au cedat în cele din urmă în fața tumorii, astfel încât investigațiile viitoare privind optimizarea acestui tratament în ceea ce privește dozarea și numărul de tratamente sunt justificate.

Celulele mieloide imunosupresoare joacă un rol critic în crearea TME imunosupresoare în PDAC. Aici, demonstrăm capacitatea de a angaja aceste celule mieloide în cadrul PDAC prin inducerea imunității înnăscute antrenate în pancreas.

Este important, de asemenea, arătăm că capacitatea de a iniția imunitatea antrenată în pancreas potențează efectele terapeutice ale imunoterapiei, cum ar fi terapia de blocare imuno-checkpoint anti-PD-L1. Dând o aplicabilitate clinică suplimentară acestor constatări, arătăm, de asemenea, că inducerea imunității antrenate în cadrul adjuvantului poate scădea dimensiunea tumorii și poate prelungi supraviețuirea. Aceste descoperiri subliniază potențialul utilizării -glucanului pentru a viza în mod terapeutic celulele mieloide din TME și evidențiază faptul că inducerea imunității antrenate periferice în pancreas ar putea juca un rol important în reprogramarea TME supresoare a PDAC, ceea ce ar putea duce la prelungirea vieții pacienților. diagnosticat cu această malignitate mortală.

Metode

Declarație etică.

Toate experimentele care au implicat animale au fost efectuate conform ghidurilor etice stabilite de Comitetul Instituțional pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de la Universitatea din Louisville. Experimentele au fost efectuate conform protocoalelor aprobate 19471 și 19536.

Șoareci.

În toate experimentele au fost utilizați șoareci masculi și femele în vârstă de șase până la opt săptămâni. Șoarecii C57BL/6 J de tip sălbatic (WT) au fost achiziționați de la Laboratorul Jackson (Bar Harbor, ME, SUA) sau crescuți în unitatea de animale fără agenți patogeni specifici (SPF) de la Universitatea din Louisville. Șoarecii C57BL/6 Dectin-1 knockout (Dectin{-1-/-) au fost descriși anterior56. Șoarecii global knockout CCR2 au fost achiziționați de la Jackson Laboratory. Șoarecii Albino C57BL/6 au fost cu amabilitate furnizați de Dr. Jonathan Warawa de la Universitatea din Louisville. Șoarecii NOD/SCID/IL2r Null (NSG) au fost achiziționați de la Laboratorul Jackson. Dimensiunea maximă a tumorii permisă de IUCAC nu a fost mai mare de 2000 mm3. Șoarecii au fost monitorizați zilnic pentru creșterea tumorii și eutanasiați atunci când sarcina tumorală a depășit dimensiunea limitată. Șoarecii au fost menținuți într-un ciclu întuneric/luminos de 12-h la temperatura camerei cu umiditate controlată (aproximativ 55 la sută).

Toate animalele au fost găzduite într-o unitate de barieră și numai șoareci sănătoși au fost folosiți pentru experimente. Toți șoarecii aveau vârsta de cel puțin 6 săptămâni la noi, iar toate experimentele care implică animale au fost efectuate în conformitate cu toate legile relevante și ghidurile instituționale furnizate de Centrul de creștere a rozătoarelor (RRF) și aprobate de Comitetul instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor (IACUC) de la Universitatea din Louisville.

Prepararea -glucanului.

Glucan sub formă de particule înalt purificate sub formă de particule întregi de glucan (WGP) izolate din Saccharomyces cerevisiae a fost furnizat de Biothera. Înainte de utilizare, WGP a fost supus ușor cu ultrasunete timp de 15 s, de două ori folosind un sonicator Qsonica Q55-110 Q55 (Cole-Parmer) pentru a se asigura că agregatele au fost sparte.

Pregătirea și utilizarea DTAF-WGP.

DTAF (Sigma-Aldrich) la 2 mg/mL a fost amestecat cu o suspensie de 20 mg/mL WGP în tampon borat (pH 10,8). Acesta a fost incubat la temperatura camerei timp de 8 ore cu amestecare continuă. După incubare, WGP a fost centrifugat și spălat cu DPBS steril fără endotoxină (Sigma-Aldrich) de cinci ori sau până când supernatantul nu mai conține DTAF vizibil. Concentrația a fost ajustată la 10 mg/mL în DPBS fără endotoxină pentru depozitare. Aproximativ 1 mg de DTAF-WGP a injectat IP în C57BL/6, iar șoarecii și organele Dectin-1-/- au fost recoltate 3 zile mai târziu.

Pregătirea 89Zr-WGP.

WGP (1{3}}0 mg) a fost amestecat cu DeferoxaminăSCN (2,7 mg, în 0,8 ml DMSO) și suspendat în 10 ml tampon carbonat de sodiu (0,1 M, pH 9,4) peste noapte la temperatura camerei în întuneric cu agitare ușoară. WGP marcat cu deferoxamină a fost apoi spălat cu apă DI (10 × 40 mL) și 30 mg de WGP marcat cu deferoxamină au fost amestecați cu 3 mCi de oxalat 89Zr în 2 ml tampon Tris•HCl (0,5 M, pH 7,5) și apoi incubat la 37 oC timp de 60 min cu agitare. 89Zr-WGP a fost apoi centrifugat şi spălat cu 3 ml de PBS steril. Radioactivitatea 89Zr-WGP a fost măsurată cu un calibrator de doză și utilizată pentru studii in vitro și in vivo.

Biodistribuție și scanare PET/CT folosind 89Zr-WGP.

Imagistica tomografie cu emisie de pozitroni (PET)/tomografie computerizată (CT) a fost efectuată la șoareci C57BL/6 și Dectin-1−/− la 48 de ore după injectarea IP a 1 mg de 89Zr-WGP pur sau injectarea a 1 × 106 peritoneal macrofage care au fost co-cultivate cu 25 ug/ml de 89Zr-WGP timp de 2 ore și apoi spălate ușor pentru a îndepărta excesul de 89Zr-WGP. Șoarecii au fost scanați timp de 15 minute cu un Siemens R4 MicroPET urmat de 10 minute de scanare CT. Software-ul Siemens IAW a fost folosit pentru achiziția și reconstrucția semnalului PET, iar software-ul Siemens IRW a fost folosit pentru îmbinarea și analiza datelor de imagistică.

La sfârșitul studiului imagistic, șoarecii au fost eutanasiați și organele de interes au fost recoltate. Pentru biodistribuție, s-au recoltat 50 uL de sânge periferic folosind o tehnică de sângerare retro-bulbară. Au fost recoltate, cântărite și plasate într-un 2470 Contor gamma automat Wizard (PerkinElmer) pentru a măsura radioactivitatea fiecărui țesut. Valorile CPM au fost calculate folosind software-ul Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Procesarea pancreatică.

După eutanasia, pancreasul de șoarece a fost recoltat și tăiat ușor în bucăți mai mici folosind foarfece sterile. Acestea au fost suspendate într-un tub de 15 ml în mediu complet (RPMI) cu tampon de digestie 1X compus din 300 U/ml colagenază I, 60 U/ml hialuronidază și 80 U/ml DNază (Sigma). Acestea au fost plasate într-un incubator rotativ la 37 de grade cu 5% CO2 timp de 15-20 de minute. Tamponul de digestie a fost apoi stins cu RPMI 1640 complet răcit cu gheaţa şi spălat. Celulele au fost trecute printr-un filtru coș de nailon steril de 40 um și bucăți mici de țesut nedigerate au fost zdrobite folosind un dop de seringă steril pentru a genera o suspensie unicelulară. Dacă s-a observat că există un număr apreciabil de globule roșii (RBC) în probă, liza RBC a fost efectuată prin adăugarea a 2 mL de ACK 10x steril (Thermo Fisher Scientific).

Administrare WGP in vivo.

Șoarecilor li s-a administrat o singură doză intraperitoneală de 1 mg de WGP sonicat ușor, granule de polistiren de 3 μm (Sigma-Aldrich) sau microsfere fluorescente de 3 μm (Polysciences) (toate 1 mg în 200 ul de PBS steril) sau 200 ul de PBS steril în ziua 0. Pentru studiile de imunitate instruite în mod obișnuit, la 7 zile după doza IP inițială, șoarecii au fost eutanasiați folosind CO2 și pancreasul împreună cu alte țesuturi de interes a fost îndepărtat și procesat. Pentru studiile de titrare a dozei, 0,5, 1 și 2 mg de WGP au fost administrate IP în 200 uL de PBS steril. Pentru studiile de titrare în timp, șoarecii au fost injectați cu 1 mg de WGP, iar pancreasul a fost recoltat după 24 de ore, 48 de ore, 3, 7, 10, 16 și 30 de zile mai târziu.

Restimulare ex vivo.

Pentru a evalua fenotipul antrenat al celulelor mononucleare la șoarecii tratați cu WGP sau PBS ex vivo, după procesarea pancreasului, suspensiile de celule pancreatice au fost placate în plăci cu 24 de godeuri și stimulate cu LPS (10 ng/ml), supernatantul din KPC cultivat și Pan02. celule (40 la sută) și MIF recombinant (rMIF) (10 ng/ml). MIF a fost un cadou generos de la Dr. Robert Mitchell de la Universitatea din Louisville și a fost un aliat procariotic exprimat, purificat și repliat așa cum a fost descris anterior57. Celulele au fost cultivate în DMEM și incubate la 37 de grade cu 5% CO2 timp de 5-6 ore în prezența 1X brefeldin A (BioLegend). Celulele au fost apoi recoltate folosind o racletă celulară, spălate, granulate și apoi colorate pentru exprimarea intracelulară a citokinei.

Test de antrenament și restimulare in vitro.

Macrofagele peritoneale sau celulele CD11b plus sortate de la un pancreas de șoarece au fost placate într-o placă de 24-godeuri timp de 2 ore la 37 de grade și 5% CO2 pentru a permite atașarea celulelor la plăci, după care celulele plutitoare au fost ușor. aspirat. Celulele atașate au fost spălate ușor cu PBS steril și apoi resuspendate în 1 ml de DMEM constituit din 10% FBS și 1% penicilină/streptomicină.

Pentru antrenamentul inițial al celulelor, 25 ug/ml de particule WGP, 25 ug/ml de microparticule de polistiren de 3 μm (Sigma-Aldrich) sau 100 uL de PBS au fost adăugate în godeul corespunzător și incubate timp de 24 de ore. După 24 de ore, godeurile au fost spălate ușor pentru a îndepărta stimulul inițial și a fost adăugat DMEM proaspăt și celulele au fost incubate cu 5% CO2 la 37 de grade timp de 7 zile. După 7 zile, mediul a fost aspirat și înlocuit cu mediu proaspăt, iar celulele au fost restimulate cu LPS (100 ng/mL), supernatantul celulelor KPC sau Pan02 (40 la sută) sau PBS ca martor. La douăzeci și patru de ore după stimulare, supernatanții au fost recoltați și utilizați într-un ELISA pentru TNF- și IL-6.

Medii condiționate de tumori.

Aproximativ 1 × 106 celule KPC sau Pan02 au fost cultivate într-o placă cu șase godeuri în 4 ml de DMEM complet la 37 de grade și 5% CO2. După 3 zile, supernatanții au fost recoltați și depozitați la -80 de grade în părți alicote pentru utilizare ca mediu condiționat de tumoră. Ca control, pancreasul unui șoarece C57BL/6 a fost procesat într-o singură suspensie celulară și 1 × 106 dintre aceste celule au fost cultivate într-o placă cu șase godeuri în 4 ml de DMEM complet și la 37 de grade și 5 procente de CO2 și supernatanții au fost de asemenea colectați după 3 zile. Ca martor, pancreasul șoarecilor naivi a fost procesat într-o suspensie unicelulară și placat pe o placă cu șase godeuri timp de 1 zi. Celulele neaderente au fost spălate și aceste celule au fost apoi cultivate timp de 3 zile și supernatantul a fost recoltat.

Achiziția macrofagelor peritoneale.

Șoarecii au fost eutanasiați și 5 ml de RPMI steril au fost injectați în peritoneu folosind o seringă 25-gauge. Abdomenul a fost masat pentru a elibera macrofagele peritoneale. S-a făcut o mică incizie și s-a folosit o pipetă de transfer pentru a îndepărta suspensia. Cavitatea peritoneală a fost apoi spălată de mai multe ori cu RPMI rece și celulele au fost granulate la 458 × g.

Citometrie în flux.

Suspensiile unicelulare în PBS cu 1% FBS au fost blocate cu bloc Fc murin (anti-CD16/CD32) la 4 grade timp de 15 min. Anticorpii marcați cu fluorocrom pentru viabilitate (APC/Cy7) și pentru markerii de suprafață CD45, CD11b, F4/80, Ly6G, Ly6C, MHCII, CD3, CD4, CD8, NK1.1, Ki67 (Biolegend) și CCR2 (R&D Systems) au fost folosit. Informațiile referitoare la toate Abs de flux sunt rezumate în Tabelul suplimentar 3. După 30 de minute de incubare în întuneric la 4 grade, celulele au fost spălate cu PBS rece și filtrate printr-un filtru cu ochiuri de 40 µm. Probele au fost achiziționate folosind un citometru FACSCanto II (BD Biosciences) și analizate folosind software-ul FlowJo (Tree Star, Ashland, OR). Versiunea 6 a software-ului FACSDiva a fost utilizată în FACSCanto pentru a achiziționa toate datele.

colorarea intracelulară pentru expresia citokinelor.

După stimulare, celulele au fost colorate pentru markerii de suprafață doriti, așa cum este descris mai sus. Celulele au fost apoi spălate cu PBS rece și 500 ul de tampon de fixare (Biolegend) au fost adăugate în tuburi, agitate pentru scurt timp și incubate la întuneric la temperatura camerei timp de 20 de minute. Aproximativ 1 ml de tampon de permeabilizare (Biolegend) a fost apoi adăugat și probele au fost centrifugate la 458 × g timp de 5 minute la 4 grade urmate de încă o spălare folosind 1 ml de tampon de permeabilizare. Celulele au fost resuspendate în 200 ul de tampon de permeabilizare și celulele au fost colorate cu anticorpi împotriva TNF-, Ki67, Granzyme-B, IL12, IL-6 și IFN sau controlul izotipului respectiv peste noapte la 4 grade. Celulele au fost apoi spălate, filtrate și datele au fost obținute folosind un citometru de flux.

Izolarea FACS a CD11b plus macrofage pentru antrenament in vitro.

Pancreasul a fost procesat într-o suspensie unicelulară așa cum este descris mai sus. Celulele au fost spălate cu 1 mL de PBS și incubate cu bloc Fc timp de 10 minute la 4 grade, urmată de colorare cu colorant de viabilitate (APC-Cy7), CD45 (PerCPcy5) și CD11b plus (APC) timp de 30 de minute la 4 grade. Celulele au fost spălate cu PBS și resuspendate în tampon de rulare MACS rece (Miltenyi Biotech). ViabilitateCD45 plus CD11b plus celulele au fost sortate folosind un FACS Aria III (BD Biosciences). Celulele au fost colectate în 50% FBS, 40% PBS și 10% HEPES (Corning). După sortare, celulele au fost spălate cu PBS și apoi placate pentru antrenament in vitro, așa cum este descris mai sus.

ELISA.

Supernatanții din celulele antrenate in vitro împreună cu standardele au fost analizați folosind kituri ELISA de TNF- și IL-6 murin (BioLegend). Testul a fost efectuat conform instrucțiunilor producătorului și toate condițiile au fost efectuate în trei exemplare. Un kit ELISA pentru rMIF (sisteme R și D) a fost, de asemenea, utilizat conform instrucțiunilor producătorului pentru a cuantifica rMIF în medii condiționate de tumori Pan02 și KPC și supernatantul din celulele pancreatice cultivate netratate. Pentru a cuantifica modificările histonelor, trusele ELISA (kit de cuantificare Tri-metil histonă H3K4, kit de cuantificare acetil-histone H3K27, kit de cuantificare Tri-metil histonă H3K27 și kit de cuantificare total histonă H3) au fost achiziționate de la EpiGentek și testele au fost efectuate pe baza producătorului. instrucțiuni. Lactatul a fost măsurat prin Kitul I de analiză L-Lactate (Eton Bioscience).

Analiza Western blot.

Celulele CD11b plus de la șoareci injectați cu PBS sau WGP (24 ore) au fost separate folosind microbile CD11b (Miltenyi Biotech). Histona a fost extrasă conform instrucțiunilor producătorului (Active Motif, Inc.), iar concentrația de proteine ​​a fost determinată folosind cuantificarea Bradford. Proteinele histonelor au fost separate prin geluri SDS-PAGE 15% Tris-HCl și transferate pe membrane PVDF (Millipore). Membrana a fost blocată cu 5% BSA la temperatura camerei timp de 1 oră și incubată peste noapte la 4 grade cu anticorpi primari incluzând mAb de iepure tri-metil-histone H3 (lys4), acetil-histonă H3 (lys27) XP mAb de iepure, tri-metil -mAb de iepure histonă H3 (Lys27) și mAb de iepure histonă H3 XP (tehnologie de semnalizare celulară), apoi incubate cu anticorpi secundari conjugați cu HRP (GE Healthcare) la temperatura camerei timp de 1 oră. Membrana a fost dezvoltată cu Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare) și detectată prin procesorul medical de film (Konica Minolta Medical & Graphic). Caleidoscopul de proteine ​​Precision Plus Standardele de proteine ​​​​precolorate au fost utilizate ca marker proteic standard (Bio-Rad).

qRT-PCR.

După ce celulele CD11b plus au fost izolate din pancreasul de șoarece la șoareci tratați cu WGP și netratați, celulele au fost salvate în TRIzol. ARN-urile au fost izolate și transcrise invers utilizând amplificarea cu reactivi de transcripție inversă TaqMan (qRTPCR) folosind sistemul de detecție RT-PCR cu o singură culoare Bio-Rad MyiQ. Pe scurt, cADN-ul a fost amplificat într-un amestec de reacție de 25 uL constând din super-mix SYBR Green PCR (Bio-Rad), 100 ng de matriță ADN complementar și primeri selectați (200 nM) folosind condițiile de ciclizare recomandate.

H plus E.

La șapte zile după injectarea cu PBS/sfere de microparticule sau WGP, pancreata a fost recoltată și fixată în formol 4% timp de 1 săptămână, urmată de încorporare în parafină conform procedurilor standard. Țesuturile încorporate în parafină au fost tăiate în secțiuni groase de 5 mm și colorate cu hematoxilină și eozină (H & E) pentru analiza morfologică.

Măsurarea amilazei serice.

Amilaza serică murină a fost măsurată utilizând kitul de analiză a activității amilazei (Millipore Sigma) și a fost utilizată conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, șoarecii au fost injectați cu WGP și 7 zile mai târziu, sângele a fost colectat de la șoareci folosind o tehnică de sângerare retro-bulbară. Aceste probe au fost utilizate pentru a determina amilaza serică.

Depleția celulelor T in vivo.

Celulele T au fost epuizate utilizând un mAb anti-CD4 singur, mAb anti-CD8 singur sau mAb anti-CD4 și anti-CD8 împreună. Anticorpii au fost fabricați în casă. În această procedură de epuizare, șoarecii au injectat IP cu WGP în ziua 1 și au fost, de asemenea, injectați IP cu 200 pg de mAb în ziua 1 și ziua 4 în timpul perioadei de tratament. Șoarecii au fost eutanasiați în ziua 7. (clona CD4 GK1.5, clona CD8 53-6.72). Eficiența epuizării a fost confirmată în ziua 7.

Depleția celulelor NK in vivo.

Celulele NK au fost epuizate prin injectarea intraperitoneală a 100 ug de mAb PK136 (Produs în laboratorul Dr. Jun Yan de la Universitatea din Louisville) în zilele -1 și 5 în timpul perioadei de tratament. WGP a fost injectat în ziua 0 și în ziua 7 animalele au fost eutanasiate și eficiența de epuizare a celulelor NK a fost evaluată prin colorarea țesuturilor pancreatice pentru NK1.1.

epuizarea Ly6G.

Neutrofilele au fost epuizate prin injectarea a 300 µg de mAb anti-Ly6G (Bio X Cell) sau control izotip Rat IgG2a (Bio X Cell) în zilele -1, 2 și 6 în timpul tratamentului. Aproximativ 1 mg de WGP a fost injectat IP în ziua 1. Șoarecii au fost eutanasiați în ziua 7 și pancreasul a fost evaluat pentru eficiența epuizării. În tumoră, șoarecii model au fost injectați cu 300 ug de mAb anti-Ly6G sau IgG2a de șobolan de control izotip în zilele -2, 4, 10 și 16. Șoarecilor li s-a administrat WGP în ziua 0 și au fost implantați cu tumori pancreatice KPC ortotopice în ziua 7. Șoarecii au fost eutanasiați în ziua 21 și țesuturile pancreatice au fost colorate cu Ly6G pentru a evalua eficiența epuizării granulocitelor la acel moment.

Pregătirea probei de citometrie de masă CyTOF.

Anticorpii de citometrie de masă au fost fie achiziționați de la Fluidigm, fie au fost creați intern prin conjugarea anticorpilor purificați disponibili comercial la izotopul metalic corespunzător folosind kiturile MaxPar X8 Polymer sau MCP9 Polymer (Fluidigm). Probele de pancreas de la trei șoareci PBS și trei 7-zile WGP au fost procesate într-o soluție unicelulară și stimularea ex vivo a fost efectuată așa cum este descris mai sus. Celulele au fost răzuite ușor de pe plăci folosind o racletă pentru celule sterile, spălate cu PBS și plasate într-un tub de cultură steril. Au fost utilizate aproximativ 2 × 106 celule per probă. Celulele au fost mai întâi colorate pentru viabilitate cu cisplatină 5 uM (Fluidigm) în RPMI 1640 fără ser timp de 5 minute la RT. Celulele au fost apoi spălate cu RPMI 1640 care conține 10% FBS timp de 5 minute la 300 x g. Celulele au fost colorate cu anticorpii de suprafață timp de 30 de minute la RT și spălate de două ori cu tampon de colorare Maxpar Cell (Fluidigm).

Pentru colorarea pe citokine intracelulare, celulele au fost apoi fixate cu 1 mL de tampon 1X Maxpar Fix I timp de 30 de minute la RT și apoi spălate de două ori cu 2 mL de tampon 1X Maxpar Perm-S timp de 5 minute la 800 × g. Cocktailul de anticorpi citoplasmatici/secreți a fost apoi adăugat și incubat cu celule timp de 30 de minute la temperatura camerei. După incubare, celulele au fost spălate cu 1 mL de tampon 1X Maxpar Perm-S timp de 5 minute la 800 × g și s-au tamponat ușor pentru a îndepărta tot lichidul din tub.

Pentru a colora antigenele nucleare, celulele au fost apoi suspendate în 1 ml de tampon de colorare cu antigen nuclear 1X Maxpar timp de 30 de minute la temperatura camerei. Cocktailul de anticorpi antigen nuclear a fost apoi adăugat și incubat timp de 30 de minute la temperatura camerei. Celulele au fost spălate de două ori timp de 5 minute la 800 x g cu 2 ml de tampon de permeabilitate a colorării antigenului nuclear. În cele din urmă, celulele au fost fixate cu 1,6% formaldehidă timp de 10 minute la RT, apoi au fost incubate peste noapte în 125 nM de IntercalatorIridium (Fluidigm) la 4 grade.

Achiziția de date CyTOF.

Odată ce celulele au fost gata pentru achiziție, probele au fost spălate de două ori cu tampon de colorare celulară (Fluidigm) și ținute pe gheață în așteptarea achiziției. Imediat înainte de achiziție, celulele au fost suspendate într-o soluție 1:9 de Cell Acquisition Solution: EQ 4 element calibrare beads (Fluidigm). A fost folosit un sistem Helios CyTOF și, urmând procedurile de pornire și reglare adecvate, probele au fost rulate cu o rată mai mică sau egală cu 500 de evenimente/secundă până la 300,000 evenimente. Folosind software-ul CyTOF, fișierele FCS au fost normalizate. Fișierele FCS și aceste fișiere au fost apoi gata pentru analiza datelor.

Analiza datelor CyTOF.

Datele CyTOF au fost analizate folosind FlowJo, pachetul software CytoBank58 și fluxul de lucru CyTOF59 care include o suită de pachete disponibile în R (r-project. org)60–63. Pentru analiza efectuată în cadrul fluxului de lucru CyTOF, s-au folosit fișierele spațiului de lucru FlowJo exportate din Flow Workspace și CytoML61.

Secvențierea ARN: extracția și izolarea ARN.

La șapte zile după administrarea de PBS sau WGP IP, pancreata a fost recoltată, procesată într-o singură suspensie celulară, colorată pentru viabilitate, CD45 și CD11b și sortată folosind un FACS Aria III. Probele au fost pregătite în trei exemplare pentru fiecare grup experimental. Odată ce aceste celule mieloide au fost izolate, celulele au fost spălate de 2x cu PBS răcit cu gheață și apoi lizate cu Trizol (Invitrogen). ARN-urile au fost extrase folosind un kit QIAGEN RNAeasy (QIAGEN).

ARN-ul izolat a fost verificat pentru integritatea utilizând sistemul Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) și cuantificat folosind un test fluorometric Qubit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Bibliotecile mRNA-Seq îmbogățite cu Poly-A au fost preparate urmând protocolul standard al kit-ului Universal Plus mRNASeq (Tecan Genomics, Redwood City, CA) folosind 10 ng de ARN total.

Toate probele au fost legate cu adaptoare Illumina și codate de bare individual. Absența dimerilor adaptor și o dimensiune consecventă a bibliotecii de ~ 300 bp a fost confirmată utilizând Agilent Bioanalyzer 2100. Concentrația bibliotecii și comportamentul de secvențiere au fost evaluate cu privire la o intensificare standardizată a PhIX folosind o celulă de flux de secvențiere Nano MiSeq de la Illumina. 1,8 pm din bibliotecile grupate cu 1 procente PhiX spike-in au fost încărcate pe o celulă de flux de secvențiere NextSeq 500/550 75 cicluri High Output Kit v2 și secvențiate pe secvențatorul Illumina NextSeq 500 care vizează 60 M 1x75 bp citiri per probă.

secvențierea ARN.

Bibliotecile au fost preparate folosind kitul Universal Plus mRNA-seq cu cuantificarea bibliotecii NuQuant® (NuGen). Cele șase probe au fost răspândite pe patru linii de secvențiere într-o singură cursă. Cele 24 de fișiere de secvențiere brută single-end (.fastq)64 au fost descărcate din BaseSpace65 de la Illumina pe serverul KBRIN pentru analiză. Controlul calității (QC) al datelor brute de secvență a fost efectuat utilizând FastQC (versiunea 0.10.1)66. Secvențele au fost aliniate la genomul de referință al șoarecelui mm10 folosind STAR (versiunea 2.6)67, generând fișiere de aliniere în format bam. Expresia diferențială a transcriptelor care codifică proteina ENSEMBL a fost efectuată folosind DESeq268,69. Numărările brute au fost obținute din fișierele în format bam aliniate la STAR folosind HTSeq (versiunea 0.10.0)70. Numărările brute au fost normalizate utilizând metoda Relative Log Expression (RLE) și apoi filtrate pentru a exclude genele cu mai puțin de zece numărări în probe71. Datele ARN-seq au fost depuse cu accesarea GEO GSE187464.

Secvențierea ARN: analiza îmbogățirii setului de gene.

Analiza de îmbogățire a seturilor de gene (GSEA) a fost utilizată pentru a caracteriza în continuare biologia genelor care cuprind condițiile WGP vs PBS și diferențele lor72. Seturile de gene au fost obținute din Baza de date de semnături moleculare (MSigDB) pentru procesele biologice de Ontologie genetică (GO) și căile Reactome. Pentru fiecare set de gene, toate locațiile genelor testate în comparația șoarecilor martor tratați cu WGP și PBS au fost sortate de la cea mai mare la cea mai mică semnificație folosind valori p. Această abordare permite includerea unor gene foarte semnificative în sus și în jos în cadrul fiecărui set de gene, o abordare care reflectă mai exact condițiile dintr-o cale biologică. Pentru această analiză, un tabel cu seturile îmbogățite este urmat de un grafic de îmbogățire care afișează profilul scorului de îmbogățire (ES) și poziția membrilor setului de gene pe lista ordonată în funcție de rang.

Secvențierea cu o singură celulă: izolarea celulelor individuale și secvențierea ARN.

Celulele CD45 plus vii au fost sortate din pancreata de șoarece, spălate și resuspendate în 1x PBS (fără calciu și magneziu) care conține 0,04% BSA. Celulele unice au fost capturate și biblioteci de ADNc cu coduri de bare au fost construite utilizând kitul de reactiv Chromium Next GEM Single-Cell 3ʹ (v3.1, 10X Genomics) și controlerul Chromium, conform instrucțiunilor producătorului. Bibliotecile au fost reunite și secvențiate folosind o configurație de 28 bp × 8 bp × 125 bp pentru read1 × i7 index x read2 pe Illumina NextSeq 500 cu NextSeq 500/550 150 ciclu High Output Kit v2.5 (20024907).

De la secvențierea celulelor: profilarea expresiei genelor.

Fișierele Bcl au fost demultiplexate în fișiere fastq utilizând software-ul CellRanger (10X Genomics, v3.1.{{10}}). Numărul total de citiri secvențiate a fost de 506.913.062. Citirile au fost de bună calitate, așa cum este stabilit de FastQC66. Numărările de gene au fost măsurate utilizând „numărarea” CellRanger, utilizând genomul de referință ranger-mm10-3.0.0 pentru șoareci. A fost generată o matrice de numărare pentru fiecare probă și o probă agregată cu numărul așteptat de celule setat la 5000.

Datele brute de numărare determinate de CellRanger au fost utilizate ca intrare la o conductă de analiză personalizată în R, care utilizează o varietate de instrumente de analiză cu o singură celulă bazate pe Seurat. Graficul genunchiului (Figura suplimentară 7b) afișează un grafic care arată numărul UMI clasat pentru fiecare cod de bare de celule pentru datele agregate în cele trei grupuri. Celulele de deasupra punctului de inflexiune reprezintă posibile dublete, în timp ce cele de sub genunchi reprezintă celule de fundal. Măsurile de control al calității celulelor au fost analizate utilizând Seurat v373 și codurile de bare ale celulelor cu următoarele caracteristici au fost eliminate din analiză: număr scăzut (posibile celule de fundal) cu o limită FDR de 0.01 din funcția DropletUtils74 „emptyDrops”, număr mare (posibil celule dublete) cu mai multe numărări decât punctul de inflexiune al graficului genunchiului, conținut mitocondrial mai mare de 30 la sută și conținut ribozomal mai mare de 40 la sută. Gene (caracteristicile) au fost filtrate în continuare pentru a elimina identificatorii de gene retrași și genele care nu au fost exprimate în cel puțin două celule. Consultați Fig. 7a, b suplimentară pentru numărul inițial și filtrat de coduri de bare și gene celulare.

Datele de expresie au fost normalizate folosind SCTransform75, unde genele ciclului celular, conținutul ribozomal și conținutul mitocondrial au fost regresate. Celulele au fost apoi grupate și reducerea dimensiunilor a fost efectuată folosind UMAP76. Numele inițiale ale clusterelor au fost atribuite utilizând o tehnică de scor de îmbogățire GSVA77,78 modificată. Pentru fiecare dintre aceste grupuri, au fost identificate genele marker de top. Genele exprimate diferențial care compară fiecare cluster cu fiecare alt cluster (toate comparațiile pe perechi) au fost determinate folosind Seurat73 și MAST79. Datele scRNA-seq au fost depuse cu accesarea GEO GSE187464.

Identificarea clusterelor generate cu scRNA-Seq.

Grupurile nederivate din mieloide au fost clasificate în general ca celule B (MS4A1), celule plasmatice (SDC1), celule T CD8 plus (CD3e, C8a), celule T CD4 plus (CD3e, CD4), celule T reglatoare (T). -regs) (CD3e, CD4, FoxP3), celule T δ (CD3e, TRGC1, TRGC2, IL7Ra) și celule imune înnăscute de tip 2 (ILC2s) (Alox5, KLRG1, Ly6a, Pparg, GATA3, IL-5 , IL-13, ICOS și Rxrg)80–82. Neutrofilele au fost identificate prin expresia MMP9, Csf3r, S100A8, S100A8 și ADAM8, deși pot fi subreprezentate în aceste analize datorită conținutului lor scăzut de ARN și nivelurilor ridicate de RNazelor intrinseci83. Celulele dendritice convenționale (cDC) au fost identificate prin expresia ITGAX și ITGAE, iar DC-urile plasmacitoide (pDC) au fost identificate de ITGAX și Siglech.

Clasificarea clusterelor mieloide din scRNA-Seq.

Clusterul 5 a exprimat ITGAMIntADGRE1HiLyz2HiH2-Ab1HiLy6C2- și nu a exprimat TNFAIP2, ceea ce indică faptul că aceste celule sunt macrofage rezidente. Cluster10 a exprimat ITGAM- HiADGRE1HiLyz2Hi H2-Ab1Int Ly6C2-. Clusterele 3 și 4 au exprimat ITGAMInt ADGRE1Int Lyz2Hi H2-Ab1Int Ly6C2Hi, ceea ce sugerează că ambele sunt subseturi de monocite/macrofage infiltrate, deși genele inflamatorii îmbunătățite exprimate în clusterul 3 au fost folosite pentru a identifica grupul 3 ca monocite inflamatorii/macrofage infiltrante. .

Teste de fagocitoză.

Pancreasul șoarecilor injectați cu PBS/microparticule și șoarecilor dresați in vivo cu WGP au fost recoltați la 7 zile după injectare și procesați așa cum s-a descris anterior într-o suspensie de celule unice. Aproximativ 2 × 106 au fost spălate cu HEPES diluate de 50x în RPMI 1640 și apoi incubate în 100 μL din această soluție timp de 1 oră la 37 de grade pentru a activa celulele. Invitrogen promovează Green S.

Kitul de fagocitoză Aureus BioParticlesTM pentru citometrie în flux (Thermo Fisher Scientific) a fost utilizat conform instrucțiunilor producătorului. Aproximativ 100 μL de particule reconstituite sau 1 × 106 GFP plus celule tumorale KPC au fost adăugate la celulele pancreatice activate și incubate timp de 1 oră la 37 de grade. Probele au fost agitate ușor la fiecare 15 minute. Reacția a fost oprită prin adăugarea a 1 ml de PBS rece. Probele au fost incubate cu Fc Block timp de 10 minute la 4 grade, colorate pentru viabilitate, CD45, CD11b și F4/80 timp de 30 de minute la 4 grade și apoi analizate folosind un BD FACSCanto. Pentru analiză, după activarea celulelor vii și CD45, celulele care au fluorescent în canalul FITC au fost determinate a fi fagocitare.

Test de citotoxicitate.

Pancreasul de la șoarecii tratați cu WGP și PBS a fost recoltat și populațiile CD11b plus au fost izolate folosind CD11b plus MicroBeads magnetice (Miltenyi Biotec) și un separator autoMACS Pro (Miltenyi Biotec). Celulele CD11b plus purificate au fost apoi spălate și numărate, iar acestea au fost placate într-un raport de 1:20 tumoră: celule efectoare într-o placă 96-godeuri. Toate probele experimentale au fost efectuate în trei exemplare. După placarea celulelor CD11b plus, inhibitorii ROS N-acetil-lcisteină (NAC) (1 mM, Sigma-Aldrich), Trolox (5 μM, Sigma-Aldrich) sau DFO (50 μM, Farmacopeea Europeană) au fost adăugați la unul. set de celule derivate PBS și WGP timp de 1 oră înainte de adăugarea a 5000 KPC care exprimă luciferaza plus celule tumorale pancreatice la toate godeurile. După 24 de ore de cocultură, plăcile au fost centrifugate și 20 ui de supernatant au fost amestecați cu 100 ui de reactiv de testare a luciferazei (Promega). Activitatea luciferazei măsurată în supernatant s-a corelat cu celulele tumorale care au fost distruse de celulele efectoare și au fost măsurate utilizând un luminometru (Femtomaster FB 12, Zylux Corporation). Semnalul luciferazei spontane de la celulele tumorale placate a fost scăzut din măsurarea supernatantului. Valorile luciferazei sunt reprezentate ca unități de lumină relativă (RLU).

Modele tumorale in vivo ale cancerului pancreatic.

O linie celulară KPC pe un fundal C57BL/6 derivat din LSL-KrasG12D/plus; LSL-Trp53R172H/ plus ; Modelul de mouse Pdx1-Cre (KPC) a fost achiziționat de la Ximbio. Acestea și celulele Pan02, care au fost un cadou generos de la Dr. Yong Lu de la Universitatea Wake Forest, au fost folosite într-un model ortotopic de cancer pancreatic. O linie KPC transfectată cu GFP și luciferază (KPCGFP plus Luc plus) a fost, de asemenea, o contribuție generoasă a Dr. Michael Dwinell de la Colegiul Medical din Wisconsin. Aceste celule au fost utilizate exclusiv la șoareci albino C57BL/6.

Pentru implantarea tumorii, șoarecii au fost anesteziați folosind izofluran, iar abdomenul șoarecilor a fost pregătit cu betadină și drapat într-un mod steril. A fost efectuată o laparotomie de 2 cm pe linia mediană folosind o tehnică aseptică cu instrumente sterile. După laparotomie, pancreasul și splina au fost exteriorizate. Celulele tumorale au fost suspendate în PBS rece ca gheață și amestecate într-un raport de 1:1 cu matricea membranei bazale Matrigel (Corning). 0,1 × 106 celule tumorale în 50 uL de soluție de PBS-matrigel au fost injectate în coada pancreasului utilizând o seringă de insulină 30-calibre. Formarea unei mici bule a indicat implantarea reușită. Peritoneul a fost închis utilizând sutură absorbabilă 5/0 împletită cu acid poliglicolic, iar pielea a fost închisă folosind sutură 5/0 neabsorbabilă împletită de mătase. (CP Medical). Buprenorfina a fost administrată pentru gestionarea durerii până la 72 de ore după intervenție chirurgicală și șoarecii au fost monitorizați.

Imagistica in vivo.

Șoarecilor implantați ortotopic cu GFP plus Luciferază plus celule tumorale KPC au fost injectați IP cu 150 mg/kg greutate corporală la 100 uL de XenoLight D-Luciferin-K plus substrat bioluminiscent cu sare (PerkinElmer). După 10 minute, șoarecii au fost anesteziați cu izofluran și plasați în interiorul unui Biospace Lab Photon Imager, care este o modalitate optică in vivo dedicată la nivel de lumină scăzută pentru imagistica bioluminiscente și fluorescente. Imaginile șoarecilor au fost luate și utilizate pentru a măsura dimensiunea și creșterea tumorii.

Modelul tumoral de amestec.

Șoarecii au fost antrenați cu 1 mg de WGP și 7 zile mai târziu, populațiile CD11b plus CCR2 plus și CD11b plus CCR2− au fost sortate și amestecate 1: 1 cu celule tumorale KPC 1 × 105 celule tumorale. Celulele au fost implantate ortotopic în șoareci WT și 3 săptămâni mai târziu șoarecii au fost eutanasiați și s-a evaluat dimensiunea tumorii.

Terapie combinată cu mAb anti-PD-L1.

Șoarecii C57BL/6 au fost tratați cu WGP în ziua -7 și implantați cu tumori pancreatice ortotopice KPC în ziua 0. Șoarecii au fost tratați cu 200 ug de mAb anti-șoarece anti-PD-L1 (Bio X Cell) sau control izotip IgG2b de șobolan (Bio X Cell) în zilele 3, 7 și 11. Soarecii au fost apoi monitorizați pentru supraviețuire.

WGP ca tratament.

Șoarecii C57BL/6 au fost implantați cu tumori pancreatice ortotopice KPC în ziua 0 și în zilele 4 și 11 șoarecilor li s-a administrat 1 mg IP WGP sau PBS. Șoarecii au fost apoi monitorizați pentru supraviețuire.

Analize statistice.

Toate rezultatele au fost repetate de cel puțin trei ori independent pentru verificare, dacă nu se specifică altfel. Sunt prezentate rezultate reprezentative. Rezultatele sunt reprezentate ca medie ± SEM. Datele au fost analizate folosind testul t Student cu două cozi sau testul U Mann-Whitney. Comparațiile cu mai multe grupuri au fost efectuate folosind un ANOVA unidirecțional sau bidirecțional, urmat de testele de comparații multiple ale lui Tukey. Analizele de corelație au fost efectuate folosind coeficientul de corelație Pearson (distribuție normală). Semnificația statistică a fost stabilită la p < 0.05. Toate analizele statistice au fost efectuate folosind GraphPad Prism Software Version 9 (GraphPad Inc., La Jolla, CA).

Rezumatul raportării.

Mai multe informații despre proiectarea cercetării sunt disponibile în Rezumatul de raportare a cercetării în natură, legat de acest articol.

Disponibilitatea datelor

Datele sursă sunt furnizate în această lucrare. Datele RNASeq sunt disponibile sub accesarea GEO GSE187464, iar datele scRNA-Seq sunt disponibile sub accesarea GEO GSE187464 Datele sursă sunt furnizate în această lucrare.

Primit: 2 aprilie 2021; Acceptat: 17 ianuarie 2022.

Referințe

1. ACS. Fapte și cifre despre cancer 2020.

2. Rahib, L. şi colab. Proiectarea incidenței cancerului și a deceselor până în 2030: povara neașteptată a cancerelor tiroidiene, hepatice și pancreasului în Statele Unite. Cancer Res. 74, 2913–2921 (2014).

3. Kommalapati, A., Tella, SH, Goyal, G., Ma, WW & Mahipal, A. Managementul contemporan al cancerului pancreatic rezecabil localizat. Cancers 10, 24 (2018).

4. Bliss, LA, Witkowski, ER, Yang, CJ & Tseng, JF Rezultate în managementul operativ al cancerului pancreatic. J. Surg. Oncol. 110, 592–598 (2014).

5. Schizas, D. şi colab. Imunoterapia pentru cancerul pancreatic: o actualizare din 2020. Tratamentul Cancerului. Rev. 86, 102016 (2020).

6. Henriksen, A., Dyhl-Polk, A., Chen, I. & Nielsen, D. Inhibitori ai punctelor de control în cancerul pancreatic. Tratamentul Cancerului. Apoc. 78, 17–30 (2019).

7. Madden, K. & Kasler, MK Inhibitori ai punctelor de control imune în cancerul pulmonar și melanom. Semin. Oncol. Asistente medicale. 35, 150932 (2019).

8. Kao, HF & Lou, PJ Inhibitori ai punctelor de control imune pentru carcinomul cu celule scuamoase ale capului și gâtului: peisajul actual și direcțiile viitoare. Cap. Gâtul 41, 4–18 (2019). 9. Leinwand, J. & Miller, G. Reglarea și modularea imunității antitumorale în cancerul pancreatic. Nat. Imunol. 21, 1152–1159 (2020).

10. Royal, RE et al. Studiu de fază 2 cu ipilimumab cu un singur agent (anti-CTLA-4) pentru adenocarcinomul pancreatic local avansat sau metastatic. J. Immunother. 33, 828–833 (2010).

11. O'Reilly, EM et al. Durvalumab cu sau fără tremelimumab pentru pacienții cu adenocarcinom ductal pancreatic metastatic: un studiu clinic randomizat de fază 2. JAMA Oncol. 5, 1431–1438 (2019).

12. Weiss, GJ et al. Studiu de fază Ib/II cu gemcitabină, nab-paclitaxel și pembrolizumab în adenocarcinomul pancreatic metastatic. Investi. New Drugs 36, 96–102 (2018). 13. Whatcott, CJ, Posner, RG, Von Hoff, DD & Han, H. în Pancreatic Cancer and Tumor Microenvironment (eds. Grippo, PJ & Munshi, HG) Ch. 8 (Transworld Research Network, 2012).

14. Karamitopoulou, E. Micromediul tumoral al cancerului pancreatic: peisajul imunitar este dictat de caracteristicile moleculare și histopatologice. Br. J. Cancer 121, 5–14 (2019).

15. Daniel, SK, Sullivan, KM, Labadie, KP & Pillarissetty, VG Hipoxia ca barieră în calea imunoterapiei în adenocarcinomul pancreatic. Clin. Transl. Med. 8, 10–10 (2019).

16. Wang, W. şi colab. RIP1 kinaza conduce toleranța imună adaptativă mediată de macrofage în cancerul pancreatic. Cancer Cell 38, 585–590 (2020).

17. Netea, MG et al. Imunitate antrenată: un program de memorie imună înnăscută în sănătate și boală. Science 352, aaf1098 (2016).

18. Bekkering, S. et al. Inducerea metabolică a imunității antrenate prin calea mevalonatului. Celula 172, 135–146 e139 (2018).

19. van der Heijden, C. et al. Epigenetica și imunitatea antrenată. Antioxid. Semnal redox. 29, 1023–1040 (2018).

20. Priem, B. et al. Terapia nanobiologică antrenată care promovează imunitatea suprimă creșterea tumorii și potențează inhibarea punctelor de control. Celula 183, 786–801 e719 (2020).

21. Kalafati, L. et al. Antrenamentul imun înnăscut al granulopoiezei promovează activitatea antitumorală. Celula 183, 771–785 e712 (2020).

22. Mitroulis, I. et al. Modularea progenitorilor mielopoiezei este o componentă integrală a imunității antrenate. Celula 172, 147–161.e112 (2018).

23. Bekkering, S., Dominguez-Andres, J., Joosten, LAB, Riksen, NP & Netea, MG Imunitatea antrenată: reprogramarea imunității înnăscute în sănătate și boală. Annu Rev. Immunol. 39, 667–693 (2021).

24. Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F. & Gomez Perdiguero, E. Dezvoltarea și funcția macrofagelor rezidente în țesut la șoareci. Semin. Imunol. 27, 369–378 (2015). 25. Calderon, B. et al. Anatomia pancreasului condiţionează originea şi proprietăţile macrofagelor rezidente. J. Exp. Med. 212, 1497–1512 (2015).

26. Kim, H. Factorul de transcripție MafB promovează polarizarea M2 antiinflamatoare și efluxul de colesterol în macrofage. Sci. Rep. 7, 7591 (2017).

27. Kim, SY et al. Efectele antiinflamatorii ale apocininei, un inhibitor al NADPH oxidazei, în inflamația căilor respiratorii. Imunol. Cell Biol. 90, 441–448 (2012).

28. Liu, M. et al. Factorul de transcripție c-Maf este un punct de control care programează macrofagele în cancerul pulmonar. J. Clin. Investi. 130, 2081–2096 (2020).

29. Zimmerman, KA şi colab. Secvențierea ARN cu o singură celulă identifică semnăturile de expresie a genei de macrofage rezidente renale candidate la nivelul speciilor. J. Am. Soc. Nefrol. 30, 767–781 (2019).

30. Bakos, E. şi colab. CCR2 reglează răspunsul imun prin modularea interconversiei și a funcției celulelor T efectoare și reglatoare. J. Immunol. 198, 4659–4671 (2017).

31. Kurihara, T., Warr, G., Loy, J. & Bravo, R. Defecte în recrutarea macrofagelor și apărarea gazdei la șoarecii care nu au receptorul de chemokine CCR2. J. Exp. Med. 186, 1757–1762 (1997).

32. Kuziel, WA şi colab. Reducerea severă a aderenței leucocitelor și extravazării monocitelor la șoarecii cu deficiență în receptorul 2 al chemokinei CC. Proc. Natl Acad. Sci. SUA 94, 12053–12058 (1997).

33. Kratofil, RM, Kubes, P. & Deniset, JF Conversia monocitelor în timpul inflamației și rănilor. Arterioscler. Tromb. Vasc. Biol. 37, 35–42 (2017).

34. Funamizu, N. et al. Factorul inhibitor al migrației macrofagelor induce tranziția epitelială la mezenchimală, sporește agresivitatea tumorii și prezice rezultatele clinice în adenocarcinomul ductal pancreatic rezecat. Int. J. Cancer 132, 785–794 (2013).

35. Denz, A. şi colab. Inhibarea MIF duce la oprirea ciclului celular și la apoptoză în celulele canceroase pancreatice. J. Surg. Res. 160, 29–34 (2010).

36. Su, LJ şi colab. Peroxidarea lipidică indusă de specii reactive de oxigen în apoptoză, autofagie și ferroptoză. Oxid. Med. Cell Longev. 2019, 5080843 (2019).

37. Geller, A., Shrestha, R. & Yan, J. Glucan derivat din drojdie în cancer: utilizări noi ale unei terapii tradiționale. Int. J. Mol. Sci. 20, 3618 (2019).

38. Shrivastava, P. & Bhatia, M. Rolul esențial al monocitelor și macrofagelor în progresia pancreatitei acute. Lumea J. Gastroenterol. 16, 3995–4002 (2010).

39. Wang, J. & Kubes, P. Un rezervor de macrofage cavități mature care pot invada rapid organele viscerale pentru a afecta repararea țesuturilor. Celula 165, 668–678 (2016).

40. Qi, C. şi colab. Căi diferențiale care reglează răspunsurile imune antitumorale înnăscute și adaptive prin particule și glucani solubili derivati ​​din drojdie. Blood 117, 6825–6836 (2011).

41. Goodridge, HS și colab. Activarea receptorului imunitar înnăscut Dectin-1 la formarea unei „sinapse fagocitare”. Nature 472, 471–475 (2011).

42. Masuda, Y. et al. Administrarea orală de glucani solubili extrași din Grifola frondosa induce un răspuns imun sistemic antitumoral și scade imunosupresia la șoarecii purtători de tumori. Int. J. Cancer 133, 108–119 (2013).

43. Rice, PJ et al. Farmacocinetica fungilor (1-3)-beta-D-glucanilor după administrarea intravenoasă la șobolani. Int. Imunofarmacol. 4, 1209–1215 (2004).

44. Huang, Y. şi colab. Traficul interorganelor dependent de S1P al celulelor limfoide înnăscute din grupul 2 sprijină apărarea gazdei. Science 359, 114–119 (2018).

45. Mathä, L. et al. Migrația celulelor limfoide înnăscute din grupul 2 rezidente pulmonar leagă inflamația pulmonară alergică și imunitatea ficatului. Față. Imunol. 12, 67950 (2021).

46. ​​Ricardo-Gonzalez, RR et al. Căile specifice țesutului extrud ILC2 activate pentru a disemina imunitatea de tip 2. J. Exp. Med. 217, e2019117 (2020).

47. Mattiola, I. & Diefenbach, A. Activarea imunității anti-tumorale prin declanșarea ILC2. Cell Res. 30, 461–462 (2020).

48. Qian, BZ & Pollard, JW Diversitatea macrofagelor îmbunătățește progresia tumorii și metastazele. Celula 141, 39–51 (2010).

49. Qian, BZ şi colab. CCL2 recrutează monocite inflamatorii pentru a facilita metastaza tumorii mamare. Nature 475, 222–225 (2011).

50. Munn, DH & Cheung, NK Fagocitoza celulelor tumorale de către monocite umane cultivate în factor de stimulare a coloniilor de macrofage recombinant. J. Exp. Med. 172, 231–237 (1990).

51. Jadus, MR și colab. Macrofagele ucid celulele tumorale de gliom T9 care poartă izoforma membranei a factorului de stimulare a coloniilor de macrofage printr-o cale dependentă de fagocitoză. J. Immunol. 160, 361–368 (1998).

52. Zhou, X., Liu, X. & Huang, L. Fagocitoza celulelor tumorale mediată de macrofage: o oportunitate pentru intervenția nanomedicină. Adv. Funct. Mater. 31, 2006220 (2021).

53. Lecoultre, M., Dutoit, V. & Walker, PR Funcția fagocitară a macrofagelor asociate tumorii ca determinant cheie al controlului progresiei tumorii: o revizuire. J. Immunother. Cancer 8, e001408 (2020).

54. Cui, S., Reichner, JS, Mateo, RB & Albina, JE Macrofagele murine activate induc apoptoza în celulele tumorale prin mecanisme dependente sau independente de oxid nitric. Cancer Res. 54, 2462–2467 (1994).

55. Brahmer, JR şi colab. Siguranța și activitatea anticorpilor anti-PD-L1 la pacienții cu cancer avansat. N. Engl. J. Med. 366, 2455–2465 (2012).

56. Saijo, S. et al. Dectina-1 este necesară pentru apărarea gazdei împotriva Pneumocystis carinii, dar nu împotriva Candida albicans. Nat. Imunol. 8, 39–46 (2007).

57. Bernhagen, J. şi colab. Purificarea, bioactivitatea și analiza structurii secundare a factorului inhibitor al migrației macrofagelor (MIF) de șoarece și uman. Biochemistry 33, 14144–14155 (1994).

58. Chen, TJ & Kotecha, N. Cytobank: furnizarea unei platforme de analiză pentru analiza și colaborarea datelor de citometrie comunitară. Curr. Top. Microbiol. Imunol. 377, 127–157 (2014).

59. Nowicka, M. şi colab. Flux de lucru CyTOF: descoperire diferențială în seturi de date de citometrie de mare capacitate. F1000Res. 6, 748 (2017).

60. Wilkerson, MD & Hayes, DN ConsensusClusterPlus: un instrument de descoperire a clasei cu evaluări de încredere și urmărire a articolelor. Bioinformatica 26, 1572–1573 (2010). 61. Finak G., JM FlowWorkspace: Infrastructură pentru reprezentarea și interacțiunea cu seturi de date de citometrie închisă și nedeterminată. Versiunea bioconductorului (2019).

62. Finak, G., Jiang, W. & Gottardo, R. CytoML pentru partajarea datelor de citometrie multiplatformă. Cytom. Partea A: J. Int. Soc. Anal. Cytol. 93, 1189–1196 (2018).

63. Crowell, HL, Zanotelli, VRT, Chevrier, S. & Robinson, MD CATALYST: instrumente de analiză a datelor de citometrie. Pachetul R versiunea 1.10.3. HelenaLC/CATALYST (2020).

64. Cock, PJ, Fields, CJ, Goto, N., Heuer, ML & Rice, PM Formatul de fișier Sanger FASTQ pentru secvențe cu scoruri de calitate și variantele Solexa/Illumina FASTQ. Acizi nucleici Res. 38, 1767–1771 (2010).

65. Illumina. Ghidul utilizatorului BaseSpace. 2014.

66. Andrews, S. FastQC: un instrument de control al calității pentru date de secvență de mare capacitate.

67. Dobin, A. şi colab. STAR: alinier universal ultrarapid ARN-seq. Bioinformatica 29, 15–21 (2013).

68. Love, MI, Huber, W. & Anders, S. Estimarea moderată a schimbării orificiului și dispersiei pentru datele ARN-seq cu DESeq2. Genom Biol. 15, 550 (2014).

69. Trapnell, C. şi colab. Analiza diferențială a expresiei genelor și a transcripției a experimentelor ARNseq cu TopHat și Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562–578 (2012).

70. Anders, S., Pyl, PT & Huber, W. HTSeq – un cadru Python pentru a lucra cu date de secvențiere cu randament ridicat. Bioinformatica 31, 166–169 (2015).

71. Boyle, EI et al. GO::TermFinder – software cu sursă deschisă pentru accesarea informațiilor Gene Ontology și găsirea de termeni Gene Ontology semnificativ îmbogățiți asociați cu o listă de gene. Bioinformatica 20, 3710–3715 (2004).

72. Kanehisa, M. & Goto, S. KEGG: Enciclopedia kyoto a genelor și genomurilor. Acizi nucleici Res. 28, 27–30 (2000).

73. Stuart, T. et al. Integrarea completă a datelor cu o singură celulă. Celula 177, 1888–1902. e1821 (2019).

74. Lun, AT, Riesenfeld, S., Andrews, T., Gomes, T. & Marioni, JC EmptyDrops: diferențierea celulelor de picăturile goale în datele de secvențiere a ARN-ului unicelular pe bază de picături. Genom Biol. 20, 1–9 (2019).

75. Hafemeister, C. & Satija, R. Normalizarea și stabilizarea varianței datelor ARN-seq cu o singură celulă folosind regresia binomială negativă regularizată. Genom Biol. 20, 1–15 (2019).

76. Becht, E. et al. Reducerea dimensionalității pentru vizualizarea datelor cu o singură celulă folosind UMAP. Nat. Biotehnologia. 37, 38–44 (2019).

77. Diaz-Mejia, JJ et al. Evaluarea metodelor de atribuire a etichetelor tipului de celule clusterelor de celule din datele de secvențiere a ARN-ului unicelular. F1000Res. 8 ISCB Comm J-296 (2019). 78. Hänzelmann, S., Castelo, R. & Guinney, J. GSVA: analiza variației setului de gene pentru datele microarray și ARN-seq. BMC Bioinforma. 14, 7 (2013).

79. Finak, G. şi colab. MAST: un cadru statistic flexibil pentru evaluarea modificărilor transcripționale și caracterizarea eterogenității în datele de secvențiere a ARN-ului unicelular. Genom Biol. 16, 1–13 (2015).

80. Suffiotti, M., Carmona, SJ, Jandus, C. & Gfeller, D. Identificarea celulelor limfoide înnăscute în datele ARN-Seq cu o singură celulă. Imunogenetics 69, 439–450 (2017).

81. Entwistle, LJ et al. Fenotipul celulelor limfoide înnăscute din grupa 2 pulmonară este specific contextului: determinând efectul tulpinii, locației și stimulilor. Față. Imunol. 10, 3114 (2020).

82. Ricardo-Gonzalez, RR et al. Semnalele tisulare imprimă identitatea ILC2 cu funcție de anticipare. Nat. Imunol. 19, 1093–1099 (2018).

83. Zilionis, R. et al. Transcriptomica unicelulară a cancerelor pulmonare umane și de șoarece dezvăluie populații mieloide conservate la indivizi și specii. Imunitatea 50, 1317–1334.e1310 (2019).

Mulțumiri

Autorii doresc să mulțumească Dr. Wolfgang Zacharias, Dr. Mei Zhang și Sabine Waigel de la Brown Cancer Center Genomics Facility pentru ajutorul lor în ARN-Seq și scRNASeq. De asemenea, dorim să mulțumim Dr. Clint Geller pentru corectarea manuscrisului. Această lucrare a fost susținută de NIH R01CA213990 și R01AI128818 (JY). CD și CTW au fost acceptate parțial de NIH P20GM135004. O parte a acestei lucrări a fost realizată cu asistența UofL Genomics Facility, care este susținută de NIH P20GM103436 (KY IDeA Networks of Biomedical Research Excellence), Brown Cancer Center și taxele de utilizare. CyTOF a fost efectuat în Functional Immunomics Core susținut de NIH P20GM135004 (Jun Yan/Jason Chesney, MPI). Suportul de secvențiere și bioinformatică pentru această lucrare a fost oferit de NIH P20GM103436 (Nigel Cooper, PI) și NIH P20GM106396 (Donald Miller, PI). Conținutul acestei lucrări este responsabilitatea exclusivă a autorilor și nu reprezintă opiniile oficiale ale NIH sau ale Institutului Național pentru Științe Medicale Generale (NIGMS).

Contribuții ale autorului

AEG a proiectat și realizat experimentele, a analizat datele, a interpretat rezultatele și a scris manuscrisul. RS, CD și HG au contribuit la proiectarea experimentală, achiziția datelor și analiza datelor. MRW, XH și MZ au asistat la achiziția de date și pregătirea materialelor. KA și ECR au contribuit la analiza computațională și interpretarea analizelor ARN-Seq, iar JHC și ECR au contribuit la analiza computațională și interpretarea analizelor ScRNA-Seq. DT și CTW au contribuit la analiza datelor CyTOF. RAM, H.-gZ și YL au contribuit cu materiale și au ghidat proiectul. RAM a efectuat o revizuire critică. JY a condus designul experimental și studiul general, a interpretat datele, a supravegheat cercetarea și a asistat la scrierea și revizuirea manuscrisului.

Interese concurente

Autorii nu declară interese concurente.

Informații suplimentare

Informații suplimentare Versiunea online conține materiale suplimentare disponibile la https://doi.org/10.1038/s41467-022-28407-4.

Corespondența și cererile de materiale trebuie adresate lui Jun Yan.

Informații peer review

Nature Communications îi mulțumește lui George Miller și celorlalți recenzori anonimi pentru contribuția lor la evaluarea de către colegi a acestei lucrări. Sunt disponibile rapoarte peer reviewer.

Retipăririle și informațiile privind permisiunile sunt disponibile la http://www.nature.com/reprints

Nota editorului Springer Nature rămâne neutră cu privire la revendicările jurisdicționale din hărțile publicate și afilierile instituționale.

Acces deschis Acest articol este licențiat în baza unei licențe internaționale Creative Commons Attribution 4.0, care permite utilizarea, partajarea, adaptarea, distribuirea și reproducerea în orice mediu sau format, atâta timp cât acordați credit corespunzător autorului original. (s) și sursa, furnizați un link către licența Creative Commons și indicați dacă s-au făcut modificări.

Imaginile sau alte materiale ale terților din acest articol sunt incluse în licența Creative Commons a articolului, cu excepția cazului în care se indică altfel într-o linie de credit a materialului. Dacă materialul nu este inclus în licența Creative Commons a articolului și utilizarea dorită nu este permisă de reglementările legale sau depășește utilizarea permisă, va trebui să obțineți permisiunea direct de la deținătorul drepturilor de autor. Pentru a vizualiza o copie a acestei licențe.

For more information:1950477648nn@gmail.com