Mecanismul Cistanche Deserticola de promovare a funcției intestinale

Yuan Gao, Chuanjie Zong, Fen Liu, Lei Fang, Runlan Cai, Yue Shi, Xi Chen, Yun Qi

Abstract

Feniletanoidglicozide(PhGs), o clasă de compuși polifenolici, sunt considerați unul dintre constituenții bioactivi majori aiCistanchedeserticolaYC Ma (CD), al cărui extract este utilizat pe cale orală în medicina tradițională chineză. Deși studiile farmacologice anterioare au raportat că PhG exercită multe activități, profilurile lor de transport intestinal nu au fost clarificate. În acest studiu, am investigat permeabilitatea intestinală a unui extract bogat în PhG (PRE) dinCistancheDeserticolaca sistem integrat în modelul monostrat de celule Caco-2 folosind un sistem de biotestare. Rezultatele au arătat că PRE este transportat în principal prin difuzie pasivă slab absorbită în josul unui gradient de concentrație fără eflux, care oferă baza farmacocinetică pentru aplicarea clinică a PhG înCistanche Deserticola. Am determinat, de asemenea, permeabilitatea intestinală a trei majorePhGs[acteozidă (AC), izoacteozidă (IS) și echinacozidă (EC)]de HLPC. În plus, am dezvoltat o nouă metodă de detectare a fluorescenței HPLC pentru a determina cu precizie cantitatea de flux de AC și IS. După cum era de așteptat, caracteristicile de transport ale celor treiPhGssunt în concordanță cu cele ale PRE, indicând faptul că prezentul sistem de biotestare este adecvat și de încredere pentru evaluarea caracteristicilor de transport ale grupurilor de ingrediente active (AIG) în PRE. Mai mult, acest sistem poate fi potrivit și pentru alte extracte de plante, având o bioactivitate adecvată.

A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Cistanche deserticola are multe efecte, click aici pentru a afla mai multe

Introducere

Linia celulară Caco-2, care a fost derivată din adenocarcinoamele de colon umane, prezintă caracteristici asemănătoare enterocitelor. În condiții normale, celulele Caco-2 se diferențiază spontan de celulele mature și formează monostraturi intacte [1]. Celulele adiacente aderă prin joncțiuni strânse formate pe partea apicală a monostratului, care pot discrimina medicamentele transportate pasiv și activ prin stratul epitelial [2]. Datorită asemănării morfologice și biochimice cu enterocitele normale, monostraturile de celule Caco-2 servesc ca un model in vitro bine acceptat pentru studiul potențialului de absorbție intestinală și a caracteristicilor de transport ale medicamentelor [3, 4].

Spre deosebire de substanțele chimice, extractele de plante (PE) sunt amestecuri a căror activitate biologică și constituenți activi nu sunt adesea bine identificați [5]. În plus, proprietățile de transport intestinal ale PE, spre deosebire de proprietățile constituenților săi, sunt strâns legate de utilizarea clinică. Măsurătorile de flux pentru o probă de testare pe un monostrat de celule Caco-2 implică de obicei metode chimice, cum ar fi HPLC, LC/MS etc. Deși aceste metode sunt instrumente puternice, sunt complexe, consumatoare de timp, costisitoare și ocazional necesită echipament sofisticat. Mai important, nici o singură componentă, nici o componentă minoritară nu poate reflecta PE în ansamblu. Astfel, trebuie stabilită o abordare nouă, independentă de determinarea constituenților, pentru a identifica și evalua caracteristicile de transport ale PE.

CistanchedeserticolaYC Ma (CD), o plantă holoparazită, este o medicină tradițională chineză comună utilizată în principal pentru a trata deficiența rinichilor, slăbiciunea corpului și constipația, iar aceste utilizări au fost înregistrate oficial în Farmacopeea Chineză [6]. Glicozidele feniletanoide (PhG), inclusiv echinacozide (EC), acteozide (AC), izoacteozide (IS) etc., sunt o clasă de compuși polifenolici [7]. Sunt considerați unul dintre constituenții bioactivi majori aiCistanchespecie [8]. Studiile farmacologice au arătat că bioactivitateaPhGseste divers și include efecte anti-oxidative [9], anti-oboseală [10], hepatoprotectoare [11], imunomodulatoare [12], antiinflamatoare [7, 13] și neuroprotectoare [14]. Cu toate acestea, caracteristicile de transport intestinal alePhGsnu au fost investigate. În acest studiu, am explorat permeabilitatea intestinală a unui extract bogat în PhG (PRE) din CD ca sistem integrat și permeabilitatea a trei PhG majore (AC, IS și EC) în celule Caco-2 diferențiate. Rezultatele noastre au indicat că PRE este transportat în principal prin difuzie pasivă slab absorbită în josul unui gradient de concentrație fără eflux, care oferă baza farmacocinetică pentru aplicarea clinică a PhG în CD.

Materiale și metode

Materiale

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS and EC (>98 la sută) au fost achiziționate de la Must Biotechnology Co. (Chengdu, China). Mediul Eagle modificat de Dulbecco (DMEM), serul fetal bovin (FBS) și aminoacizii neesențiali (NEAA) au fost produși de Gibco BRL (Grand Island, NY, SUA). 6-plăci TranswellTM cu godeuri (inserați suprafața de creștere a membranei 4,67 cm2) au fost obținute de la Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, SUA). Colagenul din coada de șobolan a fost obținut de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SUA). Toți reactivii și substanțele chimice pentru analiza HPLC au fost de calitate analitică.

Preparare de PRE din Cistanche deserticola

Materialul CD uscat la aer a fost pulverizat și extras prin percolare cu etanol 70%. Fracția bogată în PhG a fost preparată așa cum s-a descris anterior [10] și extrasă cu alcool n-butilic saturat în apă. Lichidul de extract a fost concentrat şi uscat sub presiune redusă. Spectrofotometria rășină macroporoasă-UV [15] a măsurat un conținut de PhG de 78,4 la sută. Proba finală a reprezentat un randament de 1,75 la sută de materie primă în greutate uscată. Proba obținută a fost păstrată la -20 de grade până la utilizare ulterioară.

Determinarea AC, IS și EC prin HPLC

Un sistem HPLC Shimadzu echipat cu software-ul de soluție LC a fost utilizat pentru a testa conținutul de AC, IS și EC în PRE. O coloană Intersil C18 cu fază inversă (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) a fost utilizată și menținută la temperatura camerei. Fazele mobile au fost acetonitril și apă care conține 0,1% acid fosforic (v/v) cu gradient de eluție (Tabelul 1) la un debit de 1,0 ml/min. Detectorul spectrofotometrului UV a fost setat la 334 nm. Pentru a determina cu precizie fluxul de AC și IS, am dezvoltat o nouă metodă de detectare a fluorescenței HPLC (HPLC-FLD). După o analiză structurală și scanare a lungimii de undă de fluorescență (datele nu sunt prezentate), am obținut condițiile optime de detectare a fluorescenței pentru AC (Ex: 338 nm, Em: 448 nm) și IS (Ex: 320 nm, Em: 434 nm)

Metoda analitică HPLC a fost validată folosind următoarele caracteristici de performanță: stabilitate, liniaritate, sensibilitate, precizie (variabilitate intra și inter-zi) și acuratețe. Analiții din tamponul de transport au fost depozitați la 25 de grade în întuneric timp de 24 de ore, iar stabilitatea lor a fost măsurată. Analiții au fost foarte stabili în prezența vitaminei C (0,4 la sută) deoarece valorile deviației standard relative (RSD) în zonele de vârf au fost < 3,5="" la="" sută.="" ecuația="" de="" regresie="" liniară,="" coeficientul="" de="" corelație,="" intervalul="" de="" liniaritate,="" lod="" și="" loq="" pentru="" ac,="" is="" și="" ec="" sunt="" prezentate="" în="" tabelul="" 2.="" lod-urile="" (18–30="" nm)="" și="" loq-urile="" (60–100="" nm)="" valorile="" ilustrează="" faptul="" că="" metodele="" hplc-fld="" și="" hplc-uv="" sunt="" foarte="" sensibile.="" valorile="" rsd="" care="" exprimă="" precizia="" metodei="" au="" fost="" toate="">< 2="" procente="" pentru="" variabilitatea="" intra-="" și="" inter-zi,="" indicând="" o="" precizie="" bună.="" pentru="" evaluarea="" recuperării,="" ac,="" is="" și="" ec="" au="" fost="" adăugate="" la="" tamponul="" de="" transport="" pentru="" a="" produce="" trei="" niveluri="" de="" concentrație="" (înaltă,="" medie="" și="" scăzută).="" valorile="" de="" recuperare="" ale="" metodei="" pentru="" analiți="" sunt="" rezumate="" în="" tabelul="" 3.="" recuperările="" medii="" au="" variat="" de="" la="" 90,0="" la="" sută="" la="" 96,4="" la="" sută,="" indicând="" o="" precizie="" bună.="" în="" concluzie,="" metodele="" hplc="" stabilite="" sunt="" satisfăcătoare="" în="" ceea="" ce="" privește="" liniaritatea,="" sensibilitatea,="" precizia="" și="" acuratețea="" pentru="" cuantificarea="" ac,="" is="" și="" ec="" în="" tampon="" de="">

Determinarea PRE prin sistem de biotestare

Biotestul (capacitatea antioxidantă totală) s-a bazat pe testul FRAP (ferric reducing/antioxidant power) pe care l-am descris anterior [16] și validat în termeni de liniaritate și precizie (variabilitate intra- și inter-zi). Linearitatea metodei de biotest a fost determinată pe baza curbelor de calibrare. Intervalul de concentrație al liniarității a fost de 0.0625 - 40 ug/ml (y=0,0258x plus 0,0968, R2=0,996). Precizia metodei de biotest stabilite a fost determinată în ceea ce privește variabilitatea intra- și inter-zi pentru o analiză a PRE (10,0 ug/ml). Repetabilitate intra-zi a metodei a fost determinată pe baza a cinci determinări consecutive în aceeași zi. Repetabilitate între zile a fost măsurată pe baza a cinci determinări consecutive în trei zile diferite. Valorile RSD pentru precizia metodei au fost 1,014 la sută și 4,72 la sută pentru variabilitatea intra- și, respectiv, inter-zi, indicând o precizie bună. Astfel, metoda de biotestare stabilită este satisfăcătoare în ceea ce privește liniaritatea, precizia și acuratețea pentru cuantificarea PRE în tampon de transport.

Cultură de celule

Celulele Caco{{0}} au fost cultivate la 37 de grade și 95% umiditate relativă într-o atmosferă care conține 5% CO2 și mediu constând din DMEM, 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-glutamină, penicilină ( 100 U/ml) și streptomicina (100 ug/ml). Mediul a fost schimbat la două zile în timpul creșterii și diferențierii celulelor. Celulele au fost crescute în baloane de plastic de 75-cm2 și recoltate la fiecare 3-5 zile cu 0,05% EDTA-tripsină. Pentru experimentele de transport, celulele au fost însămânțate la o densitate de 1 x 105 celule/cm2 pe inserții Transwell acoperite cu colagen. La aproximativ 21 de zile de la însămânțare, monostraturile au fost utilizate pentru experimentele de transport. Integritatea lor a fost determinată prin măsurarea rezistenței electrice transepiteliale (TEER) pe monostraturi cu un EVOM echipat cu ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., SUA). Valorile TEER ale monostratului de celule Caco-2 trebuiau să depășească 500 O∙cm2.

Experimente de transport

Monostratul a fost spălat cu tampon de transport (tampon P care conține 10 mM HEPES, 1 mM piruvat de sodiu, 10 mM glucoză, 3 mM CaCl2 și 145 mM NaCI, pH 7,4) și apoi s-a preincubat timp de 20 min la 37 de grade. După îndepărtarea tamponului de transport, tamponul de transport proaspăt care conține probe de testare a fost adăugat în camera apicală (AP) (1,5 ml) în studiile direcționale AP până la bazolateral (BL) sau în camera BL (2,5 ml) în studiile direcționale BL până la AP. Pentru testele AC, IS și EC utilizând HPLC, o alicotă (300 ul) a fost îndepărtată din fiecare cameră receptor la intervale de timp diferite (30, 60, 90 și 120 min). Camera receptorului a fost completată cu același volum de tampon de transport proaspăt preîncălzit (37 de grade) după fiecare prelevare. Probele colectate au fost depozitate la -20 de grade pentru utilizare ulterioară. Pentru determinarea PRE folosind biotestul, au fost prelevate numai probe la 120 min. Datorită instabilității PRE, AC, IS și EC, s-a adăugat 0,4% (g/v) vitamina C pentru a stabiliza probele pentru a determina conținutul de AC, IS și EC prin HPLC și probele pentru PRE biotestele au fost testate imediat după ce au fost prelevate. A fost calculată valoarea coeficientului de permeabilitate aparentă (Papp sau 'Papp) pentru fiecare probă.

Analiza datelor

Valorile Papp în direcțiile AP BL sau BLAP ale AC, IS și EC au fost calculate pe baza următoarei ecuații: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC{0), unde Papp este coeficientul de permeabilitate aparentă (cm/s) determinat prin HPLC. (4Q/4t) este rata de apariție a compusului de testat (AC, IS sau EC) pe partea receptorului (μmol/s); A este aria suprafeței insertului (cm2); C0 este concentrația inițială a compusului de testat pe partea donor (μmol/ml). Mai exact, unitatea de masă „ug” a fost folosită în loc de „μmol” atunci când au fost calculate valorile „Papp”. Datele sunt exprimate ca medii ± SD.

Rezultate

Compoziția de acteozidă, izoacteozidă și echinacozidă în PRE din Cistanche Deserticola

Deoarece AC, IS și EC sunt considerate PhG bioactive majore ale speciilor Cistanche [8], am analizat conținutul lor în PRE prin HPLC-UV. Cromatograma reprezentativă este prezentată în Fig. 1. Identificarea acestor constituenți sa bazat pe compararea timpilor de retenție și a spectrului UV cu cele ale standardelor autentice la o lungime de undă de 334 nm. Conținuturile de AC, IS și EC în PRE au fost de 26,60 la sută, 1,84 la sută și, respectiv, 32,83 la sută. Astfel, acești trei compuși reprezintă 61,27 la sută din PRE; în plus, rezultatele de mai sus indică faptul că conținutul de PhG în PRE este de 78,4 la sută. Prin urmare, AC, IS și EC reprezintă aproximativ 80 la sută din PhG în PRE.

Capacități antioxidante totale ale PRE, AC, IS și EC

Au fost raportate studii privind activitatea antioxidantă a PhG din CD [9], iar AC, IS și EC reprezintă aproximativ 80% din PhG din PRE. Astfel, capacitățile antioxidante totale ale PRE, AC, IS și EC au fost testate și sunt exprimate folosind valorile FRAP (× 10–6 mmol). După cum se arată în Fig. 2, când valoarea FRAP a fost de 8 × 10–6 mmol, concentrațiile finale de PRE, AC, IS și EC au fost 6,20 ug/ml, 3,14 ug/ml, 22,92 ug/ml și 4,89 ug/ml. ml, respectiv, indicând că capacitatea antioxidantă totală a acestor patru probe s-a clasat după cum urmează: AC > EC > PRE > IS. Bioactivitatea PRE este atribuită grupurilor sale de ingrediente active (AIG). Pentru aproximativ 60% din PRE, AC și EC au prezentat o activitate antioxidantă totală mai puternică decât PRE și IS. Deoarece IS (1,84 la sută) constituie o fracțiune foarte mică de PRE, alte componente, cum ar fi IS slab antioxidant, sunt, de asemenea, clar active în PRE. În mod surprinzător, activitatea anti-oxidativă totală a diferit de aproape 7-ori între AC și izomerul său IS, indicând nu numai numărul de grupări hidroxil fenolice [9], ci și poziția grupărilor hidroxil fenolice în moleculă a afectat anti. -efect oxidativ.

Validarea monostraturilor Caco-2

Pentru a valida sistemul monostrat de celule Caco-2, valorile Papp ale propranololului (un marker bine transportat) și galben Lucifer (un marker slab transportat) de la AP la BL prin monostraturile Caco-2 au fost determinate ca 1,51 × 10–5 cm/s și, respectiv, 2,8 × 10–7 cm/s, iar aceste valori au fost de acord cu cele publicate în rapoartele anterioare [17, 18]. Testul activității fosfatazei alcaline a confirmat, de asemenea, că monostraturile de celule Caco-2 erau comparabile calitativ cu epiteliul intestinal subțire [19]

Permeabilitatea Acteozidei, Isoacteozidei și Echinacozidei

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 cm/s), în timp ce cele ale medicamentelor slab absorbite au fost scăzute (< 1.0="" ×="" 10–6="" cm/s)="" [3].="" as="" shown="" in="" table="" 4,="" the="" papp="" values="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" was="" nearly="" on="" the="" order="" of="" 10–7="" cm/s,="" indicating="" that="" these="" compounds="" were="" poorly="" permeable.="" furthermore,="" efflux="" or="" active="" transport="" were="" not="" observed="" because="" the="" ratios="" of="" papp="" bl="" to="" ap="" papp="" ap="" to="" bl="" for="" ac,="" is="" and="" ec="" was="" between="" 0.90="" ~="" 1.55,="" and="" the="" criterion="" of="" net="" efflux="" proposed="" by="" the="" fda="" guidance="" is="" a="" ratio="" less="" than="" 2="" [20].="" based="" on="" the="" kinetic="" curves="" presented="" in="" fig.="" 3,="" the="" bidirectional="" transport="" percentages="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" at="" 200="" μm="" increased="" linearly="" with="" time.="" the="" transport="" rate="" (tr)="" values="" of="" the="" three="" compounds="" increased="" linearly="" in="" both="" directions="" between="" approximately="" 100="" and="" 300="" μm="" (fig.="" 4).="" these="" results="" indicate="" that="" the="" main="" transport="" mechanism="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" is="" also="" passive="">

Permeabilitatea PRE

Rezultatele de mai sus indică faptul că capacitatea antioxidantă totală a PRE se datorează cel puțin 61,27% din AIG din PRE. Astfel, am evaluat TR-ul PRE pe baza curbei sale concentrație-efect a capacității antioxidante totale și am calculat valorile Papp pentru a reflecta caracteristicile de transport ale PRE. „Valorile Papp ale PRE pentru AP!BL și BL!AP au fost (2,16 ± 0,26) × 1{0–7 cm/s și (3,13 ± 0,29) × 10–7 cm/ s, respectiv, indicând faptul că acest compus a fost slab permeabil. În plus, efluxul sau transportul activ nu a fost evident deoarece raportul „Papp BL la AP / „Papp AP la BL pentru PRE a fost de 1,45 [20]. Mai mult, TR bidirecțional al PRE a crescut liniar între aproximativ 300 și 900 ug/ml (Fig. 5). Lipsa preferinței direcționale a rezultatelor sugerează că difuzia pasivă este principalul mecanism de transport al PRE.

Discuţie

În comparație cu medicamentele foarte purificate, PE este în general un amestec care constă din sute de constituenți cu proprietăți fizico-chimice foarte diferite. Prin urmare, PE exercită acțiune sinergetică sistematică, multițintă și multicanal datorită AIG lor complex [21], care împiedică analiza caracteristicilor de transport ale PE. Pentru a evalua proprietățile de transport ale PE mai științific, unii cercetători au identificat mai multe componente, mai degrabă decât o singură componentă, în PE [22-24]. Cu toate acestea, un număr limitat de constituenți nu poate reflecta PE în ansamblu. Cu toate acestea, determinarea tuturor componentelor din PE este imposibilă. În plus, dacă diverse componente din PE prezintă caracteristici de transport complet diferite, caracteristicile de transport holistice ale PE vor fi dificil de identificat.

În anii 1990, sistemele de biotestare au fost utilizate pentru a evalua TR al agenților antimicrobieni [25]. Până în 2005, Eguchi și colegii săi [26] au evaluat activitatea antioxidantă a extractului de morcov utilizând medii BL din celule Caco-2 diferențiate; această abordare este mai potrivită pentru a reflecta situațiile in vivo.

Pe baza unui raport anterior al activității PhGs [9] și a rezultatelor noastre (Fig. 2), TR de AIG în PRE poate fi evaluat prin determinarea capacității antioxidante totale a mediului în camera receptorului. După experimentele de transport, am constatat că TR-ul PRE a fost similar în ambele direcții, iar acest transport a fost nesaturat și slab absorbit ('Papp < ​​1.0="" ×="" 10–6="" cm/s)="" [3]="" și="" nu="" a="" indicat="" efluxul,="" sugerând="" că="" difuzia="" pasivă="" în="" josul="" unui="" gradient="" de="" concentrație="" este="" principalul="" mecanism="" de="" transport="" al="" pre="" (fig.="" 5).="" în="" plus,="" caracteristicile="" de="" transport="" ale="" pre="" sunt="" în="" concordanță="" cu="" cele="" ale="" ac,="" is="" și="" ec,="" componentele="" eficiente="" care="" prezintă="" activitate="" antioxidantă="" în="" pre="" (fig.="" 4="" și="" tabelul="" 4).="" acest="" rezultat="" a="" fost="" așteptat="" și="" a="" indicat="" că="" sistemul="" de="" analiză="" biologică="" actual="" este="" adecvat="" și="" de="" încredere="" pentru="" evaluarea="" caracteristicilor="" de="" transport="" ale="" aig="" în="" pre="" în="" celulele="" caco-2="">

Spre deosebire de valoarea canonică Papp, care este folosită în mod obișnuit pentru a reflecta transportul unui singur compus, „valoarea Papp obținută din TR bazată pe curba concentrație-efect poate reflecta nu numai componentele care penetrează monostraturile cu o structură intactă, dar implică, de asemenea, alți factori legați de activitatea țintă, cum ar fi metaboliții componentelor, produșii degradați chimic și chiar unele citokine secretate de celulele Caco-2 ca răspuns la stimularea care poate afecta bioactivitatea țintă. Astfel, multifactorul menționat mai sus, mai degrabă decât doar componentele intacte transportate, determină „valoarea Papp”. Prin urmare, „Papp se poate corela mai puternic în situațiile Vivo decât valoarea canonică Papp [26]. În acest studiu, am clarificat natura difuză pasiv și slab absorbită a PRE pe baza valorii sale Papp, iar această natură poate fi legată de doza mare și perioada lungă de tratament clinic al CD [27]. Cu toate acestea, aceste constatări vor oferi îndrumări mai sistematice pentru clinicieni în aplicarea CD atunci când au fost identificate numai caracteristicile de transport ale majorității AIG în CD, nu numai PhGs.

Cu toate acestea, elementul de bioactivitate selectat trebuie să fie suficient de sensibil pentru a fi detectat în mediul camerei receptor, ceea ce reprezintă o provocare pentru stabilirea unui sistem de biotestare pentru a evalua caracteristicile de transport ale PE. În plus, bioactivitatea ar trebui să depindă și de cât mai multe componente posibil. În studiul nostru, analiza capacității totale antioxidante a fost mai adecvată decât alte câteva metode (S1 Fig.). Dar chiar și așa, testul nostru poate detecta TR-ul PRE doar la 120 min.

În mod colectiv, prezentul studiu a stabilit un nou sistem de biotestare pentru a evalua permeabilitatea intestinală a PRE în celulele Caco-2 diferențiate. Rezultatele obținute au arătat că o difuzie pasivă slab absorbită pe un gradient de concentrație fără eflux este principalul mecanism de transport al PRE (Fig. 5), care oferă baza farmacocinetică pentru aplicarea clinică a PhG în CD. Utilizarea unui nou sistem de biotestare pentru a evalua TR și, prin urmare, pentru a calcula „valorile Papp pentru a evalua proprietățile de transport intestinal a AIG în PE este în mod clar fezabilă. Această abordare poate fi potrivită și pentru alte PE, având în vedere bioactivitatea adecvată

informatii justificative

S1 Fig. Efectele PRE asupra (A) anion superoxid, (B) radical hidroxil, (C) produs de peroxidare a lipidelor și (D) radical DPPH. Procedurile de testare au fost efectuate conform rapoartelor anterioare [1, 2] fără a utiliza tampon de transport. Valorile IC50 (50 la sută concentrație de inhibare) și SC50 (50 la sută concentrație de captare) au fost calculate pe baza curbelor standard concentrație-răspuns. (DOCX)

Contribuții ale autorului

Am conceput și proiectat experimentele: YG XC YQ. Au efectuat experimentele: YG CZ FL LF RC YS. S-au analizat datele: CZ YG YQ. Reactivi/materiale/instrumente de analiză contribuite: RC. A scris lucrarea: YG YQ

Departamentul Centrului de Cercetare pentru Farmacologie și Toxicologie, Institutul de Dezvoltare a Plantelor Medicinale, Academia Chineză de Științe Medicale și Colegiul Medical al Uniunii Peking, Beijing, PR China,

Universitatea de Medicină Chineză din Heilongjiang, Harbin, Heilongjiang, PR China