AbstractDeși îmbătrânirea este cel mai mare factor de risc pentru bolile cronice umane (cancer, diabetic, cardiovascular și neurodegenerative), puține intervenții sunt cunoscute în afară de restricția calorică și un număr mic de medicamente (cu efecte secundare substanțiale) care abordează direct îmbătrânirea. Astfel, există o nevoie urgentă de noi opțiuni care, în general, pot întârzia procesele de îmbătrânire și pot preveni bolile legate de îmbătrânire. Îmbătrânirea celulară este baza proceselor de îmbătrânire. Durata de viață cronologică (CLS) a drojdiei Saccharomyces cerevisiae este sistemul model bine stabilit pentru investigarea intervențiilor îmbătrânirii celulare post-mitotice umane. CLS este definit ca numărul de zile în care celulele rămân viabile într-o fază staționară. Am dezvoltat o metodă cantitativă nouă, ieftină și rapidă pentru măsurarea CLS în culturi celulare incubate împreună cu diverși agenți chimici și controale pe 96-plăci de godeuri. Protocolul nostru PICLS cu (1) utilizarea de iodură de propidiu pentru citirea supraviețuirii celulelor pe bază de fluorescentă într-un cititor de microplăci și (2) măsurarea numărului total de celule prin absorbția OD600nm de pe aceeași placă oferă o capacitate reală de mare debit. În funcție de logistică, un număr mare de plăci pot fi procesate în paralel, astfel încât screening-ul a mii de compuși să devină fezabilă într-un timp scurt. Metoda a fost validată prin măsurarea efectului rapamicinei și restricției calorice asupra CLS drojdiei. Am folosit această abordare pentru screening-ul agenților chimici. Am descoperit potențialul anti-îmbătrânire/neuroprotector al 2,5-anhidro-D-manitol (2,5-AM) și am sugerat utilizarea lui individual sau în combinație cu alte intervenții antiîmbătrânire.

Glicozidul cistanchei poate crește, de asemenea, activitatea SOD în țesuturile inimii și hepatice și poate reduce semnificativ conținutul de lipofuscină și MDA din fiecare țesut, eliminând eficient diferiți radicali reactivi de oxigen (OH-, H₂O₂ etc.) și protejând împotriva daunelor cauzate de ADN. de radicalii OH. Glicozidele feniletanoide Cistanche au o capacitate puternică de captare a radicalilor liberi, o capacitate de reducere mai mare decât vitamina C, îmbunătățește activitatea SOD în suspensia de spermă, reduc conținutul de MDA și au un anumit efect protector asupra funcției membranei spermatozoizilor. Polizaharidele Cistanche pot spori activitatea SOD și GSH-Px în eritrocite și țesuturi pulmonare ale șoarecilor senescenți experimental cauzate de D-galactoză, precum și pot reduce conținutul de MDA și colagen în plămâni și plasmă și pot crește conținutul de elastină, au un bun efect de curățare asupra DPPH, prelungește timpul de hipoxie la șoarecii senescenți, îmbunătățește activitatea SOD în ser și întârzie degenerarea fiziologică a plămânilor la șoarecii senescenți experimental. Cu degenerarea morfologică celulară, experimentele au arătat că Cistanche are o bună capacitate antioxidantă. și are potențialul de a fi un medicament pentru prevenirea și tratarea bolilor de îmbătrânire a pielii. În același timp, echinacozidul din Cistanche are o capacitate semnificativă de a elimina radicalii liberi DPPH și are capacitatea de a elimina speciile reactive de oxigen și de a preveni degradarea colagenului indusă de radicalii liberi și, de asemenea, are un efect de reparare bun asupra daunelor anionilor de radicali liberi de timină.

Faceți clic pentru a vedea produse anti-îmbătrânire

【Pentru mai multe informații: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Cuvinte cheieSaccharomyces cerevisiae · Durată de viață cronologică · Screening chimic · Compus antiîmbătrânire · 2,5-anhidro-D-manitol

Introducere

The growing fraction of the elderly (>65 de ani) în rândul populației totale (de la ~ 10 la sută la nivel mondial (peste 20 la sută în țările din prima lume) în 2020 la 16 la sută extrapolată în 2050), precum și creșterea speranței de viață a acestora (cu ~ 10 ani din 1960 în țările din prima lume). ), confruntă lumea cu probleme din ce în ce mai dificile [1, 2]. Pe lângă reducerea generală a activității de viață, îmbătrânirea rămâne cel mai mare factor de risc pentru dezvoltarea bolilor cronice care, ulterior, compromit viața umană independentă și duc în final la deces [3–7]. Abordările medicale actuale pentru prevenirea patologiilor legate de vârstă sunt recomandări pentru un stil de viață sănătos, inclusiv exerciții fizice și dietă. Cu toate acestea, aceste intervenții singure nu sunt suficiente pentru a preveni apariția bolilor legate de vârstă.

Îmbătrânirea se caracterizează printr-o pierdere progresivă a integrității fiziologice, a eficienței funcțiilor celulare și a semnalizării metabolice [8]. Eforturile crescânde sunt îndreptate spre înțelegerea proceselor de îmbătrânire celulară care afectează rețeaua de interacțiuni gene și proteine ​​extrem de interconectate și redundante funcțional [8, 9]. În ciuda complexității îmbătrânirii, cercetările recente în diferite sisteme model, inclusiv mamifere, au demonstrat că îmbătrânirea întârziată și creșterea duratei de sănătate sunt fezabile prin intervenții anti-îmbătrânire, cum ar fi aplicarea de administrare a medicamentelor cu rapamicin și restricția de calorii (glucoză) [10-15]. Prin urmare, extinderea repertoriului de compuși anti-îmbătrânire care pot fi utilizați ca terapii geroprotectoare și reducerea efectelor secundare nedorite ale acestora este una dintre strategiile promițătoare care pot întârzia îmbătrânirea și prelungi durata sănătății.

Cercetări recente au arătat că mecanismele moleculare observate în îmbătrânirea umană sunt conservate în diferite organisme, inclusiv în drojdiile unicelulare [8, 10, 16, 17]. Drojdia în devenire Saccharomyces cerevisiae este unul dintre cele mai studiate organisme model pentru descoperirea proceselor biologice implicate în îmbătrânirea celulară. Beneficiile studierii îmbătrânirii în drojdii includ un timp scurt de generare, o durată de viață manevrabilă și capacitatea sa de analize cu randament ridicat. Prin urmare, acest organism a devenit un instrument puternic pentru identificarea intervențiilor anti-îmbătrânire. Drojdia este folosită în mod obișnuit pentru a studia îmbătrânirea în două moduri distincte: durata de viață replicativă (RLS) și durata de viață cronologică (CLS) [18]. RLS măsoară de câte ori o celulă individuală se divide, un model de îmbătrânire pentru celulele mitotice, cum ar fi celulele stem. CLS măsoară durata de timp în care o celulă nedivizată rămâne viabilă în faza staționară, un model de îmbătrânire pentru celulele post-mitotice, cum ar fi neuronii. Viabilitatea celulelor de drojdie îmbătrânite în condiții de fază staționară lipsite de nutrienți scade și în cele din urmă mor.

CLS a fost măsurat în mod tradițional prin estimarea numărului de unități formatoare de colonii (CFU) pe placa de agar [18]. Celulele de drojdie dintr-un balon cu mediu total (mai mare sau egal cu 20 ml) sunt expuse la un singur compus chimic. La diferite momente de timp (de exemplu, după 2, 5 și 8 zile), alicote mici din cultura de îmbătrânire cronologică din fask sunt diluate în serie, placate pe plăci cu agar nutritiv și incubate timp de 2-3 zile pentru formarea și numărarea coloniilor. Fracția de supraviețuire se determină din CFU pentru fiecare punct de vârstă cronologic în raport cu ziua 1 (considerată supraviețuire celulară 100%). Abordarea CFU este cantitativă, dar asociată cu multe dezavantaje. Necesită diluții în serie multiple, etape de placare și perioade de incubație pentru apariția coloniilor. Numărarea coloniilor se realizează fie cu instrumente manuale, fie cu instrumente scumpe. Mai mult, această metodă este nepotrivită și mult prea costisitoare pentru screening-ul cu randament mare (HTS) a mii de compuși, deoarece necesită cantități substanțiale de medicamente testate, culturi în balon de volum mare și multe plăci de agar. Din păcate, metoda CFU și toate variantele recente pentru măsurarea CLS depind în mod critic de capacitatea celulelor post-mitotice de a reintra în faza mitotică. În principiu, această metodologie nu poate distinge drojdia în stop mitotic de celulele moarte.

Progresele tehnice actuale în metodele derivate din CFU măsoară supraviețuirea și creșterea celulelor pe baza creșterii drojdiei în fază staționară expusă la medicamente în culturi bogate în nutrienți, fie într-un mediu lichid, fie printr-un test de spotting pe o placă de agar [17, 19-21] . După 24 de ore, creșterea celulelor îmbătrânite în mediu lichid este măsurată prin absorbanța la OD600nm, în timp ce în testul de spotting, creșterea culturii îmbătrânite pete pe mediul de agar este identificată vizual după 48 de ore. Îmbunătățirea logistică include utilizarea de 96-plăci de godeuri care permit screening-ul limitat al tulpinilor cu deleție chimică sau la nivel de genom. Pentru tulpinile de deleție de drojdie marcate grupate, citometria în flux este necesară pentru a cuantifica viabilitatea tulpinii individuale [22].

Iodura de propidiu (PI) este un colorant fluorescent care intră doar în celulele moarte și, prin urmare, este un marker puternic pentru cuantificarea directă a viabilității celulare [23-25]. Anterior, studiile au folosit o abordare bazată pe PI pentru măsurarea CLS și cuantificarea viabilității celulelor prin analizarea imaginilor achiziționate de un contor de celule fluorescente, transiluminator UV sau citometrie în flux [26, 27]. Cu toate acestea, cerințele multiple de procesare a eșantioanelor, imagistică și software pentru analiza datelor sunt costisitoare și consumatoare de timp, ceea ce a împiedicat aceste metode în aplicațiile reale de mare debit. Introducerea coloranților alternativi, cum ar fi verdele SYTOX, are o valoare limitată într-un cadru cu randament ridicat din cauza costurilor prohibitive [26].

Prin urmare, sunt necesare noi metode pentru a cuantifica viabilitatea celulei îmbătrânite pentru a evita limitările asociate metodologiilor existente. În această lucrare, descriem PICLS, o metodă de măsurare CLS bazată pe PI care este independentă de creștere. Noua noastră abordare se bazează pe incubarea celulelor de drojdie cu diferiți compuși de testare sau pe diferite condiții de mediu de testare în 96-plăci de godeuri. Folosim PI pentru a cuantifica supraviețuirea celulară. Citirea rapidă și eficientă (în termen de ~ 15 minute) este asigurată de un cititor de microplăci, un dispozitiv cu costuri reduse, ușor disponibil în majoritatea laboratoarelor. Această metodologie ieftină este potrivită pentru screening-ul pe scară largă a agenților chimici pentru a identifica compușii anti-îmbătrânire, deoarece mulți compuși diferiți, controale sau diluții pot fi plasați în mod convenabil pe o singură placă și un număr mare de plăci pot fi procesate în paralel. În plus, ne-am validat metoda prin determinarea extinderii CLS a drojdiei folosind intervenții anti-îmbătrânire cunoscute, cum ar fi administrarea de rapamicină și restricția calorică. O analiză rapidă a substanțelor chimice disponibile în laboratorul nostru a dezvăluit în mod neașteptat 2,5-anhidro-D-manitol (2,5-AM) prelungind durata de viață a drojdiei. De asemenea, am confirmat activitatea antiîmbătrânire a 2,5-AM cu metode tradiționale de excrescere. Alți analogi de zahăr testați nu au produs niciun efect similar.

Rezultate

Dezvoltarea unei metode de cuantificare a viabilității celulare folosind măsurarea fluorescenței iodurei de propidiu în cititorul de microplăci

Noul nostru protocol începe cu expunerea celulelor de drojdie de tip sălbatic sau a mutanților acestora plasate în medii bogate în nutrienți în 96-plăci de godeuri împreună cu o concentrație specifică de compuși chimici de interes. Folosim PI ca marker pentru moartea celulelor, deoarece acest colorant fluorescent intră doar în celulele care nu supraviețuiesc [23–25]. Viabilitatea celulară în cultura în fază staționară este cuantificată după un număr specificat de zile prin citirea fluorescenței PI în cititorul de microplăci care, la rândul său, oferă o foaie de calcul citibilă electronic pentru analiza datelor.

Ca o primă validare, arătăm că lucrul cu cantități mici în godeurile de microplăci oferă rezultate similare cu abordările bazate pe cuve și că cititorul de microplăci este suficient de sensibil pentru a captura datele de supraviețuire a celulelor. Astfel, am analizat colorarea PI a celulelor de drojdie. Celulele de drojdie au fost crescute în balonul de sticlă și au fost fierte timp de 15 minute la 100 grade. Celulele vii și moarte au fost spălate și incubate în 1 x PBS (soluție salină tamponată cu fosfat) fără și cu PI (5 pg/ml) timp de 15 min. După incubare, celulele au fost spălate și resuspendate în PBS. Celulele au fost vizualizate prin microscopie și intensitatea fluorescenței a fost măsurată de cititorul de microplăci (Fig. S1 suplimentară). După confirmarea faptului că PI este un marker adecvat pentru moartea celulelor, a fost efectuată o analiză ulterioară pentru dezvoltarea metodei. Celulele moarte colorate cu PI au fost resuspendate în PBS până la 48 OD600nm finale măsurate în cuvă folosind un spectrofotometru. Apoi, celulele au fost diluate în serie în PBS (OD600nm 48 până la 0,05) și transferate pe o placă neagră 96-godeuri (costar 3603). De remarcat, microplăcile negre sunt de patru ori mai scumpe decât plăcile transparente și mai puțin ușor disponibile, dar le-am folosit, deoarece sunt mai potrivite pentru citirea fluorescenței datorită autofluorescenței de amortizare care provine din probe și suprafețele microplăcilor. Cu un sistem de imagistică GelDoc (Fig. 1A), am vizualizat gradul de încorporare a colorării PI în celulele moarte de drojdie la diferite diluții. Folosind aceeași placă, am măsurat intensitatea fluorescenței PI cu un cititor de microplăci la excitație 535 nm și emisie 617 nm lungimi de undă. Am găsit o corelație liniară ridicată între intensitatea fluorescenței PI și absorbanța celulară la OD600nm (Fig. 1B). Acest rezultat indică faptul că varianta noastră a metodei bazate pe fluorescența PI este eficientă pentru cuantificarea viabilității celulare.

As a next step, we determined the optimal range of cell density (quantified by OD600nm) so that cell density could be directly measured in 96-well   plates instead of in cuvettes. Using the black microplates with dead yeast cells from the previous experiment, we determined the correlation of  OD600nm measurements taken from the cuvettes and from the microplate directly. We found a high linear correlation between the two series of measurements in the OD600nm range of 0.05 to 12 of the cuvette (Fig.  1C). However, the trend is no longer maintained for higher OD600nm values>12 a cuvei (Fig. 1D). Apoi, am determinat relația dintre intensitatea fluorescenței PI și celula OD600nm a plăcii de godeuri 96-în intervalul optim OD600nm 0,05-12. Observăm o corelație liniară aproape perfectă (Fig. 1E). Astfel, protocolul nostru reprezintă o metodă robustă pentru cuantificarea viabilității celulare.

Efectul tipurilor de microplăci asupra cuantificării viabilității celulelor utilizând măsurarea fluorescenței iodurei de propidiu în cititorul de microplăci

Efectul rapamicinei asupra duratei de viață cronologice a drojdiei

Rapamicina este una dintre binecunoscutele intervenții anti-îmbătrânire demonstrată pentru a prelungi durata de viață a mai multor organisme model, inclusiv drojdie, nematode, muște de fructe și șoareci [10, 14, 15, 28-30]. Inhibă complexul de detectare a nutrienților TORC1 (ținta complexului 1 de rapamicină). TORC1 este un complex conservat de proteine ​​multi-subunități în celulele eucariote care cuplează nutrienții din mediu cu creșterea și proliferarea celulelor [19, 29, 31-34].

Am examinat efectul rapamicinei asupra duratei de viață cronologice (CLS) a tulpinii de drojdie pentru a valida protocolul nostru nou dezvoltat. Aici și mai jos, am folosit tulpina de drojdie prototrofică (CEN.PK113- 7D) în experimentele noastre pentru a evita efectele puternice ale auxotrofiei aminoacizilor asupra supraviețuirii celulelor în cultura în fază staționară [35, 36]. Celulele au fost îmbătrânite cu diferite concentrații de rapamicină în mediul definit sintetic (SD). Creșterea celulară a fost măsurată la diferite momente de timp (24 ore, 48 ore și 72 ore). Am descoperit că creșterea celulară a atins saturația la aproximativ 24 de ore după incubare cu rapamicină 5 nM sau mai puțin (Fig. 4A). Cu toate acestea, administrarea de rapamicin 10 nM a încetinit creșterea celulelor și saturația a fost atinsă numai după 48 de ore (Fig. 4A). Anterior, o tendință similară a fost observată pentru celulele care cresc cu rapamicină într-un experiment CLS [37].

Ca o etapă următoare, a fost măsurat CLS al celulelor crescute în diferite concentrații de rapamicină. Am determinat supraviețuirea celulei folosind fluorescența PI la diferite momente de vârstă cronologică. Timpul de creștere 72 h a fost considerat ziua 1. Din graficul de supraviețuire putem deduce că diferite concentrații de adiție de rapamicină extind CLS de drojdie (Fig. 4B). Supraviețuirea celulelor îmbătrânite suplimentate cu rapamicină (5 nM și 10 nM) în ziua 4 a fost de ~75 la sută; cu toate acestea, fără rapamicin a fost de ~ 50 la sută. În ziua 7, supraviețuirea celulelor îmbătrânite suplimentate cu rapamicină a fost de 70 la sută; cu toate acestea, fără rapamicin a fost redusă la mai puțin de 20 la sută. Extensia CLS a celulelor îmbătrânite poate fi observată și la concentrații mai mici (0,62–2,5 nM) de rapamicină (Fig. 4B).

Am validat protocolul nostru comparându-l direct cu două abordări tradiționale care măsoară CLS-ul drojdiei. În primul rând, am efectuat testul excrescenței în mediu lichid pentru a măsura efectul rapamicinei asupra duratei de viață. Supraviețuirea celulelor de îmbătrânire cronologică a fost monitorizată la diferite puncte de vârstă prin transferul unei culturi de 3-µl în 200 µL de mediu YPD într-o placă proaspătă de 96-godeuri. Excreșterea corespunde numărului de celule viabile din inocul (Fig. 4C). Creșterea celulelor îmbătrânite înregistrată prin absorbanța OD600nm a fost determinată folosind un cititor de microplăci. Fracția de supraviețuire a fost calculată din absorbanța OD600nm de creștere pentru fiecare punct de vârstă relativ la ziua 1 (considerată supraviețuire celulară de 100%). Graficul de supraviețuire este prezentat în Fig. 4D.

De asemenea, am condus excrescența prin testarea spotting pe mediul de agar. Am observat 3-µl cultură de îmbătrânire pe placa de agar YPD și am incubat-o timp de 48 de ore. Creșterea celulelor îmbătrânite pe placa de agar YPD a fost vizualizată de sistemul de imagistică GelDoc (Fig. 4E). Așa cum era de așteptat, putem observa tendințe de extindere a duratei de viață de către rapamicină atât în ​​testele YPD lichide, cât și în excesul de agar, care sunt paralele cu cele determinate cu noul nostru protocol.

Aceste rezultate arată că protocolul nostru HTS reproduce faptul că rapamicina prelungește durata de viață celulară. Mai mult, evaluăm factorul Z pentru a evalua calitatea acestei metode [38]. În general, factorii Z în intervalul 0.5–1.0 indică testele HTS excelente. Factorul Z a fost determinat pentru diferite concentrații de rapamicină cu fluorescență PI a celulelor îmbătrânite (Fig. S2 suplimentară). Finanțarea noastră, un factor Z {{10}},70 pentru rapamicina 5 nM și 0,74 pentru rapamicina 10 nM plasează această metodă HTS în categoria de înaltă calitate. Astfel, protocolul nostru este suficient de robust pentru a identifica potențialii compuși anti-îmbătrânire.

Pentru a explora dacă metoda este eficientă într-un fundal genetic diferit de drojdie, am testat efectul rapamicinei asupra CLS al tulpinii BY4743. Tulpina Saccharomyces cerevisiae BY4743 este auxotrofa pentru histidina, leucina si uracil. Tulpina BY4743 a fost crescută în diferite concentrații de rapamicină în mediul SD suplimentat cu constituenți auxotrofici. Supraviețuirea celulelor îmbătrânite a fost cuantificată folosind fluorescența PI (Fig. S3 suplimentară). Am descoperit că rapamicina a crescut cantitativ viabilitatea celulelor BY4743 în moduri similare cu cea a CEN.PK113-7D. Astfel, aceste rezultate arată că metoda noastră este eficientă în diferite tulpini de drojdie.

Efectul glucozei asupra duratei de viață cronologice a drojdiei

De asemenea, am validat metoda noastră examinând efectul restricției calorice asupra duratei de viață cronologice a drojdiei. Restricția calorică este una dintre intervențiile stabilite pentru a întârzia îmbătrânirea și a prelungi durata de viață în organismul model, inclusiv în celulele de drojdie și de mamifere [11, 13, 16]. Pentru a determina efectul restricției calorice asupra CLS al drojdiei, reducem conținutul de glucoză din mediul de cultură. Am crescut celula în trei condiții diferite de mediu SD care conțin 0,25%, 0,5% și 2% glucoză. Am măsurat creșterea celulelor în diferite momente de timp (24 ore, 48 ore și 72 ore). Toate culturile au atins saturația de creștere după 24 de ore (Fig. 5A). Creșterea celulară a fost mai mică la 0,25% și 0,5% comparativ cu 2% glucoză (Fig. 5A). Am măsurat supraviețuirea îmbătrânirii cronologice pentru celulele crescute în diferite concentrații de glucoză folosind metoda fluorescenței PI (Fig. 5B). Deducem din graficul de supraviețuire că restricția de glucoză extinde CLS al drojdiei. De asemenea, am confirmat concomitent extinderea CLS prin teste de creștere (Fig. 5C, D și E), validând în continuare noua noastră metodă pentru determinarea CLS al drojdiei. Efectul restricției de glucoză asupra extensiei CLS a tulpinii BY4743 a fost, de asemenea, demonstrat prin metoda PICLS (Fig. S3 suplimentară). Astfel, abordarea noastră pentru măsurarea CLS al drojdiei reprezintă o metodă nouă, rapidă și ieftină pentru screening-ul agenților chimici și condițiile de cultură pentru a identifica intervențiile anti-îmbătrânire.

Screeningul agenților chimici folosind metoda nou dezvoltată a identificat 2,5-anhidru-D-manitol ca un nou compus anti-îmbătrânire

După dezvoltarea și validarea noului protocol, am folosit această metodă pentru a analiza sute de agenți chimici pentru identificarea compușilor anti-îmbătrânire (Fig. S4 suplimentară și Tabelul suplimentar 1). Ca unul dintre rezultatele surprinzătoare, am găsit indicații pentru compusul 2, 5-anhidro-D-manitol (2,5-AM) pentru a extinde CLS al drojdiei. În Fig. 6, prezentăm rezultatul experimentelor detaliate de urmărire pentru acest compus. Am testat activitatea antiîmbătrânire a 2,5-AM la diferite concentrații pe placa de 96-godeuri. În primul rând, am determinat efectul 2,5-AM asupra creșterii celulelor. Celulele de drojdie au fost incubate cu concentrații diferite de 2,5-AM în mediu SD. Creșterea celulară a fost măsurată la diferite momente de timp (24 ore, 48 ore și 72 ore). Am descoperit că creșterea celulelor a atins același nivel de saturație după 24 de ore pentru toate concentrațiile testate de 2,5-AM (Fig. 6A). Apoi, am măsurat supraviețuirea celulelor îmbătrânite cronologic suplimentate cu diferite concentrații de 2,5-AM folosind metoda fluorescenței PI. Ca și anterior, cultura de creștere de 72 de ore a fost considerată ziua 1 pentru analiza CLS. Graficul de supraviețuire este reprezentat grafic pentru diferite momente cronologice ale vârstei (Fig. 6B). Constatăm că 2,5-AM extinde CLS într-o manieră dependentă de concentrație. Supraviețuirea celulelor îmbătrânite suplimentate cu 2,5-AM (8 mM) în ziua 4 a fost de ~ 80 la sută; cu toate acestea, fără 2,5- AM a fost de ~ 50 la sută . În ziua 7, supraviețuirea a 2,5-AM suplimentat celule îmbătrânite a fost de ~ 75 la sută; cu toate acestea, fără 2,5-AM a fost redusă la mai puțin de 20 la sută . Activitatea anti-îmbătrânire a 2,5-AM a fost, de asemenea, verificată prin teste de excrescență (Fig. 6C, D și E).

2,5-AM este o moleculă de zahăr care poate intra pe calea glicolizei. Este hidrolizat numai în etapele glicolitice din amonte care provoacă acumularea de 2,5-AM{-1,6-bifosfat (2,5-AMBP) nemetabolizat în celule [39–41 ]. Pentru a testa dacă 2,5-AM la concentrații similare cu experimentul CLS a fost procesat de enzimele de glicoliză, am examinat sensibilitatea tot mai mare a tulpinii de deleție a genei SNF1. SNF1 este un senzor de energie celulară și protein kinază activată de AMP (AMPK) foarte conservată la eucariote [42, 43]. Celulele de drojdie care nu au activitate AMPK sunt asociate cu un fenotip de creștere hipersensibil în prezența intermediarilor glicolitici nemetabolizați [44]. Am măsurat creșterea tulpinii cu deleție snf1Δ cu diferite concentrații de 2,5-AM. Am descoperit că 2,5-AM inhibă creșterea tulpinii cu deleție snf1Δ în comparație cu tulpina de tip sălbatic (Fig. S5 suplimentară). Acest fenotip de creștere observat indică faptul că 2,5-AM suferă glicoliză și este hidrolizată în intermediari glicolitici nemetabolizați.

2,5-AM este un analog al fragmentului de zahăr fructoză [39]. Pentru a clarifica dacă alte zaharuri influențează și CLS, am examinat efectul fructozei, manitolului și maltozei asupra îmbătrânirii drojdiei. Am inclus, de asemenea, sorbitol, care este un zahăr nemetabolizat raportat că crește CLS celulelor de drojdie prin creșterea osmolarității mediului de cultură [20, 45]. În primul rând, am testat efectul fructozei, manitolului, maltozei și sorbitolului asupra creșterii celulelor. Celulele de drojdie au fost incubate cu diferite concentrații de fructoză, manitol, maltoză și sorbitol similare cu 2,5-AM în mediul SD. Ca 2,5-AM, celulele incubate cu fructoză, manitol, maltoză și sorbitol au atins saturația de creștere după 24 de ore (Fig. 7A). Apoi, am măsurat supraviețuirea celulelor îmbătrânite cronologic în ziua 1, ziua 7, ziua 14 și ziua 21. Spre deosebire de 2,5-AM, suplimentarea cu fructoză, manitol, maltoză și sorbitol nu a prelungit durata de viață a drojdie (Fig. 7B, C, D, E și Fig. S6 suplimentară). În mod remarcabil, 2,5-AM prelungește durata de viață chiar și în etapa târzie a îmbătrânirii cronologice. Celulele îmbătrânite suplimentate cu 2,5-AM (8 mM) supraviețuiesc (~65 la sută ) în ziua 21. Cu toate acestea, supraviețuirea celulelor îmbătrânite fără suplimentarea cu 2,5-AM a fost mai mică de 10 la sută .

Spre surprinderea noastră, am constatat că sorbitolul la concentrații scăzute testate nu poate crește CLS (Fig. 7B, C, D, E și Fig. S6 suplimentară). Am emis ipoteza că ar putea fi necesare concentrații mai mari de sorbitol pentru a crește CLS. Am testat o gamă de concentrații mai mari, inclusiv 1 M sorbitol, concentrația raportată anterior că afectează CLS (18% echivalent cu 1 M) [20, 45]. În concordanță cu rapoartele anterioare, constatăm, de asemenea, că concentrațiile foarte mari de sorbitol (între 0,5 și 1 M) măresc CLS al drojdiei (Fig. suplimentară S7), aparent prin creșterea osmolarității mediului. Interesant, creșterea CLS cu 2,5-AM la o concentrație foarte scăzută (2 mM) sugerează că mecanismul său de activitate antiîmbătrânire este diferit de cel osmotic. Aceste rezultate sugerează că activitatea anti-îmbătrânire a 2,5-AM este specifică acestui compus de zahăr și nu este observată pentru alte câteva substanțe chimice structurate similar.

【Pentru mai multe informații: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】