Proteaza Calpain2a limitează imunitatea înnăscută prin țintirea TRAF6 în peștele teleost

Factorul 6 asociat receptorului TNF (TRAF6) joacă un rol cheie de transducție a semnalului atât în ​​căile de semnalizare antibacteriene cât și antivirale. Cu toate acestea, mecanismele de reglementare ale TRAF6 la vertebratele inferioare sunt mai puțin raportate. În acest studiu, identificăm calpaina2a, ca membru al familiei de proteaze dependente de calciu, cu activitate enzimatică hidrolitică unică și funcționează ca un regulator cheie pentru imunitatea antibacteriană și antivirală la peștii teleost. La stimularea cu lipopolizaharide (LPS), distrugerea calpainei 2a promovează reglarea în sus a citokinelor inflamatorii. Din punct de vedere mecanic, calpaina2a interacționează cu TRAF6 și reduce nivelul proteic al TRAF6 prin hidrolizare. După pierderea activității enzimatice, calpaina2a mutantă inhibă competitiv formarea de dimeri și auto-ubiquitinarea TRAF6. Eliminarea calpainei 2a promovează, de asemenea, răspunsul antiviral celular. Calpaina2a mutantă care nu are activitate de hidrolază reprimă ubiquitinarea factorului de reglare a IFN (IRF) 3/7 din TRAF6. Luate împreună, aceste descoperiri clasifică calpaina2a ca un regulator negativ al răspunsurilor imune înnăscute prin țintirea TRAF6 la peștii teleost.

cistanche tubulosa-imbunatateste sistemul imunitar

Fiind prima linie de apărare împotriva agenților patogeni invadatori, imunitatea înnăscută exercită un rol important în protejarea organismului împotriva invaziei bacteriene și a infecțiilor virale. Receptorii de recunoaștere a modelelor (PRR) de pe membrană recunosc imediat modelele moleculare asociate patogenului (PAMP) 1-3. Cele trei PRR-uri cele mai studiate în imunitatea înnăscută sunt receptorii Toll-like (TLR), receptorii RIG-I-like (RLR) și receptorii NOD-like (NLR), care recunosc diferite PAMP-uri și declanșează cascade de semnal pentru a activa citokinele proinflamatorii și factor antiviral4-6. Factorul asociat receptorului TNF (TRAF) 6 este o parte indispensabilă a luptei împotriva invaziei bacteriene și a infecțiilor virale. Ca o cale de semnal importantă activată de lipopolizaharidă (LPS), calea factorului de transcripție nucleară-kB (NF-kB) a fost cartografiată în detaliu. Cele mai multe dintre funcțiile proteinei din calea de semnalizare NF-κB au fost studiate pe larg1,7. Factorul de diferențiere mieloid 88 (MyD88) este mai întâi activat de TLR ca răspuns la LPS, iar IRAK4 acționează ca un mediator prin activarea IRAK1 și IRAK2, care leagă MyD88 de TRAF68-11. Ubc13 și Uev1A catalizează ubiquitinarea legată de K63-a TRAF6, care transferă lanțul de ubiquitină K63 la TAB2 și TAB3, ducând la activarea TAK112-16. Activatorul 2 IKK reglat TRAF6-(TRIKA2) care este compus din TAK1, TAB1 și TAB2, activează inhibitorul IκB kinazei (IKK) / fosforilarea17-19. Factorul de transcripție NF-κB intră în nucleu și promovează producerea de citokine inflamatorii20. Când TLR7/9 recunoaște virusul, complexul MyD88- IRAKs-TRAF6 transmite semnale către factorul de reglare IFN (IRF) 7, promovează ubiquitinarea IRF7 și activează fosforilarea acestuia în nucleu21,22. În calea de semnalizare RLR, RIG I și gena 5 asociată diferențierii melanomului (MDA5) activează proteina de semnalizare antivială mitocondrială (MAVS)23,24. Agregarea MAVS este o caracteristică importantă a începutului transmisiei semnalului RLR23,25,26. TRAF2/3/6 sunt primii factori activați de MAVS27,28. TRAF3 va activa semnalizarea TBK1-IRF3, iar complexul MAVS-TRAF6 va activa semnalizarea NF-κB, care promovează expresia IFN{-127,29.

cistanche beneficii pentru bărbați-întărește sistemul imunitar

Mecanismul molecular al activării TRAF6 a fost deja demonstrat. TRAF6 sub formă de dimer suferă autoubiquitinare sub cataliza Ubc13 și Uev1A, care este legată de domeniul degetului inel și domeniul degetelor ZF. Modelul TRAF6/Ubc13~UB confirmă rolul important al dimerului TRAF6 în agregarea și transmiterea lanțului de ubiquitină K6330. În plus, s-a raportat că domeniul degetului inel și al degetelor ZF recrutează conjugați E2~ub în modelul de cristal TRAF6 de pește zebra și s-a descoperit că TRAF6 ar putea forma un heterodimer cu TRAF5 din aceeași familie TRAF pentru prima dată16. Proteinele familiei de deubiquitinare: A20, CYLD, USP2a, USP4 și USP20 vizează TRAF6 pentru a elimina ubiquitinarea legată de K63-și pentru a reduce semnalizarea în aval31–35. Sistemul cu două hibride de drojdie evaluează interacțiunea dintre UBE2O și TRAF6 și confirmă că această interacțiune afectează direct activarea TRAF6 de către MyD8836. În procesul de transducție a semnalului din aval al TRAF6, ECSIT ca proteină intermediară interacționează cu TRAF6 și, respectiv, TAK1, iar această interacțiune întărește legarea TRAF6 și TAK137. În semnalizarea TLR4 indusă de LPS, PRDX-urile împiedică TRAF6 să recruteze ECSIT pentru a furniza lanțul de ubiquitină K63 și, de asemenea, inhibă BECN1 activat de TRAF6 în calea autofagiei38. MST4 activează fosforilarea TRAF6 la Thr463 și Thr486 și inhibă dimerizarea și ubiquitinarea TRAF639. La mamifere, mecanismul de reglare a proteinei a TRAF6 a fost studiat pe scară largă în imunitatea antibacteriană și antivirală. Cu toate acestea, cercetarea TRAF6 la vertebratele inferioare este mai puțin studiată. Răspunsul imun la peștii teleost se bazează în principal pe căile TLR și RLR pentru a executa răspunsul imun după infecția cu patogen. Prin urmare, este crucial să se exploreze mecanismul de reglementare al căilor de semnalizare mediate de TRAF6-. calpaina2 (m-calpaina) este o familie de proteaze dependente de calciu, care este compusă din mai mult de 16 membri la mamifere și multe alte organisme40. Cel mai timpuriu studiu al familiei de proteine ​​calpaine este legat de mișcarea celulelor41. calpaina promovează migrarea celulelor și s-a descoperit că inhibă migrarea neutrofilelor și activarea p38 MAPK și ERK MAPK42. Activitatea hidrolazei este una dintre funcțiile importante ale calpainei. În reglarea imună, calpaina-2 promovează eliberarea de NF-kB prin hidroliza IkB și activează calea de semnalizare43. În acest studiu, am stabilit că calpaina2a interacționează cu TRAF6 și acționează ca un regulator negativ în răspunsurile antibacteriene și antivirale la peștele teleost, miiuy croaker (Miichthys miiuy). calpaina2a promovează degradarea nivelului proteinei TRAF6 prin activitatea sa de hidrolază. Între timp, calpaina2a mutantă lipsită de activitate de hidrolază inhibă formarea lanțului de ubiquitină K63 prin inhibarea dimerului TRAF6. Se reflectă că atât calpaina2a, cât și calpaina mutantă termină ubiquitinarea TRAF6 la ECSIT/ BENC1/ IRF3/ IRF7. calpain2a oprește procesul de semnalizare NF-kB și IFN prin țintirea TRAF6. Rezultatele noastre oferă o moleculă pentru studiul reglării imune mediate de TRAF6-la vertebratele inferioare.

Rezultate

calpaina2a interacționează cu TRAF6 și reglează negativ semnalizarea NF-kB.

Pentru a obține informații despre proteinele asociate TRAF6-în răspunsul imunității înnăscute la peștii teleostei, am caracterizat interatomul MIiuy croaker TRAF6 utilizând purificarea prin afinitate și spectrometria de masă. Sortați după intensitatea cuantificării fără etichete (LFQ), am interceptat o parte din date și am afișat-o (Fig. 1a). Printre proteinele asociate TRAF6-, calpaina2a poate regla activitatea TRAF6 și a afectat căile de semnalizare mediate de TRAF6-. În primul rând, ar trebui investigată relația dintre calpain2a și TRAF6 la nivel de proteine, am verificat interacțiunea calpain2a cu TRAF6 în liniile celulare de rinichi Miiuy croaker (MKC). Experimentele de coimunoprecipitare endogene au indicat că calpaina2a interacționează cu TRAF6 (Fig. 1b, c). După cum se arată în experimentele de transfecție tranzitorie și de coimunoprecipitare, calpaina2a și TRAF6 supraexprimate au interacționat între ele (Fig. 1d, e). Toate acestea indică că calpaina2a interacționează cu TRAF6 și sunt necesare experimente suplimentare pentru a investiga mecanismul acțiunii lor. Prin alinierea secvențelor multiple ale proteinelor umane, șoarece, pește-zebră și pot croaker calpain2a, calpaina2a este conservată evolutiv între pești și mamifere (Fig. 1f). Pentru a determina funcția calpain2a în imunitatea înnăscută, am examinat dacă calpaina2a a fost asociată cu activarea NF-kB indusă de stimularea LPS. Am transfectat celule de epiteliom papulosum ciprinid (EPC) cu reporter de luciferază NF-κB, reporter de luciferază renilla de control intern și vector care codifică calpain2a sau vector gol. calpain2a a redus substanțial activitatea reporterului NF-kB la stimularea LPS într-o manieră dependentă de doză (Fig. 1g). Mai mult, citokinele proinflamatorii, cum ar fi promotorul IL-1 și IL{-8 care răspund la stimularea LPS, au fost semnificativ scăzute în celulele EPC supraexprimate cu calpaina2a (Fig. 1h, i), sugerând un rol potențial pentru calpaina2a în semnalizarea inflamatorie căi induse de stimularea LPS.

cistanche tubulosa-imbunatateste sistemul imunitar

Faceți clic aici pentru a vedea produsele Cistanche Enhance Immunity

【Cereți mai multe】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Reglarea negativă a semnalizării NF-κB indusă de LPS de către calpaina2a.

Pentru a investiga rolul potențial al calpainei în semnalizarea NF-κB, am transfectat calpaina2a în MKC cu un gradient de timp al LPS și am evaluat citokinele proinflamatorii care răspund la LPS. Supraexprimarea calpainei2a a condus la reglarea în jos a expresiei IL-1, IL-8 și IL-6 (Fig. 2a). Apoi, am proiectat două ARN-uri interferente mici (siRNAs) specifice calpain2a care au reglat eficient calpaina2a (Fig. 2b, d). Eliminarea calpainei2a a îmbunătățit semnificativ citokinele proinflamatorii induse de LPS, inclusiv IL-1 și IL{-8 în liniile celulare ale intestinului croaker MKC și Miiuy (MIC) (Fig. 2c, e). În grupul de celule stimulate de LPS, distrugerea calpainei 2a a sporit proliferarea celulară. În mod similar, în absența oricărei stimulări, am constatat că distrugerea calpainei 2a a sporit și proliferarea celulară (Fig. 2f). Pentru a determina dacă calpaina2a a inhibat proteinele în semnalizarea NF-κB indusă de LPS, calpaina2a a inhibat semnificativ nivelul proteinelor endogene ale TRAF6, dar nu MyD88, IRAK4 sau TAK1 (Fig. 2g). În rezumat, cinetica calpainei 2a și expresia citokinei proinflamatorii a sugerat implicarea funcțională a calpainei 2a în semnalizarea NF-κB indusă de LPS.

Fig. 1 calpaina2a interacționează cu TRAF6 și inhibă calea de semnalizare NF-kB. o Listă de interactome TRAF6 bazată pe intensitatea de cuantificare fără etichetă (secțiune). b, c celule MKC însămânțate în vase de 6 cm2. După 24 de ore, lizatele celulare au fost imunoprecipitate (IP) cu geluri de afinitate anti-TRAF6 sau anti-calpain2a. Apoi, imunoprecipitatele și lizatele celulare au fost analizate de către IB cu anti-TRAF6 și, respectiv, anti-calpain2a. d, celulele HEK 293 însămânțate în vase de 6 cm2 au fost transfectate cu plasmidele calpain2a-Flag și TRAF6-Myc (2 ug fiecare). După 24 de ore, lizatele celulare au fost imunoprecipitate (IP) cu geluri de afinitate anti-Myc d sau anti-Flag e. Apoi, imunoprecipitatele și lizatele celulare au fost analizate de către IB cu anti-Myc și respectiv anti-Flag Abs. f Aceeași aminoacizi dintre calpaina2a umană (Hu-calpain2), calpaina2a de șoarece (Mu-calpain2), calpaina2a de pește zebra (ZF-calpain2a) și calpaina2a (M-calpain2a) sunt evidențiate cu fundal negru. Celulele EPC g–I au fost transfectate cu calpain2a-Flag sau vector gol împreună cu reporterii luciferazei NF-kB, IL-1 și IL-8. La 24 de ore post-transfecție, celulele au fost netratate (Mock) sau tratate cu LPS timp de 6 ore. Valoarea activității luciferazei a fost obținută în raport cu activitatea luciferazei Renilla (n=3 per grup). Analiza Western blot a fost utilizată pentru a măsura expresia flagului calpain2a transfectat tranzitoriu. Expresia Tubulin a fost folosită ca control al încărcării. Datele au fost analizate prin ANOVA bidirecțional (g, h, i). **p < 0.01. Toate experimentele au fost efectuate în cel puțin trei experimente independente.

Interacțiunea calpain2a cu TRAF6.

Analiza domeniului a fost efectuată utilizând baza de date pentru domenii conservate (CDD) NCBI. calpain2a cuprinde trei domenii: un domeniu al cisteină protează (CysPc) din familia Calpain (aa 46-339), un domeniu central al subunității mari Calpain III (aa 360-499) și un domeniu de mână Penta-EF C-terminal ( aa 500-697). Pentru a determina ce domenii ale calpain2a au fost necesare pentru interacțiunea sa cu TRAF6, am creat trei mutanți de trunchiere: calpain2a (1-339), calpain2a (340-697) și calpaină (500-697) (Fig. 3a). Celulele HEK293 au fost transfectate cu calpain2a-Flag tip sălbatic (WT), mutanți de trunchiere calpain2a-Flag sau vector TRAF6-HA. Am descoperit că atât calpaina2a de lungime completă, cât și trei mutanți de trunchiere ar putea interacționa cu TRAF6 (Fig. 3c). TRAF6 este compus dintr-un domeniu TRAF C-terminal, un domeniu spiralat, un domeniu Zinc fingers și un domeniu Ring finger38. Pentru a examina ce domenii ale TRAF6 au fost necesare pentru interacțiunea sa cu calpaina2a, am creat o serie de mutanți trunchiați de TRAF6, inclusiv TRAF6 (1-139), TRAF6 (140-574), TRAF6 ({{36} }}) și TRAF6 (400-574). Între timp, am creat mutanții de domeniu: TRAF6ΔRing (în care domeniul degetului inel este șters), TRAF6ΔZF (în care domeniul degetelor de zinc este șters), TRAF6ΔCC (în care domeniul bobinei spiralate este șters) și TRAF6ΔTRAF-C ( în care domeniul TRAF C-terminal este șters) (Fig. 3b). calpain2a a interacționat cu TRAF6 de lungime completă, precum și trunchiuri ale TRAF6 care conțineau domeniul TRAF C-terminal, un domeniu spiralat, un domeniu Zinc fingers (Fig. 3d, f), dar nu cu domeniul Ring finger (Fig. 3e) . Testele luciferazei au arătat că supraexprimarea calpainei 2a și a acestor mutanți de trunchiere au inhibat semnificativ activitatea reporterului NF-κB și IL-1 în celulele EPC (Fig. 3h). În plus, au fost investigate colocalizările subcelulare ale calpainei2a cu TRAF6. Am transfectat celule EPC cu TRAF6-GFP și un vector gol sau calpain2a-mCherry. Analiza microscopiei confocale a demonstrat că semnalele verzi ale TRAF6 s-au suprapus cu semnalele roșii ale calpainei2a, ceea ce a indicat că calpaina2a se co-localizează cu TRAF6 în celulele EPC (Fig. 3i, j). Aceste date indică faptul că baza structurală a mai multor domenii ale TRAF6 (domeniul TRAF C-terminal, domeniul bobinei spiralate, domeniul degetelor de zinc), dar nu domeniul degetului inel este determinantă pentru asocierea sa cu calpaina2a (Fig. 3g).

Fig. 2 calpain2a negativ reglează calea de semnalizare NF-kB indusă de LPS. un ARNm IL-1, IL{-8 și IL{-6 în MKC transdus cu calpain2a-Flag sau vector gol și tratat cu soluție salină (0) sau provocat cu LPS pentru diverse ori (2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h) (n=3 per grup). b, d Celulele MKC și celulele MIC au fost transfectate cu si-calpaina2a #1 și si-calpaina2a #2 (100 nM) sau si-ctrl (100 nM). La 48 de ore post-transfecție, expresia calpaina2a a fost măsurată prin qRT PCR (n=3 per grup). Nivelul proteinei calpain2a a fost determinat prin Western blot. c, e IL-1 , IL{-8 ARNm în MKC și MIC transdus stabil cu si-calpain2a #1 sau si-ctrl (vector de control) și tratat cu ser fiziologic (0) sau provocat cu LPS pentru diverse ori (4 h, 8 h) (n=3 per grup). f Celulele MKC au fost transfectate fie cu si-ctrl, fie cu si-calpain2a #1. La 36 de ore post-transfecție, celulele au fost stimulate cu LPS timp de 12 ore, apoi a fost măsurat testul de proliferare celulară (n=3 per grup). Bară de scară, 100 μm. g calpain2a-Flag a fost transfectat în celule MKC care au fost provocate cu LPS la diferiți momente (3 ore, 6 ore, 9 ore). Analiza imunoblot a lizatelor celulare cu Abs indicat. Nivelul relativ de ARNm a fost normalizat la expresia genei care codifică -actina în fiecare probă. Toate experimentele au fost efectuate în cel puțin trei experimente independente. Datele au fost analizate prin ANOVA bidirecțional (a, c, e, f) sau ANOVA unidirecțional (b, d). *p < 0,05, **p < 0,01.

Fig. 3 Interacțiunea calpain2a cu TRAF6. a, b Diagramele schematice ale organizării domeniului în miiuy croaker calpain2a, TRAF6 și mutanții au fost utilizate în acest studiu. „+” reprezintă interacțiunea cu TRAF6 sau calpain2a, „-” înseamnă nicio interacțiune. c Celulele HEK293 au fost transfectate cu mutanți trunchiați simulați, calpain2a-Flag de tip sălbatic (WT) și calpain2a-Flag sau TRAF6-HA, după cum este indicat. La 24 de ore după transfecție, celulele transfectate au fost extrase și lizatele celulare au fost supuse imunoprecipitării cu anticorp anti-HA urmat de IB folosind anticorpi anti-HA sau anti-Flag. Celulele d–f HEK293 au fost transfectate cu mutanți trunchiați simulați, TRAF6-HA de tip sălbatic (WT) și TRAF6-HA sau calpain2a-Flag, după cum este indicat. La 24 de ore post-transfecție, celulele transfectate au fost extrase și lizatele celulare au fost supuse imunoprecipitării cu anticorpi anti-HA d, f sau anticorpi anti-Flag e urmat de IB folosind anticorpi anti-HA sau anti-Flag. g Locul de interacțiune al TRAF6 și calpaina2a. h Celulele EPC au fost transfectate cu mutanți trunchiați TRAF6-HA, calpain2a-Flag sau calpain2a-Flag împreună cu reporteri de luciferază NF-kB și IL-1. După 36 de ore post-transfecție, valoarea activității luciferazei a fost atinsă împotriva activității luciferazei renilla (n=3 per grup). Celulele I j EPC au fost transfectate cu mock, calpain2a-mCherry și TRAF6-GFP. Nucleele colorate cu DAPI sunt prezentate cu albastru. calpain2a a fost detectat cu fluorescență roșie, iar TRAF6 a fost detectat cu fluorescență verde. Bară de scară, 10 μm. Toate experimentele au fost efectuate în cel puțin trei experimente independente. Datele au fost analizate prin ANOVA unidirecțional (h). **p < 0,01.

calpaina2a inhibă nivelul de expresie a proteinei TRAF6 prin activitatea proteolitică.

Pentru a explora mecanismul de reglementare al calpainei 2a asupra TRAF6, am examinat mai întâi dacă calpaina2a a avut un efect asupra TRAF6 la nivel de proteine. calpain2a-Myc și TRAF6-Flag au fost co-transfectate în celule EPC, nivelul de proteină al TRAF6 a fost parțial degradat la 30 de ore (Fig. 4a). După cum se arată în Fig. 4b, calpaina2a a promovat degradarea TRAF6 într-o manieră dependentă de doză. În prezența calpainei 2a, nu a afectat nivelul ARNm al TRAF6, ceea ce indică faptul că calpaina 2a afectează doar nivelul proteinei TRAF6. Între timp, testul inhibitor de cicloheximidă (CHX) a demonstrat că calpaina2a ar putea accelera timpul de înjumătățire al proteinei TRAF6 (Fig. 4c). Supraexprimarea calpainei 2a în celulele MKC a dus la destabilizarea TRAF6 endogenă (Fig. 4d). Pentru a investiga dacă degradarea TRAF6 mediată de calpaina2a a fost dependentă de căile ubiquitin-proteazom, autofagozom, lizozomal sau altele, celulele EPC au fost tratate cu reactivii care au inhibat aceste căi: MG132, 3-MA și NH4Cl. Cu toate acestea, destabilizarea TRAF6 mediată de calpain2a nu a fost inversată de inhibitorul proteazomal MG132, inhibitorul autofagic 3-MA sau inhibitorul lizozomal NH4Cl (Fig. 4e). Apoi, celulele EPC au fost tratate cu reactivii: E-64 (un inhibitor al calpainei care inactivează activitatea hidrolazei calpainei) și PMSF (inhibitor nespecific de serin protează). Am descoperit că inhibitorul calpainei E-64 a prevenit degradarea la nivelul proteinei TRAF6 (Fig. 4f). După cum se arată în Fig. 4g, E-64 a inversat și degradarea nivelurilor endogene de proteină TRAF6 de către calpaina2a.

Fig. 4 calpaina2a inhibă expresia proteinei TRAF6. a Experimentul cu gradient de timp al vectorilor goali sau al plasmidelor calpain2a-Myc împreună cu Flag TRAF6- a fost efectuat în celule EPC. Lizatele celulare au fost supuse la IB cu anti-Myc, anti-Flag și anti-Tubulin Abs. ARN-ul a fost extras din celule și transcris invers, iar apoi TRAF6 și actina au fost amplificate prin primeri PCR. b Celulele EPC au fost însămânțate în 12-plăci de godeuri peste noapte și co-transfectate cu TRAF6-Flag și calpain2a-Myc (0.3, 0}.6 sau {{ 18}}.9 ug) timp de 48 h. Expresia proteinelor TRAF6-Flag și calpain2a-Myc a fost detectată prin Western blot. ARN-ul a fost extras din celule și transcris invers, apoi TRAF6 și actina au fost amplificate prin primeri PCR. c calpain2a-Myc sau vectori gol au fost co-transfectați cu TRAF6-Flag în celule EPC. La 36 de ore post-transfecție, celulele transfectate au fost tratate cu cicloheximidă (CHX) timp de 2 sau 4 ore. d Celulele MKC au fost transfectate cu calpain2a-Flag sau vectori goli. La 48 de ore post-transfecție, lizatele celulare au fost supuse la IB cu anti-TRAF6, anti-Flag și anti-Tubulin Abs. e, f Celulele EPC au fost transfectate cu plasmidele indicate în prezența sau absența MG132, 3-MA, NH4CL, E-64 (50 sau 75 μM) sau PMSF timp de 6 h înainte de a fi efectuată analiza imunoblot. g Celulele MKC au fost transfectate cu calpain2a-Flag în prezența sau absența E{{50}} (50 sau 75 μM) timp de 6 ore înainte de a fi efectuată analiza imunoblot. h calpain2a-Flag și calpain2a-ΔCysPc-Flag au fost co-transfectate cu TRAF6-HA în celule EPC. La 48 de ore post-transfecție, lizatele celulare au fost supuse la IB cu Abs indicat. I calpain2a-Flag și calpain2a-ΔCysPc-Flag au fost cotransfectate în celule MKC. La 48 de ore post-transfecție, lizatele celulare au fost supuse la IB cu anti-TRAF6, anti-Flag și anti-Tubulin Abs. j ARNm IL{-1, IL{-8 în MKC transdus stabil cu calpain2a-Flag și calpain2a-ΔCysPc-Flag și tratat cu ser fiziologic (0) sau provocat cu LPS timp de 4 ore (n=3 pe grup). Nivelul relativ de ARNm a fost normalizat la expresia genei care codifică -actina în fiecare probă. Toate experimentele au fost efectuate în cel puțin trei experimente independente. Datele au fost analizate prin ANOVA bidirecțional (j). **p < 0,01.

Pentru a determina dacă degradarea TRAF6 a fost dependentă de activitatea hidrolazei calpain2a. Profitând de studiile structurale și biochimice anterioare ale calpainei la mamifere, am mutat reziduurile de cisteină, histidină și asparagină ale calpainei 2a la alanină (calpain2a C105A, H262A, N286A și 3 A), care a pierdut coordonarea triadei catalitice44-46. Am observat că degradarea TRAF6 nu a fost afectată de această mutație (Fig. 1a suplimentară). Deci, am mutat domeniul de protează, care este domeniul cisteină protează (CysPc) al familiei Calpain al calpain2a (denumit calpain2a-ΔCysPc). Nici TRAF6 supraexprimat, nici TRAF6 endogen nu sunt afectate de calpaina2a-ΔCysPc (Fig. 4h, i). Cu toate acestea, citokinele proinflamatorii IL-1 și IL{-8 sunt afectate simultan de calpaina2a de tip sălbatic sau mutant la stimularea LPS (Fig. 4j). Calpaina mutantă care nu are activitate de hidrolază nu afectează nivelul proteic al TRAF6, dar calpaina mutantă lipsită de activitate hidrolază a afectat în continuare expresia citokinelor proinflamatorii din aval. Acest lucru a declanșat investigația noastră asupra mecanismelor potențiale prin care calpaina2a reglează TRAF6. Luate împreună, aceste rezultate arată că calpaina2a reglează semnalizarea NF-kB prin suprimarea expresiei nivelurilor proteinei TRAF6, prin activitatea sa de hidrolază calpaină.

calpaina2a inhibă activitatea ubiquitin-ligazei TRAF6.

Apoi, am explorat mecanismele moleculare prin care calpaina2a reglează negativ semnalizarea NF-κB activată de TRAF6- și dacă interacțiunea calpain2a cu TRAF6 la pierderea activității enzimatice îi modulează activitatea ubiquitin ligazei. Am tratat celulele MKC cu LPS și apoi am imunoprecipitat TRAF6. Testul de ubiquitinare cu proteine ​​recombinate purificate a confirmat că calpaina2a și calpaina2a-ΔCysPc au scăzut ubiquitinarea TRAF6 (Fig. 5a). După cum se arată în Fig. 5b, c, atât calpaina2a, cât și calpaina2a-ΔCysPc au redus semnificativ proteinele ubiquitinate WT și K63 ale TRAF6. Gradienții de concentrație de calpain2a și calpain2a-ΔCysPc au redus proteinele ubiquitinate WT și K63 ale TRAF6 într-o manieră dependentă de doză. calpain2a-ΔCysPc a prevenit încă agregarea lanțului de ubiquitină K63 a TRAF6 fără a afecta nivelul proteinei TRAF6 (Fig. 5d, e). Apoi am transfectat celule MKC pentru a exprima TRAF6 marcat cu Myc în prezența sau absența calpain2a-ΔCysPc marcat cu Flag, apoi am efectuat experimente de imunoprecipitare cu un anticorp anti-Myc și analizat prin imunoblot cu anti-UB. O astfel de ubiquitinare a TRAF6 a fost substanțial atenuată de calpain2a-ΔCysPc (Fig. 5f). Stimulat de LPS, TRAF6 furnizează lanțul de ubiquitină legat de K63-la TAK1, care stimulează autofosforilarea TAK1 și activează NF-κB18. Proteinele ubiquitinice WT și K63 ale TAK1 au fost îmbunătățite semnificativ în prezența TRAF6, în timp ce ubiquitinarea legată de TAK1-a fost inhibată în prezența calpain2a-ΔCysPc (Fig. 5g, h). Aceste date susțin că mutantul calpain2a lipsit de activitate de hidrolază inhibă în mod similar activitatea ubiquitin ligazei TRAF6 fără a afecta nivelurile proteinei TRAF6.

Beneficiile cistanche tubulosa- intareste sistemul imunitar

calpaina2a inhibă homo-oligomerizarea TRAF6.

Lanțul de ubiquitină Lys63 sintetizat de TRAF6 joacă un rol cheie în transducția semnalului. S-a raportat că dimerizarea TRAF6 este esențială pentru sinteza lanțului său de ubiquitină16. Modelul de dimerizare este strâns legat de combinația de Ubc13 pentru a produce ubiquitinarea K6316,30. Pentru a verifica dacă peștele TRAF6 ar putea forma dimeri, am folosit plasmide TRAF6 cu diferite etichete: TRAF6 marcat cu Myc și TRAF6 etichetat cu HA pentru experimente co-IP. Testul IP a fost efectuat folosind un anticorp anti-HA, HATRAF6 a interacționat cu Myc-TRAF6 (Fig. 6a). Pentru a explora efectul inhibitor al calpainei2a în interacțiunea dimerului TRAF6-, calpaina2a marcată cu Flag, TRAF6 marcată cu HA și TRAF6 marcată cu Myc au fost exprimate tranzitoriu în celulele HEK293. După cum era de așteptat, interacțiunea dimerului TRAF6-a scăzut în prezența calpainei 2a (Fig. 6b). În același timp, pentru a evita prezența degradării TRAF6 de către calpain2a. Am transfectat calpain2a-ΔCysPc marcat cu Flag și am constatat că interacțiunea dimerului TRAF6-a scăzut treptat în prezența calpain2a-ΔCysPc (Fig. 6c). După cum se arată în Fig. 6d, e, am găsit ubiquitinarea WT și K63 îmbunătățită cu HA-TRAF6 a Myc-TRAF6. În timp ce celulele HEK293 au fost co-transfectate cu calpain2a și calpain2a-ΔCysPc, ubiquitinația îmbunătățită ar fi suprimată. Aceste rezultate sugerează că atât calpaina2a de tip sălbatic, cât și calpaina2a mutantă lipsită de activitate de hidrolază inhibă homooligomerizarea și auto-ubiquitinarea TRAF6.

calpaina2a inhibă livrarea ubiquitinării TRAF6 către ECSIT și BECN1.

După cum este descris în Fig. 5d, am constatat că calpaina2a a interferat cu procesul de ubiquitilare de la TRAF6 la TAK1. S-a raportat că ECSIT a acționat ca o proteină adaptoare a TAK1 și TRAF6 pentru a promova semnalizarea NF-kB prin stimularea LPS37. Pentru a verifica dacă ECSIT a avut funcțiile menționate la peștele teleost, am efectuat alinieri multiple de secvențe ale proteinelor ECSIT la om, șoarece și mai croaker (Figura suplimentară 1b). Am transfectat celule EPC cu reporter de luciferază NF-κB, ECSIT a îmbunătățit semnificativ activitatea reporterului NF-κB după stimularea LPS (Fig. 1c suplimentară). Expresia excesivă a ECSIT în celulele MKC a condus la reglarea în sus a nivelului ARNm al TNF- (Figura suplimentară 1d). După transfectarea peștilor ECSIT și TRAF6 în celule HEK293, am constatat că TRAF6 a interacționat cu ECIST (Fig. 7a). În mod similar, ECSIT și TAK1 au fost co-transfectate, iar cele două proteine ​​au menținut, de asemenea, interacțiunea (Fig. 7b). Ulterior, pentru a verifica dacă calpain2a-ΔCysPc inhibă formarea complexului TRAF6-ECSIT, am transfectat cele trei plasmide în celule HEK293 și am constatat că calpain2a-ΔCysPc a prevenit complexul TRAF{6-ECSIT (Fig. 7c). ). Pentru a verifica procesul de transmitere a lanțului de ubiquitină în semnalizarea NF-kB. După cum se arată în Fig. 7d, TRAF6 ar putea promova ubiquitinarea ECSIT; așa cum era de așteptat, calpain2a-ΔCysPc a inhibat procesul prin care TRAF6 a transmis lanțul de ubiquitină la ECSIT. BECN1 este o proteină importantă în autofagia indusă de LPS. S-a confirmat că ubiquitinarea K63 ar putea modifica și activa BECN1. Enzima de deubiquitinare A20 elimină ubiquitinarea BECN1 și inhibă autofagia cauzată de LPS, iar TRAF6 este ligaza E3 responsabilă pentru ubiquitinarea BECN1 în acest semnal47. După cum se arată în Fig. 7e, TRAF6 a interacționat cu BECN1 și a promovat ubiquitinarea BECN1. Apoi am transfectat BECN1, TRAF6, calpain2a și calpain2a-ΔCysPc în celule HEK293, TRAF6 a promovat ubiquitinarea BECN1. calpain2a-ΔCysPc a inhibat procesul prin care TRAF6 a transmis lanțul de ubiquitină către BECN1 (Fig. 7f). Aceste rezultate sugerează că calpaina2a de tip sălbatic și calpaina2a mutantă lipsită de activitate de hidrolază inhibă capacitatea de ubiquitinare a TRAF6 în autofagia indusă de LPS și semnalizarea NF-kB.

Reglarea negativă a răspunsului antiviral de către calpaina2a.

În calea RLR, TRAF6 acționează ca o ligază E3 recrutată de MAVS pentru a activa NF-kB, producția de IFN și citokine. Apoi am examinat dacă calpaina2a a jucat un rol în prevenirea TRAF6 în procesul antiviral mediat de IFN. În celulele EPC, au fost exprimați reporterii luciferazei IFN-1, ISRE și IRF3. Am descoperit că calpaina2a a redus substanțial aceste activități luciferazei conduse de promotor într-o manieră dependentă de doză prin stimularea Ploy (I: C) și infecția cu Siniperca cheats rhabdovirus (SCRV) (Fig. 8a, b). Eliminarea calpainei 2a a îmbunătățit semnificativ expresia genei declanșată de Ploy (I: C) și SCRV, inclusiv Viperin, Mx1 și ISG15 (Fig. 8c, d). Eliminarea calpainei 2a a dus la o exprimare mai mare a viabilității celulare la infecția cu SCRV în celulele MKC (Fig. 8e). Așa cum se arată în Fig. 8f, testele de proliferare celulară au arătat că distrugerea calpainei 2a a îmbunătățit proliferarea celulară la infecția cu SCRV. Supraexprimarea calpainei 2a a promovat puternic propagarea virusului, așa cum se reflectă prin replicarea virală după infecția cu SCRV (Fig. 8g). calpain2a și calpain2a-ΔCysPc au redus substanțial reporterii luciferazei conduși de promotori IFN-1, ISRE și IRF3 la stimularea Ploy (I: C) și infecția cu SCRV (Fig. 2a, b suplimentară). Aceste rezultate sugerează că calpaina2a poate regla negativ calea de semnalizare RLR prin inhibarea TRAF6, inhibând astfel activarea IFN.

Fig. 5 calpaina2a inhibă activitatea ubiquitin-ligazei TRAF6. a Ubiquitinarea TRAF6 endogene în celulele MKC transduse cu calpain2a-Flag și calpain2a-ΔCysPc-Flag și necontestată (-) sau provocată cu LPS (+), evaluată prin analiză imunoblot cu anti-ubiquitin după imunoprecipitare cu analiză anti-TRAF6 și imunoprecipitare cu Abs indicat. b, c Celulele HEK293 au fost cotransfectate cu TRAF6-HA și WT-ubiquitin-His sau K63O ubiquitin-His (în care se păstrează numai lizina 63) împreună cu calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag sau vector gol. După 24 de ore post-transfecție, celulele au fost lizate și purificate cu agaroză Ni-NTA. d, celulele HEK293 au fost cotransfectate cu TRAF{{30}}HA și WT-ubiquitin-His sau K63O-ubiquitin-His (în care se păstrează numai lizina 63) împreună cu calpain2a-Flag ({{45 }},5 ug, 1 ug), calpain2a-ΔCysPc-Flag (0,5 ug, 1 ug) sau vector gol. După 24 de ore post-transfecție, celulele au fost lizate și purificate cu agaroză Ni-NTA. f Ubiquitinarea TRAF6 supraexprimat în celulele MKC transduse cu calpain2a-ΔCysPc-Flag, evaluată prin analiza imunoblot cu anti-ubiquitin după imunoprecipitare cu anti-Myc și analiza imunoblot de intrare cu Abs indicat. g, h Celulele HEK293 au fost cotransfectate cu TAK1-Myc, TRAF{6-HA și WT-ubiquitin-His sau K63O-ubiquitin-His (în care se păstrează numai lizina 63) împreună cu calpain2a-Flag , calpain2a-ΔCysPc-Flag sau vector gol. După 24 de ore post-transfecție, celulele au fost lizate și purificate cu agaroză Ni-NTA. Toate imunoprecipitatele și analiza imunoblot de intrare cu anti-Myc, anti-Flag, anti-HA și anti-Tubulin Abs. Toate experimentele au fost efectuate în cel puțin trei experimente independente.

calpaina2a suprimă ubiquitinarea IRF3 și IRF7 din TRAF6.

Se raportează că în semnalul antiviral declanșat de complexul MAVS-TRAF3/6, activitatea TRAF6 este necesară pentru activarea IRF3 și NF-kB48. După cum se arată în Fig. 9a, b, TRAF6 promovează ubiquitinarea legată de WT și K63- a IRF3, iar această îmbunătățire este inhibată de expresia calpainei2a-ΔCysPc. Între timp, atunci când virusul declanșează un semnal de semnalizare dependent de TLR, TRAF6 este strâns legat de IRF7 și promovează ubiquitinarea IRF7 împreună cu factorii antivirali activați22,49,50. TRAF6 promovează ubiquitinarea legată de WT și K63- a IRF7, iar această îmbunătățire este inhibată de expresia calpain2a-ΔCysPc (Fig. 9c, d). Aceste date sugerează că calpaina2a de tip sălbatic și calpaina2a mutantă lipsită de activitate de hidrolază inhibă ubiquitinarea mediată de TRAF6-a IRF3 și IRF7.

Discuţie

TRAF6 este unul dintre cei șapte membri ai familiei de factori asociați ai receptorului (TRAF) a factorului de necroză tumorală (TNF), care a fost identificat ca un adaptor de semnal și exercită transducția semnalului51,52. Familia TRAF conține domeniul inelului, care deține activitatea ligazei E3. Ligazele E3 cu domeniul HECT promovează poliubiquitinarea substratului, iar E3 cu domeniul Ring necesită E2~ub pentru a transmite poliubiquitinarea53,54. S-a confirmat că enzima de legare a dimerului Ub Ubc13/Uev1A este implicată în agregarea poliubiquitinării TRAF616. În timp ce K124 al TRAF6 de șoarece este eliminat, TRAF6 va pierde activitatea auto-ubiquitinării K63, iar mutația de la acest site elimină ubiquitinarea NEMO mediată de TRAF6-și activarea TAK1, IKK și NF-κB55 . Este precis deoarece PRDX1 se leagă de domeniul inelului TRAF6 conținut în K124 și elimină ubiquitinarea lui TRAF638. S-a raportat că ubiquitinarea TRAF6 este strâns legată de dimerizarea domeniului său N-terminal (domeniul degetului inelar și al degetelor ZF). Site-urile de interacțiune N-terminale multiple cu Ubc13 au fost mutate, iar Ubc13 nu a putut transmite poli~ub la TRAF616. Interacțiunea dintre mutanții calpain2a și TRAF6 a arătat că majoritatea domeniilor TRAF6 au interacționat cu calpaina2a, cu excepția domeniului Inelar. Datorită interacțiunii dintre calpain2a și domeniul degetelor ZF al TRAF6, am speculat că calpain2a ar putea inhiba auto-ubiquitinarea prin blocarea dimerizării TRAF6. Ulterior, am verificat interacțiunea diferitelor etichete ale TRAF6. Pe măsură ce expresia calpainei mutante care nu are activitate de hidrolază a crescut, interacțiunea diferitelor etichete ale TRAF6 a slăbit. TRAF6 marcat cu HA promovează ubiquitinarea TRAF6 marcat cu Myc, iar calpaina2a mutantă inhibă ubiquitinarea îmbunătățită de TRAF6 marcat cu HA. Ca intermediar în procesul de transmitere a semnalului TRAF{6-TAK1, ECSIT se leagă de domeniul C-terminal al TRAF6 (domeniul CC și domeniul TRAF-C) și se confirmă că este implicat în semnalizarea NF-kB37. Expresia citokinelor proinflamatorii a scăzut în celulele ECSITKD THP-1. Cu toate acestea, după supraexprimarea ECSIT în celulele ECSITKD THP-1, gene precum IRF7, IL{-1 și CD44 au crescut semnificativ37. PRDX1 se leagă de domeniul degetului inel al TRAF6 și inhibă ubiquitinarea ECSIT și BECN1 în semnalele NF-kB și autofagie prin inhibarea formării poliubiquitinării TRAF638. La peștii teleost, am confirmat calea de semnalizare NF-κB activată de ECSIT, a interacționat cu TRAF6 și, respectiv, TAK1 și a transmis lanțul de poliubiquitină produs de TRAF6. calpain2a s-a legat la domeniul ZF, domeniul CC și domeniul TRAF-C al TRAF6, ceea ce a inhibat interacțiunea TRAF6-ECSIT. Am confirmat că mutantul calpain2a lipsit de activitate de hidrolază a prevenit lanțul de poliubiquitină de la TRAF6 la ECSIT și BECN1.

Fig. 6 calpaina2a atenuează autoubiquitinarea TRAF6. a celulele HEK293 au fost transfectate cu TRAF6-Myc, TRAF{6-HA sau vector gol. După 24 de ore post-transfecție, celulele au fost lizate și analizate IP cu anticorp HA. b Celulele HEK293 au fost transfectate cu TRAF6-Myc, TRAF6-HA, vector gol sau calpain2a-Flag. După 24 de ore post-transfecție, celulele au fost lizate și analizate IP cu anticorp HA. c Celulele HEK293 au fost transfectate cu TRAF6-Myc, TRAF{6-HA, vector gol sau diferite concentrații de calpain2a-ΔCysPc-Flag. După 24 de ore post-transfecție, celulele au fost lizate și analizate IP cu anticorp HA. d, celulele HEK293 au fost cotransfectate cu TRAF6-Myc, TRAF{6-HA și WT-ubiquitin-His sau K63O-ubiquitin-His (în care se păstrează numai lizina 63) împreună cu calpain2a-Flag , calpain2a-ΔCysPc-Flag sau vector gol. După 24 de ore post-transfecție, celulele au fost lizate și purificate cu agaroză Ni-NTA. Imunoprecipitează și analizează imunoblot de intrare cu anti-Myc, anti-Flag, anti-HA și anti-Tublin Abs. Toate experimentele au fost efectuate în cel puțin trei experimente independente.

Fig. 7 calpaina2a inhibă ubiquitinarea ECSIT și BECN1 mediată de TRAF{2}}. a celulele HEK293 au fost transfectate cu ECSIT-Myc, TRAF6-Flag sau vector gol. După 24 de ore post-transfecție, celulele au fost lizate și analizate IP cu anticorp Flag. b Celulele HEK293 au fost transfectate cu TAK1-Flag, ECSIT-Myc sau vector gol. După 24 de ore post-transfecție, celulele au fost lizate și analizate IP cu anticorp Myc. c Celulele HEK293 au fost transfectate cu TRAF6-Myc, ECSIT-HA, vector gol sau diferite concentrații de calpain2a-ΔCysPc-Flag. După 24 de ore post-transfecție, celulele au fost lizate și analizate IP cu anticorp Myc. d Celulele HEK293 au fost cotransfectate cu ECSIT-Myc, TRAF6-HA, WT-ubiquitin-His împreună cu calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag sau vector gol. După 24 de ore post-transfecție, celulele au fost lizate și purificate cu agaroză Ni-NTA. Celulele HEK293 au fost transfectate cu BECN1-Flag, TRAF6-Myc sau vector gol. După 24 de ore post-transfecție, celulele au fost lizate și analizate IP cu anticorp Myc. f Celulele HEK293 au fost cotransfectate cu BECN1-HA, TRAF{6-Myc, WT-ubiquitin-His împreună cu calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag sau vector gol. După 24 de ore post-transfecție, celulele au fost lizate și purificate cu agaroză Ni-NTA. Imunoprecipitează și intră cu anti-Myc, anti-Flag, anti-HA și anti-Tubulin Abs. Toate experimentele au fost efectuate în cel puțin trei experimente independente.

Observăm că calpaina2a are activitate de hidrolază ca una din familia proteazelor dependente de calciu. m-calpaina (calpaina-2) joacă un rol regulator pozitiv în calea de semnalizare NF-κB a celulelor hepatice HepG2. Independent de abordarea proteazomului 26 s, calpaina2a hidrolizează IkB pentru a elibera factorul de transcripție NF-kB. Inhibitorul specific al proteinei calpaine previne degradarea IkB 56. Cu toate acestea, pentru calpaină, există puține studii privind răspunsul imun înnăscut al peștilor. În celulele MKC, supraexprimarea calpainei 2a a inhibat citokinele proinflamatorii NF-κB în aval induse de LPS. Acest fenomen a fost contrar rezultatelor din celulele hepatice HepG2. S-ar putea ca specificitatea de specie a familiei de proteine ​​calpaine să fi cauzat efecte diferite. În mod similar, am folosit inhibitorul specific al proteinei calpaine E-64 pentru a preveni hidroliza calpainei TRAF6. Calpaina2a mutantă care nu are activitate de hidrolază inhibă activitatea ubiquitin ligazei TRAF6 fără a-i afecta nivelul de proteine. Nu am găsit site-uri enzimo-active pentru calpain2a. Conform studiilor anterioare la mamifere, cele trei situsuri: sunt cisteină (C105A), histidină (H262A) și reziduuri de asparagină (N286A). Cu toate acestea, experimentele noastre confirmă că cele trei situsuri active ale miiuy croaker calpain2a nu afectează expresia nivelurilor de proteină TRAF6, dar mutantul calpain2a lipsit de domeniul hidrolazei o face. Prin urmare, am ales să modificăm întregul domeniu structural de activare a enzimei. Deși proteina calpain2a este relativ conservată la mamifere și vertebratele inferioare, situsurile specifice de activitate enzimatică merită investigații suplimentare.

cistanche plant-creșterea sistemului imunitar

În rezumat, am identificat calpaina2a ca un regulator negativ al semnalizării NF-κB indusă de LPS și al activării IFN indusă de virus (Fig. 9e). În spectrometria de masă, calpaina2a poate interacționa cu TRAF6 și am demonstrat acest fenomen prin experimentul de coimunoprecipitare endogenă. Am descoperit că calpaina2a este implicată în reglarea căii de semnalizare NF-κB indusă de LPS. În plus, TRAF6 joacă, de asemenea, un rol important în căile de semnalizare antivirale. Am folosit SCRV și Ploy (I: C) pentru a stimula calea de semnalizare IFN și am constatat că calpaina2a poate, de asemenea, inhiba semnalizarea IFN prin reglarea nivelului de proteine ​​și autoubiquitinarea TRAF6. Deoarece TLR3 poate recunoaște structura ARN-ului dublu catenar (dsRNA) produsă de infecțiile virale. Suntem mai interesați de elucidarea reglării calpain2a a căii de semnalizare IFN mediată de TRAF6-, dar nu excludem o relație potențială între calea de semnalizare calpain2a și TLR3. calpain2a a promovat degradarea TRAF6 într-o manieră hidrolitică și a interacționat cu TRAF6 pentru a inhiba formarea de dimeri și auto-ubiquitinarea. Această inhibare a împiedicat interacțiunea TRAF6 și ECSIT și procesul de transfer de ubiquitinare de la TRAF6 la ECSIT, BECN1, IRF3 și IRF7. Rezultatele noastre actuale vor contribui la înțelegerea mecanismelor de reglare negativă prin țintirea TRAF6 în răspunsurile imune înnăscute. În plus, această cercetare indică rolul cheie al homooligomerizării și auto-ubiquitinării TRAF6 în procesul răspunsului imun înnăscut al peștilor. Concomitent, calpaina2a este propusă ca o proteină mecanism de reglare pentru a inhiba răspunsul imun al TRAF6 și pentru a preveni căile de semnal normale și ordonate. Perspectivele sunt utile pentru înțelegerea imunologiei vertebratelor și a evoluției sistemului imunitar al vertebratelor.

Fig. 8 calpaina2a inhibă activarea IFN indusă de SCRV sau Poly(I:C). Celulele ab EPC au fost transfectate cu diferite concentrații de calpain2a-Flag sau vector gol împreună cu reporterii IFN-1, ISRE și IRF3-pro luciferază. La 24 de ore după transfecție, celulele au fost infectate simulat sau infectate cu SCRV sau Poly(I: C) timp de 12 ore (n=3 per grup). Analiza Western blot a fost utilizată pentru a măsura expresia calpainei 2a-Flag transfectate tranzitoriu. Expresia Tubulin a fost folosită ca control al încărcării. c, d Viperin, Mx1, ARNm ISG15 în MKC transdus stabil cu si-calpain2a #1 sau si-ctrl (vector de control) și tratat cu ser fiziologic (0) sau provocat cu SCRV sau Poly(I: C) pentru 24 h. Nivelul relativ de ARNm a fost normalizat la expresia genei care codifică -actina în fiecare probă (n=3 per grup). Celulele MKC e, f au fost transfectate fie cu si-ctrl, fie cu si-calpain2a #1. La 24 de ore post-transfecție, celulele au fost stimulate cu SCRV timp de 24 de ore, apoi au fost măsurate testul de viabilitate celulară și testul de proliferare celulară (n=3 per grup). Bară de scară, 100 μm. g celule MKC au fost transfectate cu calpain2a-Flag sau pcDNA3.1, apoi infectate cu SCRV timp de 24 de ore (n=3 per grup). Analiza qRT-PCR a fost efectuată pentru expresia ARN SCRV intracelular și supernatant. Toate experimentele au fost efectuate în cel puțin trei experimente independente. Datele au fost analizate prin ANOVA unidirecțional (a, b), ANOVA cu două sensuri (c, d, e, f) sau testul t Student cu două cozi (g). *p < 0,05, **p < 0,01.

Metode

Cultură de celule.

Liniile celulare 293 de rinichi embrionar uman (HEK) și liniile celulare Epithelioma papulosum cyprini (EPC), au fost achiziționate de la American Type Culture Collection și păstrate în laboratorul nostru. Liniile celulare de rinichi Miiuy croaker (M. miiuy) (MKC) și liniile celulare de intestin Miiuy croaker (MIC) au fost cultivate din rinichi și țesuturi intestinale ale miiuy croaker57,58. Liniile celulare de rinichi Miiuy croaker și liniile celulare de intestin Miiuy croaker au fost cultivate la 26 de grade într-un incubator umidificat care conține 0,5% CO2 în mediu L{-15 (HyClone, SUA) suplimentat cu 15% FBS (Gibco). , SUA), 100 U/ml penicilină (Gibco, SUA), 100 ug/ml streptomicina (Gibco, SUA) și 20 U/ml heparină (Solarbio, China). Celulele de epiteliom papulosum cyprini au fost crescute la 26 de grade într-un incubator umidificat care conține 5% CO2 în mediu 199 (Hyclone) suplimentat cu 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 100 U/ml penicilină și 100 mg/ml streptomicina. Celulele 293 de rinichi embrionar uman au fost crescute la 37 de grade într-un incubator umidificat care conține 5% CO2 în mediu Eagle modificat de Dulbecco (DMEM) (Invitrogen) suplimentat cu 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 100 U/ml penicilină și 100 mg. /ml streptomicina.

Fig. 9 calpaina2a inhibă ubiquitinarea IRF7 și IRF3 mediată de TRAF{2}}. b Celulele HEK293 au fost cotransfectate cu IRF3-Myc, TRAF{6-HA și WTubiquitin-His sau K63O-ubiquitin-His (în care se păstrează numai lizina 63) împreună cu calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc -Strap sau vector gol. După 24 de ore după transfecție, celulele au fost lizate și purificate cu agaroză Ni-NTA. c, d Celulele HEK293 au fost cotransfectate cu IRF7-Myc, TRAF{6-HA și WT-ubiquitinHis sau K63O-ubiquitin-His (în care se păstrează numai lizina 63) împreună cu calpain2a-Flag, calpain2a -ΔCysPc-Flag sau vector gol. După 24 de ore după transfecție, celulele au fost lizate și purificate cu agaroză Ni-NTA. Toate imunoprecipitatele și aportul cu anti-Myc, anti-Flag, anti-HA și anti Tubulin Abs. Toate experimentele au fost efectuate în cel puțin trei experimente independente. e Model care detaliază rolurile calpain2a în căile de semnalizare mediate de TRAF6-. Pe LPS și virus, TRAF6 ar putea fi activat, homo-oligomerizare și auto-ubiquitinare. BECN1, ECSIT, IRF7 și IRF3 sunt ubiquitinate de TRAF6 și declanșează activarea semnalelor în aval. calpain2a ca regulator negativ vizează TRAF6 pentru a inhiba căile de semnalizare mediate de TRAF{49}}.

Referințe

1. Akira, S., Uematsu, S. & Takeuchi, O. Recunoașterea patogenilor și imunitatea înnăscută. Celula 124, 783–801 (2006).

2. Takeuchi, O. & Akira, S. Receptorii de recunoaștere a modelelor și inflamație. Celula 140, 805–820 (2010).

3. Wu, J. & Chen, ZJ Sensarea imună înnăscută și semnalizarea acizilor nucleici citosolici. Annu. Rev. Immunol. 32, 461–488 (2014).

4. Moresco, EM, LaVine, D. & Beutler, B. Toll-like receptors. Curr. Biol. 21, R488–R493 (2011).

5. Schlee, M. Senzori maeștri ai ARN-ului patogen - receptorii de tip RIG-I. Imunobiologie 218, 1322–1335 (2013).

6. Wilmanski, JM, Petnicki-Ocwieja, T. & Kobayashi, KS NLR proteine: membri integranți ai imunității înnăscute și mediatori ai bolilor inflamatorii. J. Leukoc. Biol. 83, 13–30 (2008).

7. Akira, S. & Hemmi, H. Recunoașterea modelelor moleculare asociate patogenului de către familia TLR. Imunol. Lett. 85, 85–95 (2003).

8. Kawai, T. & Akira, S. Rolul receptorilor de recunoaștere a modelelor în imunitatea înnăscută: actualizare asupra receptorilor de tip Toll. Nat. Imunol. 11, 373–384 (2010).

9. Kawagoe, T. şi colab. Controlul secvențial al răspunsurilor dependente de receptorul Toll-like de către IRAK1 și IRAK2. Nat. Imunol. 9, 684–691 (2008).

10. Suzuki, N. și Saito, T. IRAK-4-un activator comun NF-kappaB în imunitatea înnăscută și dobândită. Trends Immunol. 27, 566–572 (2006).

11. Kawai, T. & Akira, S. Semnalizarea TLR. Moartea celulară diferă. 13, 816–825 (2006).

12. Deng, L. şi colab. Activarea complexului kinazei IkappaB de către TRAF6 necesită un complex enzimatic de conjugare a ubiquitinei dimerice și un lanț unic de poliubiquitină. Celula 103, 351–361 (2000).

13. Ninomiya-Tsuji, J. și colab. Kinaza TAK1 poate activa NIK-I kappaB, precum și cascada kinazei MAP în calea de semnalizare IL-1. Nature 398, 252–256 (1999).

14. Takaesu, G. et al. TAB2, o proteină adaptor nouă, mediază activarea TAK1 MAPKKK prin legarea TAK1 la TRAF6 în calea de transducție a semnalului IL-1. Mol. Celulă. 5, 649–658 (2000).

15. Qian, Y., Commane, M., Ninomiya-Tsuji, J., Matsumoto, K. & Li, X. Translocarea mediată de IRAKm a TRAF6 și TAB2 în activarea indusă de interleukine-1-a NF-kappa BJ Biol. Chim. 276, 41661–41667 (2001).

16. Yin, Q. şi colab. Interacțiunea E2 și dimerizarea în structura cristalină a TRAF6. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 658–666 (2009).

17. Wang, C. şi colab. TAK1 este o kinază dependentă de ubiquitină a MKK și IKK. Nature 412, 346–351 (2001).

18. Ajibade, AA, Wang, HY și Wang, RF Funcția specifică a celulei TAK1 în semnalizarea imună înnăscută. Trends Immunol. 34, 307–316 (2013).

19. Zhang, J., Clark, K., Lawrence, T., Peggie, MW și Cohen, P. O răsucire neașteptată a activării IKKbeta: TAK1 primește IKKbeta pentru activarea prin autofosforilare. Biochim. J. 461, 531–537 (2014).

20. Emmerich, CH şi colab. Activarea complexului canonic IKK de către lanțurile hibride de ubiquitină legate K63/M1-. Proc. Natl Acad. Sci.110, 15247–15252 (2013).

21. Kawai, T. şi colab. Inducerea interferon-alfa prin receptorii Toll-like implică o interacțiune directă a IRF7 cu MyD88 și TRAF6. Nat. Imunol. 5, 1061–1068 (2004).

22. Kitagawa, Y. et al. Proteina virusului paragripal uman de tip 2 V inhibă ubiquitinarea IRF7 mediată de TRAF6-pentru a preveni inducția interferonului dependentă de TLR{7- și TLR{9-. J. Virol. 87, 7966–7976 (2013).

23. Kawai, T. şi colab. IPS-1, un adaptor care declanșează inducția interferonului de tip I mediată de RIG-I și Mda5-. Nat. Imunol. 6, 981–988 (2005).

24. Zust, R. şi colab. Riboza 2'-O-metilarea oferă o semnătură moleculară pentru distincția ARNm de sine și non-self dependent de senzorul de ARN Mda5. Nat. Imunol. 12, 137–143 (2011).

25. Seth, RB, Sun, L., Ea, CK & Chen, ZJ Identificarea și caracterizarea MAVS, o proteină de semnalizare antivială mitocondrială care activează NF kappaB și IRF 3. Cell 122, 669–682 (2005).

26. Xu, LG și colab. VISA este o proteină adaptor necesară pentru semnalizarea IFN beta declanșată de virus. Mol. Celulă. 19, 727–740 (2005).

27. Yoshida, R. şi colab. TRAF6 și MEKK1 joacă un rol esențial în calea antivirală a helicazei asemănătoare RIG-I. J. Biol. Chim. 283, 36211–36220 (2008).

28. Liu, S. et al. MAVS recrutează mai multe ligaze de ubiquitin E3 pentru a activa cascadele de semnalizare antivirale. Elife 2, e00785 (2013).

29. Ivashkiv, LB & Donlin, LT Reglarea răspunsurilor la interferon de tip I. Nat. Rev. Immunol. 14, 36–49 (2014).

30. Fu, TM, Shen, C., Li, Q., Zhang, P. & Wu, H. Mecanism of ubiquitin transfer promovat de TRAF6. Proc. Natl Acad. Sci. 115, 1783–1788 (2018).

31. Boone, DL et al. Enzima de modificare a ubiquitinei A20 este necesară pentru terminarea răspunsurilor receptorilor de tip Toll. Nat. Imunol. 5, 1052–1060 (2004).

32. Kovalenko, A. et al. Supresorul tumoral CYLD reglează negativ semnalizarea NF kappaB prin deubiquitinare. Nature 424, 801–805 (2003).

33. El, X. și colab. USP2a reglează negativ activarea NF kappaB indusă de IL-1beta și virus prin deubiquitinarea TRAF6. J. Mol. Cell Biol. 5, 39–47 (2013).

34. Xiao, N. şi colab. Proteaza 4 specifică ubiquitinei (USP4) vizează TRAF2 și TRAF6 pentru deubiquitinare și inhibă migrarea celulelor canceroase indusă de TNFalfa. Biochim. J. 441, 979–986 (2012).

35. Yasunaga, J., Lin, FC, Lu, X. & Jeang, KT Peptidaza 20 specifică ubiquitinei vizează taxa TRAF6 și virusul leucemiei cu celule T umane de tip 1 pentru a regla negativ semnalizarea NF-kappaB. J. Virol. 85, 6212–6219 (2011).

36. Zhang, X., Zhang, J., Zhang, L., van Dam, H. și ten Dijke, P. UBE2O reglează negativ activarea NF-kappaB mediată de TRAF6-prin inhibarea poliubiquitinării TRAF6. Cell Res. 23, 366–377 (2013).

37. Wi, SM şi colab. Complexul TAK1-ECSIT-TRAF6 joacă un rol cheie în semnalul TLR4 pentru a activa NF-kappaB. J. Biol. Chim. 289, 35205–35214 (2014).

38. Min, Y., Kim, MJ, Lee, S., Chun, E. & Lee, KY Inhibarea activității ubiquitin-ligazei TRAF6 de către PRDX1 duce la inhibarea activării NFKB și a activării autofagiei. Autophagy 14, 1347–1358 (2018).

39. Jiao, S. şi colab. Kinaza MST4 limitează răspunsurile inflamatorii prin fosforilarea directă a adaptorului TRAF6. Nat. Imunol. 16, 246–257 (2015).

40. Baudry, M. & Bi, X. Calpain-1 și Calpain-2: Yin-ul și Yang-ul plasticității sinaptice și neurodegenerării. Trends Neurosci. 39, 235–245 (2016).

41. Franco, SJ & Huttenlocher, A. Reglarea migrației celulare: calpainele fac tăietura. J. Cell Sci. 118, 3829–3838 (2005).

42. Katsube, M. et al. Reglarea mediată de calpaină a căilor distincte de semnalizare și migrarea celulelor în neutrofilele umane. J. Leukoc. Biol. 84, 255–263 (2008).

43. Schaecher, K., Goust, JM & Banik, NL Efectele inhibării calpainei asupra degradării IkB alfa după activarea PBMC: identificarea situsurilor de clivaj calpainei. Neurochema. Res. 29, 1443–1451 (2004).

44. Tompa, P. et al. Despre determinanții secvențiali ai clivajului calpainei. J. Biol. Chim. 279, 20775–20785 (2004).

45. Cuerrier, D., Moldoveanu, T. & Davies, PL Determinarea specificității substratului peptidic pentru mu-calpaină printr-o abordare bazată pe bibliotecă de peptide: importanța interacțiunilor secundare amorsate. J. Biol. Chim. 280, 40632–40641 (2005).

46. ​​DuVerle, DA, Ono, Y., Sorimachi, H. & Mamitsuka, H. Calpain clivage prediction using multiple kernel learning. Plus unu. 6, e19035 (2011).

47. Shi, CS & Kehrl, JH TRAF6 și A20 reglează 63-ubiquitinarea legată de lizină a Beclin-1 pentru a controla autofagia indusă de TLR4-. Sci. Semnal. 3, ra42 (2010).

48. Loo, YM & Gale, M. Immune Signaling by RIG-I-like Receptors. Imunitatea 34, 680–692 (2011).

49. Ling, T. şi colab. TARBP2 inhibă activarea IRF7 prin suprimarea ubiquitinării IRF7 mediată de TRAF6-K63-. Mol. Imunol. 109, 116–125 (2019).

50. Zhou, Z. şi colab. Peștele zebra otud6b reglează negativ răspunsurile antivirale prin suprimarea ubiquitinării legate de K63-a irf3 și irf7. J. Immunol. 207, 244–256 (2021).

51. Kobayashi, T., Walsh, MC & Choi, Y. Rolul TRAF6 în transducția semnalului și răspunsul imun. Microbii Infectează. 6, 1333–1338 (2004).

52. Wu, H. & Arron, JR TRAF6, o punte moleculară care cuprinde imunitatea adaptivă, imunitatea înnăscută și osteoimunologia. Bioessays 25, 1096–1105 (2003).

53. Pickart, CM & Eddins, MJ Ubiquitin: structuri, funcții, mecanisme. Biochim. Biophys. Acta. 1695, 55–72 (2004).

54. Pickart, CM & Fushman, D. Lanțuri de poliubiquitin: semnale de proteine ​​polimerice. Curr. Opinează. Chim. Biol. 8, 610–616 (2004).

55. Lamothe, B. et al. Auto-ubiquitinarea factorului 6 asociat receptorului factorului de necroză tumorală legată de Lys-63-situl specific este un determinant critic al activării kinazei I kappa B. J. Biol. Chim. 282, 4102–4112 (2007).

56. Han, Y., Weinman, S., Boldogh, I., Walker, RK & Brasier, AR Proteoliza IkappaBalpha inductibilă de factor de necroză tumorală mediată de m-calpaină citosolică. Un mecanism paralel cu calea ubiquitin-proteazom pentru activarea factorului nuclear-kappa B. J. Biol. Chim. 274, 787–794 (1999).

57. Chu, Q. şi colab. Un ARN circular foarte conservat circRasGEF1B îmbunătățește imunitatea antivirală prin reglarea căii miR-21-3p/MITA la vertebratele inferioare. J. Virol. 95, e02145–20 (2021).

58. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W. & Xu, T. ACKR4a induce autofagia pentru a bloca semnalizarea NF-kappaB și apoptoza pentru a facilita infecția cu Vibrio harveyi. iScience 26, 106105 (2023).

59. Sepulcre, MP et al. Evoluția recunoașterii și semnalizării lipopolizaharidelor (LPS): peștele TLR4 nu recunoaște LPS și reglează negativ activarea NF kappaB. J. Immunol. 182, 1836–1845 (2009).

60. Zheng, W., Chu, Q. & Xu, T. ARN-ul lung noncoding NARL reglează răspunsurile imune prin reglarea NOD1 mediată de microARN la peștii teleost. J. Biol. Chim. 296, 100414 (2021).

61. Zheng, W., Su, H., Lv, X., Xin, S. & Xu, T. Exon-Intron Circular ARN circRNF217 promovează imunitatea înnăscută și activitatea antibacteriană la peștele teleost prin reducerea miR-130-3p Funcţie. J. Immunol. 208, 1099–1114 (2022).

62. Xu, T., Chu, Q. & Cui, J. MicroARN inductibil de Rhabdovirus-210 modulează răspunsul imun înnăscut antiviral prin țintirea STING/MITA la pești. J. Immunol. 201, 982–994 (2018).

63. Bi, D. şi colab. Recunoașterea lipopolizaharidei și activarea NF-kappaB de către senzorul citosol NOD1 la peștele teleost. Față. Imunol. 9, 1413 (2018).

64. Yan, X., Zhao, X., Huo, R. & Xu, T. IRF3 și IRF8 reglează semnalizarea NF-kappaB prin țintirea MyD88 în peștele Teleost. Față. Imunol. 11, 606 (2020).

65. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W., Sun, Y. & Xu, T. eIF3k inhibă semnalizarea NF-kappaB prin țintirea MyD88 pentru degradarea autofagică mediată de ATG5-la peștii teleostei. J. Biol. Chim. 298, 101730 (2022).