Clearance-ul rapid și spontan postpartum al Plasmodium Falciparum este legat de expulzarea placentei

Parazitemia în rândul femeilor însărcinate cu imunitate protectoare la malaria cu Plasmodium falciparum este adesea dominată de eritrocitele infectate (IE) VAR2CSA pozitive. VAR2CSA mediază sechestrarea EI în placentă. Am emis ipoteza că clearance-ul spontan postpartum observat anterior a parazitemiei la astfel de femei este legat de expulzarea placentei, care îndepărtează focarul de sechestrare al EI-urilor pozitive VAR2CSA. Am evaluat parazitemiile și transcripția genelor înainte și la scurt timp după naștere la 17 femei din Ghana. Scăderea bruscă a parazitemiei postpartum a fost însoțită de reducerea selectivă a transcripției genei care codifică VAR2CSA. Descoperirile noastre oferă o explicație mecanică pentru observația anterioară.

Cuvinte cheie.

imunitatea dobândită; VAR2CSA; pfEMP1; malaria placentară; Plasmodium falciparum; sarcina; gene var; imunitatea specifică variantei.

Locuitorii zonelor cu transmitere stabilă a paraziților Plasmodium falciparum dobândesc o imunitate de protecție substanțială la malarie în copilărie, revizuită în referință [1]. Proteina membranară 1 a eritrocitelor P. falciparum (PfEMP1) este o familie de antigene paraziți, codificate de aproximativ 60 de gene var per genom și care mediază sechestrarea eritrocitelor infectate mature (IE) la receptorii vasculari găzduiți, revizuiți în referință [2]. În ciuda importanței PfEMP1 în imunitatea de protecție dobândită, femeile din astfel de zone devin totuși foarte susceptibile la malarie în timpul sarcinii. Acest lucru a fost legat de infecții cu paraziți care exprimă PfEMP1 de tip VAR2CSA, ceea ce duce la acumularea de EI în spațiul intervilos, provocând malarie placentară [2, 3].

VAR2CSA mediază aderența EI la sulfatul de condroitină cu conținut scăzut de sulfat (CSA), un receptor gazdă care este în mod normal limitat la placentă [4]. Sechestrarea EI-urilor specifice receptorilor este o strategie importantă de supraviețuire a paraziților, deoarece previne distrugerea splenică a EI mature [2]. EI VAR2CSA-pozitive sunt, prin urmare, într-un dezavantaj uriaș de supraviețuire la gazdele care nu sunt gravide, iar imunoglobulina G (IgG) specifică VAR2CSA nu este dobândită înainte de prima sarcină [2, 3]. Aceasta explică susceptibilitatea ridicată a femeilor însărcinate (și în special a primigvideelor) la malaria cu P. falciparum, chiar și în zonele cu transmitere stabilă a paraziților, unde o imunitate de protecție substanțială este dobândită cu mult înainte de a ajunge la vârsta fertilă [3]. Infecțiile cu P. falciparum la femeile însărcinate sunt într-adevăr adesea dominate de paraziții care exprimă VAR2CSA [5], deși paraziții care exprimă alte tipuri de PfEMP1 (și probabil sechestrați în afara placentei) sunt, de asemenea, întâlniți frecvent [6]. Pe această bază, propunem că pot fi definite 2 tipuri fundamental diferite de malarie la femeile însărcinate. Unul este malaria placentară, care este cauzată de paraziții care exprimă VAR2CSA și care apare în principal la femeile cu paritate scăzută fără imunitate de protecție substanțială specifică VAR2CSA. Celălalt tip este malaria cauzată de paraziți care exprimă alte tipuri de PfEMP1 și unde EI-urile sechestrează în țesuturile nonplacentare. Acest din urmă tip nu este limitat la femeile însărcinate și poate apărea la femei de orice paritate. Pur și simplu reflectă lacune în varianta (în principal PfEMP1)-imunitate specifică în general [7].

Având în vedere aceste puncte, am emis ipoteza că rapoartele anterioare despre rezoluția spontană a parazitemiei cu P. falciparum la femeile însărcinate din Africa în câteva zile de la naștere [8, 9] reflectă dispariția bruscă a focarului de sechestrare a EI pozitive pentru VAR2CSA ca placenta este expulzată în timpul nașterii.

METODE

Locul de studiu și participanții

Studiul a fost realizat la 5 unități de sănătate (Abura Dunkwa, Biriwa, Mankessim, Moree și Saltpond) din regiunea centrală a Ghanei. Transmiterea P. falciparum în zona de studiu este stabilă, dar cu variații sezoniere substanțiale.

Femeile însărcinate pe termen scurt, care au consimțit în scris să participe la studiu după ce au primit informații orale și scrise despre obiectivele acestuia, au fost recrutate în perioada noiembrie 2020 – februarie 2021. Femeile cu orice formă de complicații ale sarcinii au fost excluse de la participare. Deși majoritatea femeilor au primit tratament preventiv intermitent ca parte a politicii actuale de îngrijire prenatală din Ghana (Tabelul suplimentar 1), niciuna dintre ele nu a primit nicio formă de tratament antimalaric pe durata studiului (adică, cu puțin timp înainte de naștere până la sfârșitul anului). participarea lor câteva zile mai târziu). Studiul a fost aprobat de consiliul de evaluare instituțional de la Institutul Memorial Noguchi pentru Cercetare Medicală (NMIMR-IRB CPN 005/20-21) și de comitetul de etică al cercetării Ghana Health Service (GHS-ERC 005/08/20).

Detectarea și cuantificarea infecției cu P. falciparum

Infecția cu paraziții P. falciparum a fost determinată prin test de diagnostic rapid, prin microscopie a frotiurilor de sânge colorate cu Giemsa și prin reacție cantitativă a polimerazei în lanț (qPCR) în esență așa cum s-a descris anterior [10, 11], folosind probele de sânge periferic recoltate. ADN-ul extras din diluții de șase 10-ori ale unei culturi in vitro de P. falciparum IT4 în stadiu inel la 1% parazitemie a fost utilizat pentru a stabili o curbă standard care să permită cuantificarea qPCR a parazitemiei.

Analiza transcripției genelor var

Parasite RNA was preserved in the field and used for quantification of var gene transcript levels essentially as described [11, 12], but using universal 1-step reverse transcription-qPCR (RT-qPCR) kits (E3005X, NEB Inc), a Quant Studio 5 thermal cycler system and fructose-bisphosphate aldolase as endogenous control. Data points were not considered if the cycle threshold (Ct) value for the endogenous control was >30 and/or if the Tm for the var gene amplicon for each pair of primers diverged >2 grade față de valoarea așteptată. Abundența transcripției a fost calculată folosind 2-ΔCt, unde media ΔCt=perechea de primeri Ctvar medie - controlul Ctendogen mediu.

Analize statistice

Asociațiile dintre transcripția var2csa și variabilele clinice au fost testate prin corelarea rangului Spearman cu corecția pentru teste multiple. Corelația dintre parazitemiile detectate prin microscopie și prin PCR a fost evaluată prin testul de corelație produs-moment Pearson. Datele obținute la diferite momente de timp au fost comparate prin analiza de varianță cu măsuri repetate (RM-ANOVA) sau prin RM-ANOVA pe ranguri (RM-ANOVA-R), după caz, urmată de testare post-hoc pentru diferențele pe perechi. Software-ul SigmaPlot versiunea 14 (Systat Inc) a fost utilizat pentru a analiza datele și valorile P<.05 were considered significant.

REZULTATE

Participanții la studiu

Un total de 377 de femei consimțitoare au fost testate pentru infecția cu P. falciparum, în timpul travaliului. Dintre aceștia, 15 (4,0 la sută ) au fost paraziți pozitivi prin microscopia frotiului de sânge prin înțepare cu degetul periferic, 24 (6,4 la sută ) prin test de diagnostic rapid și 50 (13,3 la sută ) prin PCR. Pe baza acestor rezultate, 17 femei cu test de diagnostic rapid pozitiv au fost înrolate și selectate pentru urmărire la 8-16 ore după naștere, la 24-48 de ore după naștere și la 48-72 de ore după naștere. Informațiile clinice ale participanților la studiu sunt rezumate în Tabelul suplimentar 1. Nu au existat asocieri semnificative statistic între proporția de paraziți care transcriu var2csa și oricare dintre variabilele clinice enumerate.

Clearance-ul postpartum al parazitemiei

La momentul livrării, toți participanții la studiu au fost parazitemici prin frotiu de sânge și/sau qPCR (Tabelul suplimentar 1). La 8 până la 16 ore după naștere, parazitemia detectabilă microscopic a scăzut spontan (adică, fără intervenție terapeutică) la 14/17 femei (Figura 1A). La 24-48 de ore după naștere, parazitemiile au scăzut și mai mult și au fost foarte scăzute sau nedetectabile la majoritatea femeilor (P=0,03 în comparație cu prenaștere, Friedman RM-ANOVA-R). Încă 24 de ore mai târziu, toate femeile, cu excepția uneia, nu au fost parazitemii detectabile (P=0,005 în comparație cu prenaștere, RM-ANOVA-R). În ceea ce privește parazitemiile detectate prin PCR (Figura 1B), parazitemiile postpartum au fost semnificativ mai mici cu 24-48 de ore și 48-72 de ore decât înainte de naștere (P <.001, RM-ANOVA-R). Nivelurile au fost, de asemenea, semnificativ mai mici la 48-72 de ore postpartum decât la 8-16 ore postpartum (P <.001, RM-ANOVA-R). Parazitemiile estimate prin microscopie și qPCR au corelat semnificativ (P < .001). Aceste date confirmă rapoartele anterioare de eliminare rapidă și spontană postpartum a parazitemiei P. falciparum în rândul femeilor care trăiesc în zone cu transmitere stabilă a acestui parazit [8, 9].

Transcrierea paraziților a genelor var

To identify the likely sequestration focus of the IEs detected, we measured parasite transcription of the PfEMP1-encoding var gene groups. Prior to delivery, var2csa, which encodes VAR2CSA-type PfEMP1 mediating placental IE sequestration [2, 3], was the primary transcript (up to >90% din totalul transcripției var) la 9/17 femei și transcripția var2csa au putut fi detectate în toate (Figura 2 și Figura 1 suplimentară). Transcripția genelor var care nu sunt asociate cu malaria placentară a fost astfel detectată (în plus față de var2csa) la toți participanții pregătit și dominată la unele femei, în conformitate cu observațiile anterioare [6].

Proporția transcriptelor var2csa a scăzut în timpul urmăririi postpartum la toate femeile (Figura 2 și Figura 1 suplimentară), în paralel cu scăderea parazitemiilor (Figura 1). A existat astfel o schimbare marcată de la transcrierea var2csa înainte de livrare către transcrierea altor gene var postpartum. Singurele excepții (dintre acele femei în care erau disponibile date de transcripție postpartum) au fost participanții B213, S003, S001 și B201 (Figura suplimentară 1). Cu toate acestea, pe baza observației că parazitemiile postpartum au scăzut, de asemenea, semnificativ în rândul acelor femei (Figura 1), considerăm că este probabil ca o schimbare corespunzătoare de la transcrierea var2csa ar fi fost observată dacă ar fi fost disponibile date din momentele ulterioare. În general, datele sunt pe deplin în concordanță cu o dispariție selectivă a IE-urilor pozitive VAR2CSA, așa cum am emis ipoteza.

DISCUŢIE

PfEMP1 este o familie de proteine ​​exportate de paraziții intraeritrocitari P. falciparum la suprafața EI, unde funcționează ca liganzi de adeziune pentru diferiți receptori vasculari gazdă [2]. Acești liganzi sunt codificați de familia de gene var variantă clonală cu aproximativ 60 de membri per genom al parazitului haploid. Genele sunt transcrise și traduse într-un mod care se exclud reciproc, asigurându-se că doar un singur PfEMP1 este exprimat pe suprafața IE la un moment dat. Cu toate acestea, fiecare parazit are potențialul de a comuta între diferitele sale gene var, permițând modificări ale specificității adeziunii IE și ale proprietăților antigenice [2].

Proteinele PfEMP1 pot fi grupate și subgrupate în funcție de un set de criterii structurale, care le influențează caracteristicile funcționale [2]. Astfel, grupul A PfEMP1 (codificat de aproximativ o duzină de gene var per genom) mediază adeziunea IE la receptorii gazdă precum EPCR și ICAM-1 și au fost implicați în patogeneza malariei severe la copil în general și a malariei cerebrale. în special [2]. În schimb, transcripția genelor aparținând grupelor B și C pare să fie asociată cu malarie necomplicată și infecții asimptomatice. În cele din urmă, PfEMP1 de tip VAR2CSA, codificat de doar una sau câteva dintre genele var2csa per genom parazit, este complet diferit din punct de vedere funcțional și antigenic de toate celelalte PfEMP1 și este puternic implicat în patogeneza, precum și în imunitatea dobândită la placenta. malarie [2, 3, 13].

În plus, cea mai mare parte a dovezilor disponibile indică VAR2CSA drept principalul și probabil singurul ligand CSA de bună credință. În cele din urmă, s-a demonstrat anterior că parazitemia periferică la femeile însărcinate cu expunere pe tot parcursul vieții la P. falciparum include și este adesea dominată de EI care sunt VAR2CSA-pozitive și au fenotipul caracteristic general al infecțiilor placentare cu P. falciparum [5, 13– 15]. Pe această bază, am emis ipoteza că cea mai convingătoare explicație pentru eliminarea spontană a parazitemiei la gravide în câteva zile de la naștere [8, 9] este distrugerea selectivă a splenei a EI VAR2CSA pozitive după expulzarea placentei în timpul nașterii, care îndepărtează eficient receptorul lor de adeziune înrudit.

Rezultatele prezentate aici confirmă eliminarea rapidă postpartum raportată anterior [8, 9] a parazitemiei periferice P. falciparum (Figura 1). În plus, susțin observațiile conform cărora parazitemia periferică la femeile gravide africane include și este adesea dominată de paraziți care transcriu var2- csa [6, 15] (Figura 2 și Figura 1 suplimentară). Cel mai important, cu toate acestea, datele noastre extind aceste observații anterioare, oferind pentru prima dată dovezi convingătoare pentru o explicație mecanică pentru curățarea rapidă postpartum a paraziților periferici la femeile cu imunitate dobândită în mod natural la malaria P. falciparum. În afară de o diferență foarte minoră din punct de vedere numeric și doar la limită semnificativă în transcrierea grupului var A1 (Figura 2 suplimentară), singura schimbare majoră și semnificativă statistic în transcripția genelor var după naștere a fost transcrierea relativă redusă a var2csa (Figura 2B și suplimentară). Figura 2).

Studiul nostru are limitări. Dimensiunea eșantionului este mică. Acest lucru se datorează în principal implementării cu succes a tratamentului preventiv intermitent al malariei pentru femeile însărcinate, care a făcut ca malaria placentară să fie mult mai puțin răspândită și a necesitat screening-ul multor femei pentru a găsi participanți eligibili. În plus, facilitățile limitate de la locul nostru de studiu au împiedicat evaluarea directă a specificității receptorilor de adeziune a EI colectate sau a fenotipului lor imunologic. Cu toate acestea, dovezile actuale și constatările anterioare se combină perfect.

În concluzie, am prezentat dovezi că dispariția bruscă a focarului de sechestrare a EI VAR2CSA-pozitive atunci când placenta este expulzată contribuie semnificativ la eliminarea rapidă și spontană postpartum a parazitemiei P. falciparum la femeile cu expunere naturală la acești paraziți. Paraziții care transcriu alte gene var și afișează PfEMP1 de tip non-VAR2CSA pe suprafața IE sunt adesea incapabili să prospere și să provoace boli la adulți din zonele endemice, din cauza imunității specifice PfEMP1-protectoare la malarie dobândită în copilărie [2] . Supraviețuirea continuă a EI non-VAR2CSA postpartum poate fi compromisă și mai mult de procesele fiziologice asociate nașterii, cum ar fi răspunsurile imune proinflamatorii. În cele din urmă, aportul nedezvăluit de medicamente antimalarice imediat înainte de naștere ar putea contribui. Indiferent de motiv, parazitemia a scăzut semnificativ după naștere la unele femei, unde paraziții de transcripție var2csa constituiau doar o minoritate din parazitemia prenaștere, iar această constatare merită un studiu suplimentar. Studiul nostru susține rolul cheie al PfEMP1 în imunitatea dobândită la malarie în general, și în special al VAR2CSA în patogeneza și imunitatea malariei placentare.

Date suplimentare

Materiale suplimentare sunt disponibile online pe The Journal of Infectious Diseases. Constând din date furnizate de autori în beneficiul cititorului, materialele postate nu sunt copiate și sunt în responsabilitatea exclusivă a autorilor, astfel încât întrebările sau comentariile trebuie adresate autorului corespunzător.

Note

Contribuții ale autorului.

NGA, MPQ, MFO și LH au contribuit la conceperea și proiectarea studiului. NGA a efectuat colectarea probelor. NGA, MPQ și LH au efectuat analiza datelor. NGA, MPQ și LH au pregătit manuscrisul. Toți autorii au citit și au aprobat versiunea finală a manuscrisului.

Mulțumiri.

Suntem recunoscători tuturor femeilor care au acceptat să participe la studiul nostru. De asemenea, le mulțumim tuturor moașelor, medicilor, asistenților medicali și asistentelor din diferite unități sanitare pentru ajutorul acordat în recoltarea probelor.

Disclaimer.

Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului. Finanțarea pentru plata taxelor de publicare cu acces deschis pentru acest articol a fost oferită de Danida.

Sprijin financiar.

Această lucrare a fost susținută de Danida (numărul de grant 17-02-KU pentru proiectul MAVARECA-II), inclusiv o bursă de doctorat pentru NGA. Agenția Executivă pentru Cercetare a Comisiei Europene a sprijinit MPQ (numărul de grant 101028915, Marie Skłodowska-Curie Individual Fellowship 2020 , proiect PAMSEQ).

Potențiale conflicte de interese.

Toți autorii: Nu au fost raportate conflicte de interese. Toți autorii au trimis Formularul ICMJE pentru dezvăluirea potențialelor conflicte de interese. Au fost dezvăluite conflictele pe care editorii le consideră relevante pentru conținutul manuscrisului.

Referințe