Factorii de risc și implicațiile asociate cu mineralizarea renală în boala cronică de rinichi la pisici

ABSTRACT

1. Fundal

Nefrocalcinoza este o caracteristică patologică a bolii cronice de rinichi (IRC). Implicațiile sale patofiziologice pentru pisicile cu CKD sunt neexplorate.

2. Obiective

Identificați factorii de risc pentru nefrocalcinoză și evaluați influența acestora asupra progresiei IRC și asupra mortalității de toate cauzele.

3. Animale

Cincizeci și una de pisici deținute de clienți eutiroidieni cu International Renal Interest Society (IRIS) în faze 2-3 BRC azotemică.

4. Metode

Studiu retrospectiv de cohortă. Secțiunile histopatologice de rinichi au fost evaluate pentru nefrocalcinoză (colorație von Kossa). Severitatea nefrocalcinozei a fost determinată prin analiza imaginii (Imagine J). Au fost efectuate regresii logistice ordinale pentru a identifica factorii de risc de nefrocalcinoză. Influența nefrocalcinozei asupra progresiei CKD și a riscului de mortalitate au fost evaluate folosind un model mixt liniar și, respectiv, regresia Cox. Pisicile au fost clasificate în funcție de aportul mediu cu dietă restricționată în fosfați (PRD) raportat de proprietar, unde PRD a cuprins Mai mult sau egal cu 50 la sută, 10-50 la sută sau niciunul din aportul alimentar.

5. Rezultate

Nefrocalcinoza a fost evaluată ca ușoară până la severă în 78,4% și absentă până la minimă în 21,6% din cazuri. Concentrație inițială de calciu total în plasmă mai mare (tCa; raportul cotelor [OR]=3.07 la 1 mg/dL; P=.{02) și consumul de PRD (10 procente -50 procente: SAU=8,35; P=.01; Mai mare sau egal cu 50 la sută: SAU {{20 }}.47; P=.01) au fost factori de risc independenți de nefrocalcinoză. Pisicile cu nefrocalcinoză absentă până la minimă au avut creatinine plasmatice în creștere (0,250 ± 0,074 mg/dL/lună; P=.002), uree (5,06 ± 1,82 mg/dL/lună; P=. 01) și concentrații de fosfat (0,233 ± 0,115 mg/dL/lună; P=.05) pe parcursul unui an și au avut timpi medii de supraviețuire mai scurti decât pisicile cu nefrocalcinoză uşoară până la severă.

6. Concluzie și importanță clinică

TCa plasmatic mai mare la diagnosticul CKD și aportul de PRD sunt asociate independent cu nefrocalcinoza. Cu toate acestea, nefrocalcinoza nu este asociată cu progresia rapidă a CKD la pisici.

Faceți clic aici pentru a afla care sunt efectele Cistanche asupra rinichilor

CUVINTE CHEIE

calcificare, CKD-MBD, hipercalcemie, nefrocalcinoză.

INTRODUCERE

Tulburări ale metabolismului mineral și osos sunt prezente la pisicile cu boală cronică de rinichi (IRC), chiar și în stadiile incipiente ale bolii.1,2 Rinichii joacă un rol fundamental în homeostazia calciului și fosfatului. O scădere treptată a nefronilor funcționali în CKD are ca rezultat retenția de fosfat,3 stimularea hormonilor fosfaturici, factorul de creștere a fibroblastelor 23 (FGF23) și, ulterior, hormonul paratiroidian (PTH), pentru a menține concentrațiile fiziologice de fosfat plasmatic.4-6 Cu toate acestea, nu numai. influenteaza acest raspuns adaptativ reglarea metabolismului calciului dar si remodelarea osoasa. Când acest răspuns adaptiv nu reușește în cele din urmă să împiedice creșterea concentrației de fosfat plasmatic, promovează calcificarea ectopică. Aceste răspunsuri adaptive sunt denumite în mod colectiv boală renală cronică - tulburare minerală și osoasă (CKD-MBD).7

Nefrocalcinoza este caracterizată prin depunerea tubulointerstițială de fosfat de calciu (CaP) sau oxalat de calciu (CaOx),8 la om aproape exclusiv în medularul renal.9 Acest proces începe de la formarea plăcilor lui Randall în papilele renale, care acționează ca un nadir pentru calcificarea progresivă. .9,10 Observarea acestui fenomen la microscopie luminoasă este denumită nefrocalcinoză microscopică (denumită aici nefrocalcinoză).8,11 Calcificarea ectopică spontană poate fi explicată, parțial, prin precipitarea sărurilor de calciu și fosfat din fluidul suprasaturat atunci când produsul fosfat de calciu. (CaPP) depășește produsul de solubilitate. Studiile anterioare au arătat că concentrația crescută de fosfat seric și CaPP s-au corelat pozitiv cu conținutul renal de calciu12,13 și creșterea concentrației de calciu seric a fost un factor de risc independent pentru nefrocalcinoză la pacienții umani cu BRC. 15 Depunerea renală de calciu a fost găsită în histologie la 50% sau egală cu 50% dintre pisicile cu Stadiul 2 până la 4 al Societății Internaționale de Interes Renal (IRIS), comparativ cu 21% la pisicile non-azotemice.15 In vivo la șobolani, conținut de calciu renal. a fost corelată negativ cu clearance-ul creatininei, sugerând un impact nociv asupra funcției renale.13,16

Pisicile cu CKD prezintă un risc crescut de a dezvolta hipercalcemie totală în plasmă, prevalența crescând odată cu azotemia avansată.17 La pisicile CKD care consumă o dietă restricționată în fosfat (PRD), creșterea concentrațiilor plasmatice de fosfat și calciu total (tCa) sunt asociate cu progresia CKD. 18 Cu toate acestea, rămâne de stabilit dacă dereglarea homeostaziei calciului și fosfatului joacă un rol în patogenia nefrocalcinozei. Mai mult, implicațiile nefrocalcinozei asociate cu CKD la pisici nu au fost investigate. Obiectivele studiului nostru au fost: (a) să exploreze factorii de risc pentru nefrocalcinoză la pisicile CKD și (b) să evalueze asocierile nefrocalcinozei cu modificările parametrilor CKD-MBD, progresia CKD și mortalitatea de orice cauză.

Cistanche tubulosa

METODE

1. Selectarea cazului

Înregistrările a 2 practici de primă opinie din Londra, între 1 ianuarie 1992 și 31 decembrie 2017, au fost revizuite și au fost identificate pisici CKD azotemice care au fost supuse unor examinări necropsie complete. Diagnosticul de CKD azotemic a fost definit ca o concentrație plasmatică a creatininei mai mare sau egală cu 2 mg/dL cu o greutate specifică a urinei (USG)<1.035, or plasma creatinine concentration ≥2 mg/dL on 2 consecutive occasions 2-4 weeks apart without evidence of a pre-renal cause. All cats with a CKD diagnosis were offered a PRD. A variety of PRD was used throughout the study (Feline Low Protein Diet [wet]; Masterfoods, Bruck, Austria; Waltham Veterinary Diet, Feline Low Phosphorus Low Protein [dry and wet]; Effem, Minden, Germany [dry] and Masterfoods, Bruck, Austria [wet]; Feline Veterinary Diet Renal [dry and wet], Royal Canin SAS, Aimargues, France [dry] and Masterfoods, Bruck, Austria [wet]) with a phosphorus content of 0.7-1.1 g/Mcal and calcium-to phosphorus ratio (Ca:P) of 1.3-2.1. Cats not accepting a PRD continued on their maintenance diets.

Inclusion required a formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) kidney block for histopathological evaluation. Cats were excluded if they had clinically suspected hyperthyroidism and their plasma total thyroxine (TT4) concentration was >40 nmol/L, erau tratați medical pentru hipertiroidism, aveau dovezi ale unei alte boli concomitente sau erau tratați cu corticosteroizi, furosemid sau bifosfonați. Au fost excluse, de asemenea, pisicile cu IRIS CKD stadiul 4 la diagnostic și pisicile fără o vizită de urmărire după diagnosticul CKD. Au fost incluse pisicile care au primit amlodipină besilat pentru hipertensiune arterială sistemică.

2. Date clinicopatologice

Probele de sânge, urină și necropsie au fost colectate cu consimțământul informat al proprietarului și cu aprobarea Comitetului de etică și bunăstare al Colegiului Veterinar Regal (URN20131258E). Probele de sânge au fost colectate prin puncție venoasă jugulară în tuburi heparinizate și acid etilendiaminotetraacetic (EDTA), iar urină a fost obținută prin cistocenteză. Probele au fost depozitate la 4 C pentru<6 hours before centrifugation and separation. Heparinized plasma was analyzed biochemically at an external laboratory (IDEXX laboratories, Wetherby, UK). Inhouse urinalyses, including USG measurement by refractometry, dipstick chemical analysis, and microscopic urine sediment examination, were performed on the day of collection. Urinary tract infection was confirmed by bacterial culture (Royal Veterinary College Diagnostic Laboratory Services, Hatfield, UK).

Systolic blood pressure (SBP) measurements were made as previously described by Doppler.19 Indirect ophthalmoscopy was performed using a retinal camera (ClearView, Optibrand, Fort Collins, Colorado) in cats with an average SBP >160 mm Hg. Systemic hypertension was defined as an average SBP >160 mm Hg in conjunction with ocular pathology consistent with hypertensive damage, or SBP >170 mm Hg de 2 ocazii consecutive.

Clinical records were reviewed to extract the following: age, sex, breed, body weight, SBP, tCa, ionized calcium (iCa), plasma creatinine, urea, phosphate, potassium, sodium, chloride, total protein, albumin, and TT4 concentrations, plasma alanine aminotransferase (ALT) and alkaline phosphatase (ALP) activities, PCV, USG, and urine culture results. The proportion of PRD recorded as being fed at every visit (until death) from each cat with PRD prescribed after CKD diagnosis was reviewed from our clinical records. Owners were asked at each visit to estimate the proportion of PRD by volume of the total quantity of food fed. A time-averaged proportion of PRD fed by volume of the total ration was calculated from this estimate for each cat. Where the proportion fed was missing from the record at a particular visit, the proportion stated at the previous visit was imputed, except if it was the visit at which euthanasia was recommended and the cat had deteriorated clinically from the previous visit. Cats were categorized according to the time-averaged ingestion of PRD, where PRD comprised ≥50%, >10 la sută,<50%, or none of their food intake for their CKD duration.

Supliment Cistanche

3. Date histopatologice

Examinările necropsie au fost oferite tuturor clienților atunci când pisicile lor au fost eutanasiate și a fost obținut consimțământul informat de la cei care au fost de acord. La necropsie, fiecare rinichi a fost disecat longitudinal și transversal și fixat (10 procente de formol tamponat neutru). Țesuturile renale fixate cu formol (inclusiv cortexul și medulara) au fost încorporate în parafină pentru evaluarea histopatologică viitoare. O secțiune de 4-μm de țesut FFPE a fost colorată cu von Kossa pentru a identifica depozitele de hidroxiapatită.20 Secțiunile de rinichi sagitali colorate au fost fotografiate, orbite la datele de caz, folosind un microscop digital (Leica DM4000, Wetzlar, Germania) pentru evaluarea microscopică a nefrocalcinozei. (Figura 1). ImageJ (Versiunea 2.1.0, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland) a fost utilizată pentru a cuantifica nefrocalcinoza din imaginile reprezentative capturate în regiunea medulară. Nefrocalcinoza a fost clasificată în funcție de proporția medie de țesut colorat pozitiv din 5 imagini medulare capturate la 10 măriri. Au fost clasificate după cum urmează:<0.06% = grade 0, 0.06% to 1% = grade 1, and >1 la sută=clasa 2 (Figura 1). Acest sistem de clasificare, predeterminat înainte de analizele statistice, a oferit o cuantificare obiectivă a severității nefrocalcinozei (0,06 la sută și 1 la sută sunt echivalente cu 1 10 5 cm2 și, respectiv, 1,4 10 4 cm2). O secțiune FFPE adiacentă din fiecare caz a fost colorată cu roșu alizarina (la pH 4,2), permițând diferențierea cristalelor de CaP și CaOx.20

FIGURA 1 Rinichi, colorare von Kossa, mărire x10. Un exemplu pentru fiecare grad de nefrocalcinoză (0-2) este prezentat după cum urmează: (A) și (B) cat nr. 7 cu nefrocalcinoză de grad 0 (0,004 la sută); (C) și (D) cat nr. 34 cu nefrocalcinoză de gradul 1 (0,327 la sută); (E) și (F) cat nr. 39 cu nefrocalcinoză de gradul 2 (5,51 la sută). Colorarea pozitivă Von Kossa este subliniată cu culoare neagră în imaginile originale (A, C și E) sau roșu aprins după procesare folosind ImageJ (B, D și F; culoare 8-biți; prag {{16} }) pentru cuantificarea ariei proporționale a nefrocalcinozei în fiecare caz (n=51)

4. Micro-tomografie computerizată (micro-CT) pentru nefrocalcinoza macroscopică

Blocurile de rinichi FFPE au fost scanate pentru nefrocalcinoză macroscopică utilizând un scaner de microtomografie computerizată (CT) (Skyscan 1172, Bruker, Kontich, Belgia) folosind o cameră mică (4000 x 2672 pixeli) fără filtru. Imaginile au fost obținute folosind următorii parametri de scanare: dimensiunea voxelului izotrop 5 μm per pixel, tensiunea sursei 50 kV, curentul sursei 200 μA, timpul de expunere 670 ms și scanarea cu rotație a imaginii 180 cu un pas de rotație de 0,4. Imaginile de proiecție au fost reconstruite în tomograme folosind NRecon 1.7.5.9 (Bruker, Kontich, Belgia) și repoziționate folosind Dataviewer 1.5.6.6 (Bruker, Kontich, Belgia). Tomogramele au fost analizate folosind software-ul de analiză Bruker CT-Analyzer (CTAn) 1.20.3 (Bruker, Kontich, Belgia) și vizualizările 3-dimensionale (3D) redate în volum au fost create folosind CTVox 3.3 (Bruker Kontich, Belgia). Pe scurt, pentru fiecare bloc, volumul de țesut a fost calculat prin înmulțirea adâncimii cu aria medie de la 5 tomograme distanțate la distanțe egale de-a lungul probei; Volumul nefrocalcinozei a fost calculat folosind instrumentul de analiză 3D în CTAn. Raportul volum al nefrocalcinozei-țesut renal (VN: KT) a fost calculat folosind formula:

5. Analiză statistică

Analizele statistice au fost efectuate folosind software-ul R (Versiunea 4.1.1 GUI 1.77 High Sierra build, R Foundation for Statistical Computing, Viena, Austria). Rata de eroare de tip I a fost setată la .05. Variabilele continue au fost evaluate pentru normalitate prin inspecția vizuală a histogramelor și folosind testul Shapiro-Wilk. Testul lui Levene a fost folosit pentru a testa dacă grupurile aveau variații egale. Majoritatea datelor nu au fost distribuite în mod normal și, prin urmare, datele numerice sunt prezentate ca mediană (25, 75 percentila) pentru coerență. Datele categorice sunt prezentate sub formă de procente.

5.1 Factori de risc de nefrocalcinoză

Variabilele de referință au fost comparate între grupuri fie prin analiza varianței 1-modale (ANOVA), urmată de testul post-hoc Tukey sau testul post-hoc Kruskal-Wallis și Dunn pentru variabile continue cu distribuții normale sau, respectiv, distorsionate. Proporțiile rezultatelor categorice au fost comparate folosind testul exact al lui Fisher.

Factorii de risc de nefrocalcinoză microscopică inițială au fost evaluați utilizând regresia logistică ordinară. Vârsta, greutatea corporală, tCa, creatinina, uree, fosfat, potasiu, sodiu, clorură, proteine ​​totale, albumină, ALT, ALP, PCV, USG și timpul de supraviețuire CKD au fost introduse ca variabile continue, în timp ce sexul și proporția de PRD ingerată ( „Nu mănâncă PRD” vs „Mânca 10 la sută –50 la sută PRD” vs „Mâncare mai mare sau egal cu 50 la sută PRD”) au fost introduse ca variabile categorice pentru analizele univariabile. Variabilele asociate cu nefrocalcinoza la P < 0,10 și cu date disponibile pentru cel puțin jumătate dintre pisici (n > 25), au fost introduse într-un model multivariabil. S-a aplicat eliminarea manuală înapoi pentru a obține modelul final cu P < .05. Versiunea ordinală a testului Hosmer-Lemeshow a fost utilizată pentru a evalua gradul de potrivire al modelului final, iar prezența coliniarității între factorii de risc independenți semnificativi (P < 0,05) a fost evaluată prin factorul de inflație al varianței. Reziduurile pentru valori aberante și observațiile influente au fost verificate prin inspecție vizuală a parcelei Quantile-Quantile. O relație liniară între predictorul continuu și logit a fost evaluată prin clasificarea variabilelor în intervale egale de „scăzut”, „mediu” și „ridicat” în analiza regresiei logistice și evaluând tendința de creștere sau scădere a coeficientului. Rezultatele sunt raportate ca odds ratio (OR; interval de încredere [IC] de 95%).

5.2 Modificări ale parametrilor CKD-MBD în timp despre nefrocalcinoză

Modelele liniare cu efecte mixte au fost utilizate pentru a evalua modificările variabilelor clinicopatologice continue în timp. Datele longitudinale de la toate vizitele disponibile în primele 365 de zile după diagnosticul CKD au fost incluse pentru următoarele: greutate corporală, tCa, creatinina, uree, fosfat, potasiu, sodiu, clorură, proteine ​​totale, albumină, ALT, ALP și PCV. Grupul („grad 0” vs „grad 1” vs „grad 2”), timpul (în luni [30,4 zile]) și interacțiunea dintre grup și timp au fost tratate ca efecte fixe. Numărul de caz al fiecărei pisici și timpul imbricat în fiecare pisică au fost incluse ca 2 efecte aleatoare necorelate. S-a presupus că reziduurile sunt independente în model și a fost verificată normalitatea. Nu a fost făcută nicio încercare de a imputa datele lipsă. Rezultatele sunt raportate ca coeficient ( ) ± SE.

5.3 Asocierea nefrocalcinozei și a altor factori cu supraviețuirea

Data diagnosticului de CKD azotemic a fost definită ca punct de referință, în timp ce decesul de orice cauză a fost evenimentul de interes. Timpii de supraviețuire au fost reprezentați cu o curbă Kaplan-Meier și au fost comparați între grupuri folosind testul log-rank și Kruskal-Wallis cu testele posthoc lui Dunn, deoarece toate pisicile au atins obiectivul de studiu. Variabilele de referință asociate cu supraviețuirea au fost explorate utilizând analiza hazardului proporțional Cox. Reziduurile Martingale au fost utilizate pentru a evalua ipoteza liniarității variabilelor continue în modelul Cox. Reziduurile pentru valorile aberante și observațiile influente au fost verificate prin inspecție vizuală a parcelei Quantile-Quantile. Variabilele continue au fost transformate în variabile categoriale bazate pe tertile (vârstă, sodiu) dacă nu au fost îndeplinite ipoteza pericolelor proporționale, așa cum a fost evaluată prin inspecția curbei Kaplan-Meier, și evaluarea independenței dintre fiecare variabilă și timp. Variabilele asociate cu supraviețuirea cu P < .10 în analizele univariabile au fost introduse într-un model Cox multivariabil. Modelul final de regresie Cox a fost derivat prin eliminare manuală înapoi cu P < .05. Rezultatele sunt raportate ca hazard ratio (HR; 95% CI).

5.4 von Kossa cu corelație cu colorarea roșie de alizarina și nefrocalcinoză macroscopică

Pentru fiecare caz, au fost calculate zonele proporționale de nefrocalcinoză din medularul renal la mărire X 2,5, colorate separat cu von Kossa și roșu Alizarin. Relația dintre aceste 2 tehnici de colorare pentru nefrocalcinoza microscopică a fost evaluată folosind corelația lui Spearman. Într-un subset de 49 de cazuri, nefrocalcinoza macroscopică a fost evaluată folosind micro-CT. Corelația lui Spearman a fost utilizată pentru a evalua relația dintre volumul nefrocalcinozei proporționale (micro-CT) și aria nefrocalcinozei proporționale (von Kossa, prezentare generală X 0.14- X 0.36 mărire).

Extract de Cistanche

DISCUŢIE

Rezultatele noastre au indicat că concentrația plasmatică inițială mai mare de tCa și ingestia de PRD au fost independente de factorii de risc de nefrocalcinoză. Pisicile cu nefrocalcinoză de grad 0 au fost asociate cu creșterea concentrațiilor plasmatice de creatinine, uree și fosfat în primele 365 de zile după diagnosticul de CKD azotemic. Această cohortă de pisici a avut, de asemenea, timpi de supraviețuire semnificativ mai scurti în comparație cu cei cu nefrocalcinoză mai severă (grade 1 și 2). S-a observat o asociere pozitivă independentă semnificativă între restricția alimentară de fosfat și supraviețuire.

Mineralizarea renală este un proces complicat și cu mai multe fațete, iar patogeneza sa în asociere cu CKD rămâne neclară. Cu toate acestea, dovezi tot mai mari sugerează că tulburările metabolismului mineral, în special calciul și fosfatul, pot contribui probabil la nefrocalcinoză.11,12 În studiul nostru, tCa plasmatic mai mare la diagnosticul de CKD, chiar și cu tCa în intervalul de referință, a reprezentat un risc independent de nefrocalcinoză. factor; doar 1 (2 la sută) pisică a avut hipercalcemie totală la momentul inițial. Această descoperire sugerează că perturbații ușoare ale homeostaziei calciului pot promova mineralizarea renală la pisicile CKD. În concordanță cu constatările noastre, un studiu CKD la oameni a arătat că concentrația serică de tCa a fost un factor de risc independent de nefrocalcinoză.11 În plus, o asociere între hipercalcemie totală și nefrocalcinoză a fost găsită la pacienții umani după transplant de rinichi,21 și la pacienții cu nefrocalcinoză macroscopică prin imagistica CT. au avut concentrații mai mari de tCa și iCa decât cele fără.22 Cu toate acestea, un studiu histopatologic la oameni nu a găsit nicio asociere a concentrației serice de tCa cu conținutul renal de calciu și depunerea de calciu tubular renal.12 Discrepanțele în implicarea calciului în nefrocalcinoză dintre studii sunt atribuibile studiului. heterogenitatea populației, dimensiunea eșantionului și metodele de detectare a calcificării renale.

Ingestia unui PRD a fost identificată ca un factor de risc independent de nefrocalcinoză la pisicile CKD în studiul nostru. Restricția alimentară a fosfatului influențează semnificativ reglarea minerală și hormonală în CKD-MBD, inclusiv scăderi ale FGF23 și PTH.23,24 Un studiu recent a arătat că anumite pisici CKD au dezvoltat o tendință de creștere a concentrațiilor de tCa și iCa, împreună cu o excreție urinară mai mare de calciu, după o Inițierea PRD.18 Conținut mai scăzut de fosfat alimentar și raportul Ca:P mai mare, în comparație cu alimentele disponibile comercial formulate pentru pisici adulte sănătoase,25 ar putea îmbunătăți absorbția intestinală de calciu și crește concentrația de calciu în plasmă.26 La pacienții umani, hipercalciuria este o întâlnire frecventă. factor de risc de nefrocalcinoză.27 Se postulează, prin urmare, că nefrocalcinoza poate fi determinată de creșterea concentrației plasmatice de tCa și de excreția urinară sporită a calciului după trecerea la un PRD la pisicile CKD. Cu toate acestea, dovezi directe care susțin această ipoteză nu au putut fi obținute în studiul nostru și sunt necesare studii prospective care măsoară electroliții urinari.

Rezultatele noastre au arătat că nefrocalcinoza nu este asociată pozitiv cu progresia CKD și cu mortalitatea de orice cauză. Această constatare este intrigantă, deoarece este oarecum contrară unui studiu anterior pe oameni care sugera un rol dăunător al nefrocalcinozei asupra funcției renale prin identificarea unei corelații pozitive între conținutul renal de calciu și concentrația de creatinine serice.12 Nefrocalcinoza identificată prin imagistică (CT, ultrasonografie sau radiografia) a fost, de asemenea, asociată cu un risc crescut de boală renală în stadiu terminal la pacienții umani.28 Un studiu la pisici cu BRC a arătat asocierea mineralizării renale cu inflamație interstițială și fibroză mai severă, sugerând rolul acesteia în accelerarea progresiei BRC.15 Cu toate acestea, recent studiile de cohortă care au implicat pacienți umani cu imagistică CT renală au descoperit o lipsă de asociere între funcția renală și calcificarea renală.22,29 Această observație este în concordanță cu rezultatele noastre și susține ipoteza noastră că nefrocalcinoza, într-o anumită măsură, ar putea să nu exercite un efect dăunător direct. asupra funcției renale și contribuie la progresia IRC. Cu toate acestea, sunt necesare studii viitoare prospective pentru a înțelege mai bine implicațiile nefrocalcinozei pentru deteriorarea CKD la pisici.

Deși ingestia de PRD a fost un factor de risc independent de nefrocalcinoză, analiza noastră de supraviețuire a arătat că restricția alimentară de fosfat (atunci când a fost ingerată PRD mai mare sau egală cu 50 la sută) a fost asociată cu MST mai lungă și a crescut șansele de supraviețuire cu până la 3- fold pentru pisicile CKD în comparație cu pisicile care și-au consumat dietele de întreținere (Tabelul 4 și Figura 4). Aceste constatări susțin studiile anterioare care au constatat un beneficiu de supraviețuire care rezultă din restricția alimentară a fosfatului la pisicile CKD.30-32 În plus, rezultatele sub-analizei noastre (Tabelele S2 și S3) au arătat că pisicile CKD care au continuat să fie hrănite cu diete de întreținere au avut creșteri mai mari ale concentrațiilor plasmatice de creatinine, uree și fosfat și o scădere a PCV și a greutății corporale în primul an după diagnosticul CKD, întărind și mai mult dovezile actuale privind efectele benefice ale restricției dietetice de fosfat pentru atenuarea progresiei bolii.23,24,32, 33 Hiperfosfatemia este asociată cu o scădere a funcției renale,34 și s-a demonstrat că lianții de fosfat protejează împotriva progresiei CKD.35,36.

Concentrația de fosfat plasmatic și PCV au fost predictori independenți ai mortalității de toate cauzele. Hiperfosfatemia și anemia sunt asociate cu CKD mai progresivă și cu un prognostic mai prost la pisici și oameni.37-42 Retenția de fosfat apare pe măsură ce rata de filtrare glomerulară (RFG) scade, dar, în stadiile incipiente ale CKD, concentrațiile plasmatice de fosfat sunt de obicei menținute în limitele fiziologice. limite ca urmare a mecanismelor de reglare hormonală adaptativă, inclusiv creșterea producției de FGF23 și PTH și scăderea producției de calcitriol.6,43 Prin urmare, concentrația plasmatică mai mare de fosfat la diagnosticul de CKD ar putea sugera o homeostazie a fosfatului mai grav deranjată și asociată cu un risc mai mare de deces. . În concordanță cu rezultatele noastre, un studiu anterior a constatat că o concentrație mai mare de fosfat seric a fost asociată în mod independent cu supraviețuirea la 773 de pisici CKD.42 Patogenia anemiei în CKD este multifactorială, dar scăderea producției de eritropoietină este un factor principal care contribuie.42,44 În sprijinul nostru. descoperiri, alte studii au găsit, de asemenea, o asociere între PCV mai scăzut și mortalitate crescută la pisicile CKD,38,39,45, dar nu toate.42 Interesant, nici concentrația plasmatică a creatininei, nici stadializarea IRIS nu au fost un predictor al decesului în studiul de față, ceea ce este inconsecvent. cu studii anterioare.38,39,42,45,46 Concentrația plasmatică a creatininei reflectă RFG și este un biomarker surogat utilizat în mod obișnuit pentru a evalua funcția renală.47 Discrepanța ar putea fi explicată prin excluderea pisicilor IRIS în stadiul 4 CKD din studiul nostru și dimensiunea eșantionului relativ mică, cu doar 17 pisici IRIS în stadiul 3 CKD. În plus, 29% (n=15) dintre pisicile cu CKD azotemic din studiul nostru nu au primit un tratament alimentar pentru CKD, ceea ce ar fi putut afecta rezultatul și a împiedicat o evaluare precisă a valorii predictive a concentrației plasmatice a creatininei și, potențial, alte variabile la momentul diagnosticului CKD asupra supraviețuirii în studiul nostru.

Detectarea depunerilor de calciu a fost efectuată atât cu metoda von Kossa folosind nitrat de argint, cât și colorare cu roșu alizarina. Principiul metodei von Kossa se bazează pe legarea ionilor de argint cu anioni, cum ar fi fosfatul, oxalatul și carbonatul, din țesuturile calcificate și reducerea sărurilor de argint, ducând la observarea colorării cu argint negru metalic.20,48,49. Colorarea cu roșu alizarină este o altă tehnică folosită pentru demonstrarea cristalelor de calciu.50 Se leagă direct de ionii de calciu și poate fi folosită pentru a diferenția CaOx de CaP deoarece CaOx poate fi colorat doar cu roșu alizarin la un pH de 7, dar nu la pH 4,2, cu aceasta din urmă utilizată în studiul nostru.51,52 Am observat o corelație puternică între aceste două metode de colorare a nefrocalcinozei, sugerând că zăcămintele minerale au fost compuse în principal din CaP. Această observație este interesantă deoarece majoritatea uroliților tractului urinar superior la pisici conțin CaOx.53 Este posibil ca precipitarea CaP să fie o condiție prealabilă pentru nefrocalcinoză, nefrolitiază sau ambele la pisici, proces care seamănă cu formarea plăcilor Randall la om. 8 Scanarea micro-CT a fost efectuată pe probele de rinichi FFPE pentru a determina dacă o singură lamă colorată cu von Kossa a fost reprezentativă pentru nefrocalcinoză. Am găsit o corelație moderată între nefrocalcinoza micro și macroscopică, susținând în continuare tehnicile și metodele cantitative utilizate pentru clasificarea severității nefrocalcinozei în studiul nostru, dar sugerând, așa cum ar fi de așteptat, că o singură secțiune de țesut renal oferă o estimare aproximativă a severității nefrocalcinoza macroscopică evaluată prin imagistică 3D.

Cistanche capsule

Studiul nostru retrospectiv a avut unele limitări. Nefrocalcinoza a fost identificată din probe de rinichi recoltate la necropsie și nu se știe în ce moment s-a dezvoltat calcificarea renală la aceste pisici. Nefrocalcinoza se poate dezvolta înainte de diagnosticul CKD. În studiu au fost incluse doar pisicile la care s-a efectuat un examen necropsic. Prin urmare, este posibil să fi avut loc o eroare de selecție, chiar dacă examinările necropsie au fost oferite tuturor clienților când pisicile lor au fost eutanasiate la clinicile noastre. O mare varietate de diete de întreținere au fost hrănite înainte de trecerea la un PRD. Deși concentrațiile exacte de minerale din aceste diete au fost dificil de determinat, se raportează că valorile mediane ale conținutului de fosfor și Ca:P sunt 3 g/Mcal și, respectiv, 1,3, printre 82 de alimente pentru pisici disponibile în comerț.25 Prin urmare, este logic să presupunem că pisicile care au acceptat un PRD după diagnosticul CKD au primit un aport alimentar de fosfat mai mic și Ca:P alimentar mai mare decât cele care au continuat să fie hrănite cu diete de întreținere. Deoarece alocarea grupului PRD nu a fost randomizată (tuturor pisicilor li sa oferit un PRD ca parte a strategiei lor de management pentru CKD în studiul nostru din motive etice), este posibil să fi fost introdusă o prejudecată de selecție, chiar dacă nu au fost identificate diferențe între variabilele clinicopatologice. 3 grupuri la momentul inițial. Prin urmare, efectele PRD asupra progresiei și mortalității CKD ar trebui interpretate cu prudență, deoarece motivul necunoscut pentru care pisicile nu au mâncat PRD poate fi legat de supraviețuirea lor mai slabă. În plus, o varietate de PRD, cu diferențe în conținutul de fosfor și Ca:P, au fost oferite pe parcursul perioadei de studiu și nu se poate deduce că rezultatele studiului nostru pot fi generalizate la toate PRD disponibile comercial, deoarece, deși proprietățile generale ale clinicii renale dietele sunt similare, există variații în formularea dietei. Este necesar un studiu longitudinal prospectiv pentru a investiga în continuare efectul cauzal al restricției alimentare de fosfat asupra nefrocalcinozei. În mod intrigant, amploarea calcificării macroscopice ar putea fi evaluată folosind scanarea micro-CT în studiul nostru. Cu toate acestea, volumul țesutului renal FFPE ar fi putut fi supraestimat din cauza interferenței cerii de parafină. Deși au fost obținute măsurători ale suprafețelor multiple de țesut la intervale regulate de adâncime pentru a oferi cea mai bună estimare posibilă a volumului țesutului, raportul VN: KT ar fi putut fi subestimat. Cu toate acestea, se consideră că această posibilitate are un impact relativ minor asupra corelației dintre nefrocalcinoza micro și macroscopică raportată. În cele din urmă, nefrocalcinoza a fost asociată cu hiperparatiroidismul la pacienții umani.29 Această asociere este cel mai probabil atribuită creșterii concentrațiilor plasmatice și urinare de calciu, excreției urinare de fosfat și reabsorbției renale a calciului stimulată de PTH, ducând la calcificarea renală.54, 55 Factor de creștere a fibroblastelor-23 a fost, de asemenea, sugerat a fi implicat în nefrocalcinoză.56 Din păcate, datele despre FGF23, PTH și electroliții urinari nu au fost disponibile în studiul nostru; prin urmare, implicarea lor în nefrocalcinoză nu a putut fi investigată. Această limitare interzice evaluarea ulterioară a contribuției potențiale a hipercalciuriei sau hiperfosfaturiei la nefrocalcinoză. Starea calciului la pisicile din studiul nostru a fost evaluată prin tCa, deoarece măsurarea iCa biologic activă nu a fost disponibilă la majoritatea pisicilor. Studii suplimentare, inclusiv FGF23 plasmatic, PTH, iCa și măsurători ale calciului și fosfatului urinar, sunt justificate pentru a caracteriza dacă acești factori joacă un rol mai important în nefrocalcinoză.

În mod colectiv, am arătat că concentrația plasmatică mai mare de tCa la diagnosticul CKD și restricția alimentară a fosfatului sunt factori de risc independenți pentru nefrocalcinoză, deși cauzalitatea nu poate fi determinată. Calcificarea extraosă este un proces complex și cu mai multe fațete, care este reglat activ de diverși inductori și inhibitori.57,58 Rolul inhibitorilor endogeni ai calcificării, cum ar fi magneziul, fetuina-A și pirofosfatul, asupra nefrocalcinozei rămâne de explorat la pisicile CKD. În plus, la pisici, nefrocalcinoza nu pare să fie asociată cu rapiditatea progresiei bolii și riscul de mortalitate de orice cauză în studiul nostru. Cu toate acestea, ingestia de PRD mai mare sau egală cu 50 la sută poate scădea riscul de mortalitate de orice cauză și poate prelungi supraviețuirea la pisicile CKD. Aceste observații contradictorii necesită studii suplimentare. La pisici, CKD este un sindrom eterogen cu rate de progresie foarte variabile, cel mai probabil determinate de factori multipli. Rezultatele noastre implică tulburări în homeostazia fosfatului în contribuția la progresia rapidă a CKD, chiar dacă nefrocalcinoza nu a fost evidentă la aceste pisici. Viitoarele studii prospective care evaluează dezvoltarea și progresia nefrocalcinozei la pisici cu CKD azotemică sunt justificate și pot conduce la un nou cadru pentru abordări diagnostice și terapeutice în managementul CKD-MBD la pisici.

REFERINȚE

1. Finch NC, Geddes RF, Syme HM, Elliott J. Concentrațiile factorului de creștere a fibroblastelor 23 (FGF-23) la pisici cu boală renală cronică nonazotemică (CKD) timpurie și la pisici geriatrice sănătoase. J Vet Intern Med. 2013;27:227-233.

2. Geddes RF, Finch NC, Elliott J, Syme HM. Factorul de creștere a fibroblastelor 23 în boala renală cronică la feline. J Vet Intern Med. 2013;27(2): 234-241.

3. Locatelli F, Cannata-Andía J, Drüek T, et al. Managementul tulburărilor metabolismului calciului și fosfatului în insuficiența renală cronică, cu accent pe controlul hiperfosfatemiei. Transplant Nephrol Dial. 2002;17(5):723-731.

4. Larsson T, Nisbeth U, Ljunggren Ö, și colab. Concentrația circulantă de FGF-23 crește pe măsură ce funcția renală scade la pacienții cu boală renală cronică, dar nu se modifică ca răspuns la variația aportului de fosfat la voluntarii sănătoși. Rinichi Int. 2003;64(6):2272-2279.

5. Bergwitz C, Jüppner H. Reglarea homeostaziei fosfatului de către PTH, vitamina D și FGF23. Annu Rev Med. 2010;61(1):91-104.

6. Geddes RF, Finch NC, Syme HM, Elliott J. Rolul fosforului în patofiziologia bolii cronice de rinichi. J Vet Emerg Crit Care. 2013;23(2):122-133.

7. Moe S, Drüeke T, Cunningham J, et al. Definiția, evaluarea și clasificarea osteodistrofiei renale: o declarație de poziție din boala renală: îmbunătățirea rezultatelor globale (KDIGO). Rinichi Int. 2006; 69(11):1945-1953.

8. Priante G, Ceol M, Terrin L, et al. Înțelegerea fiziopatologiei nefrocalcinozei. În: Long L, ed. Actualizări și progrese în nefrolitiază - Fiziopatologie, genetică și modalități de tratament. Londra, Marea Britanie: IntechOpen; 2017:3-52. https://www.intechopen.com/books/updates-and-advances-in-nephrolithiasis-pathophysiology genetics-and-treatment-modalities/understanding-the-pathophysiology-of-nephrocalcinosis

9. Sayer JA, Carr G, Simmons NL. Nefrocalcinoza: perspective moleculare despre precipitarea calciului în rinichi. Clin Sci. 2004;106(6): 549-561.

10. Moe OW. Pietre la rinichi: fiziopatologie și management medical. Lancet. 2006;367(9507):333-344.

11. Evenepoel P, Daenen K, Bammens B, et al. Nefrocalcinoza microscopică la pacienții cu boli renale cronice. Transplant Nephrol Dial. 2015;30(5):843-848.

12. Gimenez LF, Solez K, Walker WG. Relația dintre conținutul de calciu renal și insuficiența renală în 246 de biopsii renale umane. Rinichi Int. 1987;31(1):93-99.

13. Nagano N, Miyata S, Obana S, et al. Clorhidratul de Sevelamer, un liant de fosfat, protejează împotriva deteriorării funcției renale la șobolanii cu insuficiență renală cronică progresivă. Transplant Nephrol Dial. 2003;18(10):2014-2023.

14. Kuzela DC, Huffer WE, Conger JD, et al. Calcificarea țesuturilor moi la pacienții cronici dializați. Sunt J Pathol. 1977;86(2):403-424.

15. Chakrabarti S, Syme HM, Brown CA, Elliott J. Histomorphometry of feline chronic kidney disease and corelation with markers of renal dysfunction. Veterinarul Pathol. 2013;50(1):147-155.

16. Jara A, Chacon C, Ibaceta M, et al. Efectul clorurii de amoniu și al fosforului alimentar la șobolanul azotemic. Partea a II-a - hipertrofie renală și depunere de calciu. Transplant Nephrol Dial. 2004;19(8):1993-1998.

17. van den Broek DHN, Chang YM, Elliott J, Jepson RE. Boala cronică de rinichi la pisici și riscul de hipercalcemie totală. J Vet Intern Med. 2017;31(2):465-475.

18. Tang PK, Geddes RF, Chang YM, Jepson RE, Bijsmans E, Elliott J. Factori de risc asociați cu tulburări ale homeostaziei calciului după inițierea unei diete restrictive în fosfați la pisici cu boală cronică de rinichi. J Vet Intern Med. 2021;35:321-332.

19. Syme HM, Barber PJ, Markwell PJ, Elliott J. Prevalența hipertensiunii sistolice la pisici cu insuficiență renală cronică la evaluarea inițială. J Am Vet Med Asoc. 2002;220(12):1799-1804.

20. Kiernan JA. Metode pentru ionii anorganici. În: Kiernan JA, ed. Metode histologice și histochimice: teorie și practică. a 4-a ed. Bloxham, Oxfordshire: Scion Publishing Ltd; 2007:337-353.

21. Evenepoel P, Lerut E, Naesens M, et al. Localizarea, etiologia și impactul depozitelor de fosfat de calciu în alogrefele renale. Am J Transplant. 2009;9(11):2470-2478.

22. Ejlsmark-Svensson H, Bislev LS, Rolighed L, Sikjaer T, Rejnmark L. Predictorii funcției renale și calcificările în hiperparatiroidismul primar: un studiu de caz-control imbricat. J Clin Endocrinol Metabol. 2018;103(9):3574-3583.

23. Geddes RF, Elliott J, Syme HM. Efectul hrănirii unei diete renale asupra concentrațiilor plasmatice ale factorului de creștere a fibroblastelor 23 la pisici cu boală renală cronică azotemică stabilă. J Vet Intern Med. 2013;27(6):1354-1361.

24. Barber PJ, Rawlings JM, Markwell PJ și colab. Efectul restricției alimentare cu fosfat asupra hiperparatiroidismului secundar renal la pisică. J. Small Anim Pract. 1999;40(2):62-70.

25. Summers SC, Stockman J, Larsen JA, Zhang L, Rodriguez AS. Evaluarea conținutului de fosfor, calciu și magneziu din alimentele disponibile comercial, formulate pentru pisici sănătoase. J Vet Intern Med. 2020;34(1):266-273.

26. Masuyama R, Nakaya Y, Katsumata S, et al. Raportul de calciu și fosfor din dietă reglează mineralizarea osoasă și turnover-ul la șoarecii knockout ai receptorului de vitamina D, afectând absorbția intestinală de calciu și fosfor. J Bone Miner Res. 2003;18(7):1217-1226.

27. Rönnefarth G, Misselwitz J. Nefrocalcinoza la copii: un studiu retrospectiv. Pediatr Nephrol. 2000;14:1016-1021.

28. Tang X, Bergstralh EJ, Mehta RA, Vrtiska TJ, Milliner DS, Lieske JC. Nefrocalcinoza este un factor de risc pentru insuficienta renala in hiperoxaluria primara. Rinichi Int. 2015;87(3):623-631.

29. Starup-Linde J, Waldhauer E, Rolighed L, Mosekilde L, Vestergaard P. Pietre renale și calcificări la pacienții cu hiperparatiroidism primar: asocieri cu variabile biochimice. Eur J Endocrinol. 2012;166(6):1093-1100.

30. Elliott J, Rawlings JM, Markwell PJ, Barber PJ. Supraviețuirea pisicilor cu insuficiență renală cronică naturală: efectul managementului alimentar. J Small Anim Pract. 2000;41:235-242.

31. Plantinga EA, Everts H, Kastelein AMC, Beynen AC. Un studiu retrospectiv al supraviețuirii pisicilor cu insuficiență renală cronică dobândită a oferit diferite diete comerciale. Veter Rec. 2005;157(7):185-187.

32. Ross SJ, Osborne CA, Kirk CA, Lowry SR, Koehler LA, Polzin DJ. Evaluarea clinică a modificării dietei pentru tratamentul bolii renale cronice spontane la pisici. J Am Vet Med Asoc. 2006;229(6):949-957.

33. Lou LM, Caverni A, Gimeno JA, et al. Intervenția alimentară sa concentrat pe aportul de fosfat la pacienții hemodializați cu hiperfosfatemie. Clin Nephrol. 2012;77(6):476-483.

34. Voormolen N, Noordzij M, Grootendorst DC, et al. Fosfatul plasmatic ridicat este un factor de risc pentru scăderea funcției renale și a mortalității la pacienții predializați. Transplant Nephrol Dial. 2007;22(10):2909-2916.

35. Nemoto Y, Kumagai T, Ishizawa K, et al. Legarea fosfatului de către oxihidroxidul sucroferic ameliorează leziunea renală în modelul de rinichi rămas. Sci Rep. 2019;9(1):1-11.

36. Wang Q, Ishizawa K, Li J, et al. Nanoparticulele care conțin fosfat urinar contribuie la inflamație și leziuni renale într-un model de șobolan cu hipertensiune arterială sensibilă la sare. Comuna Biol. 2020;3(1):1-12.

37. Chakrabarti C, Syme HM, Elliott J. Variabile clinicopatologice care prezic progresia azotemiei la pisici cu boală cronică de rinichi. J Vet Intern Med. 2012;26(2):275-281.

38. Geddes RF, Elliott J, Syme HM. Relația dintre concentrația factorului de creștere-23 a fibroblastelor plasmatice și timpul de supraviețuire la pisici cu boală cronică de rinichi. J Vet Intern Med. 2015;29(6):1494-1501.

39. Kuwahara Y, Ohba Y, Kitoh K, Kuwahara N, Kitagawa H. Asociația de date de laborator și deces în termen de o lună la pisici cu insuficiență renală cronică. J Small Anim Pract. 2006;47(8):446-450.

40. Kestenbaum B, Sampson JN, Rudser KD, et al. Nivelurile de fosfat seric și riscul de mortalitate în rândul persoanelor cu boală cronică de rinichi. J Am Soc Nephrol. 2005;16(2):520-528.

41. Keith DS, Nichols GA, Gullion CM, Brown JB, Smith DH. Urmărirea longitudinală și rezultatele în rândul unei populații cu boală renală cronică într-o organizație mare de îngrijire gestionată. Arch Intern Med. 2004;164:659-663.

42. Boyd LM, Langston C, Thompson K, Zivin K, Imanishi M. Pisici de supraviețuire I cu boală cronică de rinichi care apare în mod natural (2000–2002). J Vet Intern Med. 2008;22:1111-1117.

43. Slatopolsky E. Rolul metabolismului calciului, fosforului și vitaminei D în dezvoltarea hiperparatiroidismului secundar. Transplant Nephrol Dial. 1998;13(Supliment 3):3-8.

44. Chalhoub S, Langston CE, Eatroff A. Anemia of renal disease. Ce este, ce trebuie făcut și ce este nou. J Feline Med Surg. 2011;13(9):629-640.

45. King J, Tasker S, Gunn-Moore D, et al. Factori de prognostic la pisicile cu boală cronică de rinichi. J Vet Intern Med. 2007;21:906-916.

46. ​​Syme HM, Markwell PJ, Pfeiffer D, Elliott J. Supraviețuirea pisicilor cu insuficiență renală cronică care apare în mod natural este legată de severitatea proteinuriei. J Vet Intern Med. 2006;20:528-535.

47. Finch N. Măsurarea ratei de filtrare glomerulară la pisici: metode și avantaje față de markerii de rutină ai funcției renale. J Feline Med Surg. 2014;16(9):736-748.

48. McGee-Russell SM. Metode histochimice pentru calciu. J Histochem Cytochem. 1958;6(1):22-42.

49. Bonewald LF, Harris SE, Rosser J, et al. Doar colorația Von Kossa nu este suficientă pentru a confirma faptul că mineralizarea in vitro reprezintă formarea osoasă. Calcif Tissue Int. 2003;72(5):537-547.

50. Puchtler H, Meloan SN, Terry MS. Despre istoria și mecanismul colorațiilor de alizarina și roșu S de alizarina pentru calciu. J Histochem Cytochem. 1969;17:110-124.

51. Proia AD, Brinn NT. Identificarea cristalelor de oxalat de calciu folosind colorarea roșie S de alizarina. Arch Pathol Lab Med. 1985;109(2):186-189.

52. Lewin-Smith MR, Kalasinsky VF, Mullick FG. Identificarea histochimică a celulozei microcristaline, oxalatului de calciu și talcului în secțiuni de țesut. Arch Pathol Lab Med. 2011;135(8):963.

53. Kyles AE, Hardie EM, Wooden BG, et al. Anomalii clinice, clinicopatologice, radiografice și ultrasonografice la pisici cu calculi ureterali: 163 de cazuri (1984–2002). JAMA. 2005;226(6):932-936.

54. Lila AR, Sarathi V, Jagtap V, Bandgar T, Menon PS, Shah NS. Manifestări renale ale hiperparatiroidismului primar. Ind J Endocrinol Metabol. 2012;16(2):258-262.

55. Rejnmark L, Vestergaard P, Mosekilde L. Nefrolitiază și calcificări renale în hiperparatiroidismul primar. J Clin Endocrinol Metabol. 2011;96(8):2377-2385.

56. Takasugi S, Shioyama M, Kitade M, Nagata M, Yamaji T. Implicarea estrogenului în nefrocalcinoza indusă de fosfor prin factorul de creștere a fibroblastelor 23. Sci Rep. 2020;10(1):1-11.

57. Shanahan C, Crouthamel M, Kapustin A, et al. Calcificarea arterială în boala cronică de rinichi: roluri cheie pentru calciu și fosfat. Circ Res. 2011;109(6):697-711.

58. Babler A, Schmitz C, Büscher A, et al. Microvasculopatia și calcificarea țesuturilor moi în licență guvernate de fetuin-a, pirofosfat și magneziu. Plus unu. 2020;15(2):e0228938.

Pak-Kan Tang1|Rosanne E. Jepson2|Yu-Mei Chang3|Rebecca F. Geddes2|Mark Hopkinson1|Jonathan Elliott1

1 Departamentul de Științe Biomedicale Comparate, Royal Veterinary College, Universitatea din Londra, Londra, Regatul Unit

2 Departamentul de Științe și Servicii Clinice, Royal Veterinary College, Universitatea din Londra, Londra, Regatul Unit

3 Biroul de sprijin pentru cercetare, Royal Veterinary College, Universitatea din Londra, Londra, Regatul Unit