Tuliposide H–J și componente bioactive din bulbul Amana Edulis

Abstract:

Trei noi fețe de lalele H–J (1–3) și 11 compuși cunoscuți au fost obținuți pentru prima dată din extractele metanolice ale bulbilor de Amana edulis. Structurile lor au fost elucidate prin date spectroscopice RMN, MS și IR, rotație optică și metoda lui Mosher. Proprietățile de melanogeneză ale tuturor izolatelor au fost evaluate în celulele melanomului B16. În consecință, citratul de tributil (9) a avut activitate anti-melanogeneză, dar a fost citotoxic pentru B16. (plus )-acid piroglutamic (4), (plus )-butil 5-oxo pirolidin-2-carboxilat (6), (–)-3-hidroxi-2-metil butirolactonă (10 ), și 5- (hidroximetil)furfural (12) au avut producții crescute de melanină și activități tirozinazei. Acele componente active ar putea fi studiate în continuare ca candidați împotriva melanomului și vitiligo pentru boli de piele sau albire/hipopigmentare pentru păr.

În cercetările privind albirea, am constatat că Cistanche are și efect de albire

În primul rând, Cistanche este bogat în polizaharide și flavonoide. Acești compuși acționează ca antioxidanți și pot ajuta organismul să elimine radicalii liberi, încetinind îmbătrânirea pielii și, astfel, îmbunătățind tenul.

În al doilea rând, Cistanche conține, de asemenea, o varietate de aminoacizi, minerale și vitamine, care sunt foarte benefice pentru repararea și regenerarea pielii. Cistanche poate promova metabolismul celulelor pielii, poate spori capacitatea de auto-reparare a pielii și poate reda pielea la o culoare sănătoasă.

In fine, Cistanche contine si niste acizi organici si substante alcaline, iar aceste ingrediente au si un anumit efect asupra conditionarii si metabolismului cuticulelor pielii. Aceste substanțe pot echilibra eficient valoarea pH-ului pielii, pot îmbunătăți grosimea stratului cornos și pot face pielea mai translucidă și mai delicată.

Faceți clic de unde să cumpărați cistanche

1. Introducere

Amana edulis (A. edulis; Miq.) Honda, syn. Tulipa edulis (Miq.) Baker aparține familiei Liliaceae și este o plantă medicinală populară folosită pentru tratarea bolilor canceroase [1,2]. Cu toate acestea, au existat puține studii fitochimice și biologice ale acestei specii raportate până în prezent.

De exemplu, 95% și 50% extracte de EtOH ar putea induce apoptoza în celulele carcinomului gastric uman (SGC7901) [1] și, respectiv, hepatom (BEL7404, HepG2 și Huh7) [2]. Polizaharidele preparate din A. edulis au proprietăți antioxidante, inclusiv DPPH, OH- și ABTS plus activități de captare [3–5]. În cercetarea noilor agenți din produse naturale pentru afecțiuni ale pielii, am constatat că extractele MeOH din bulbii de A. edulis prezintă o potențială reglare a melanogenezei care nu a fost încă cercetată. Când este expusă la radiația ultravioletă a luminii solare sau la substanțe chimice nocive și factori patogeni, melanogeneza moderată ne poate proteja pielea de generarea de specii reactive de oxigen în keratinocite și melanocite [6]. Tirozinaza este o enzimă importantă în melanogeneză pentru a produce mai multă melanină pentru a ne apăra împotriva condițiilor periculoase menționate mai sus [7].

Prin urmare, componentele active ale A. edulis sunt demne de a fi eliminate pentru aplicații medicale ulterioare. În această investigație, trei noi laturi de lalele H–J (1–3) și 11 compuși cunoscuți (4–14) (Figura 1) au fost izolați din A. edulis și identificați structural prin date spectroscopice RMN, MS și IR, rotație optică. , sau reacția esterului Mosher. Compusul 9 ar putea scădea conținutul de melanină, dar ar putea fi citotoxic pentru celulele melanomului B16. Compușii 4, 6, 10 și 12 au avut producție crescută de melanină și activități tirozinazei. În general, această lucrare a demonstrat că A. edulis și componentele sale active ar putea fi agenți noi pentru bolile legate de melanină, cum ar fi melanomul și hipopigmentarea (vitiligo al pielii sau albirea părului).

2. Rezultate și discuții

2.1. Elucidările structurii izolatelor 1–3

Extractul de MeOH (TEM) al bulbilor de A. edulis a fost împărțit separat în fracții solubile în EtOAc (TEE), solubile în n-BuOH (TEB) și solubile în HO (TEW). Fracția. acțiunea extractelor TEE și TEB a produs noi glicozide izoprenoide 1-3 și compuși cunoscuți 4-14 (Figura 1). În plus, componentele majore ale extractului TEW au fost carbohidrații.

HRESIMS (spectrometrie de masă cu ionizare prin electrospray de înaltă rezoluție) de 1 a arătat un (ion M - H- la m/z 351,1652, indicând o formulă moleculară de CsH2gOg (calculat pentru C;5HoOg; 351,1655) și două grade de nesaturație. au arătat absorbții pentru funcționalitățile hidroxil (3376 cm-l) și carbonil (1725 cm-l). Cincisprezece semnale de carbon, inclusiv două metile, cinci metilen, șapte metine și un carbon cuaternar, au fost observate în RMN unidimensional (1D). spectre de 1 (Tabelul 1). Carbonul cuaternar a fost identificat ca un carbon carbonil pe baza deplasării chimice 6c 176,6. Spectrele RMN 1D și HSOC (coerență cuantică unică heteronucleară) au afișat un anomer (0/8c: 4,27). (d, J=8.{0 Hz)/1{{3{0}}4,9), cinci oximetolonă ({0h/8c: 3,21(t, J { {34}}.0 Hz)/75,1, 3,28 (suprapunere)/71,6, 3,28 (suprapunere)/78.{0, 3,35 (t, J=8.{{67} } Hz)/77,9 și 3,89 (td, I=7.{0, 2,5 Hz)/73,6) și trei oximetilen (6,/6c: 3,57 (dd, J {{64}) },5, 7,0 Hz)4.01 (dd, I {{70}},5, 2,5 Hz)/73,1, 3,66 (dd, I { {78}}.0, 5.0 Hz), 3.85 (brd, I=12.0 Hz)/62.7 și 4.10 (2H, t, J {= 7.5 Hz)/65.5) semnale. Corelațiile HMBC (corelația legăturilor multiple heteronucleare) (Figura 2) ale compusului 1 la protonii de metină H-2 (8 2.67, quint cu C-1 (6 176. 6)/C-3 (6 73,6)/C-4 (6 73,1)/C-5 (6 13,9) , H-3 ({6 3,89, td) cu C{-1/C{-2({6 44,6)/C{-4/C -5, H{-1' ({6 4.27, d) cu C{-4 și protonii metil H{-5 (8 1,14 , d) cu C{-1/C{-2/C{-3 a sugerat că fragmentele metil și hidroxil au fost poziționate la C{-2 și respectiv C-3. În plus, protonii de metilen la H,-1" (8 4.10, t) și H{-4 ({6 3.57dd; 4,01, dd) au prezentat 3 interacțiuni cu C{{ 142}} și, respectiv, C-1' ({8 104.9), în spectrul HMBC (Figura 2) care a susținut atribuirea grupării n-butil la C-1 și un beta -glucoză (H-1', 8 4.27, d, J {= 8.0 Hz) la C{-4 8].

Figura 2 prezintă corelațiile cheie COSY și HMBC observate pentru 1. Configurațiile relative la C-2 și C-3 (3-porțiunea 3-hidroxi{-2-metil) din 1 ar putea fi determinate anti -forma prin valoarea 3 JH2-H3 de 7.0 Hz (antiformă: 7.0 Hz; forma syn: 4.0 Hz) [ 9]. Pentru a determina configurația absolută, compusul 1 a fost tratat separat cu clorură de (R)- și (S)- -metoxi- -(trifluormetil)-fenil acetil [(R)- și (S)-MTPA- CI] în prezenţă de piridin-d5 pentru a obţine esterii (S)- şi (R)-MTPA (1a şi, respectiv, 1b). Esterii MTPA au fost generați cu succes la C-3 și C-20/C{-30/C{-40 , așa cum s-a elucidat din 1H RMN și 1H-1H COSY spectre (1a, H-3, δ 5,82, m; H{-20, δ 5,70, t, J=9,5 Hz; H{-30, δ 4,39, t, J=9,5 Hz; H{-40, δ 5,76, t, J=9,5 Hz; 1b, H{-3, δ 5,81, m; H{{64 }}, δ 5,56, t, J=9,5 Hz; H{-30, δ 4,12, t, J=9,5 Hz; H{-40, δ 5,66, t, J=9.5 Hz). Diferențele dintre deplasările chimice 1H RMN pentru 1a și 1b (valorile ∆ prezentate în Figura 3) au condus la atribuirea configurațiilor S și R la C-3 și, respectiv, C-2. În consecință, compusul 1 a fost elucidat ca butanoat de butii 4- -D-glucopiranoză-(S)-3-hidroxi-(R)-2-metil și a fost numit partea de lalele H.

Compusul 2, partea I de lalele, a dat formula moleculară, C15H28O8, stabilită de HRESIMS (m/z 359,1686 [M plus Na] plus, calculat pentru 359,1682). Spectrele RMN 1D ale lui 2 au fost, de asemenea, similare cu cele ale lui 1, cu excepția faptului că deplasările chimice ale semnalului de metilen δH 1,65 (sext, J=7.0 Hz) și 1,96 (sext, J=7.{0 Hz)/δC 34,6 au fost identificate în loc de o metină la C-3 din 1 (Tabelul 1). Pe baza datelor COSY și HMBC (Figura 2), s-a postulat că compusul 2 este compus dintr-un izoprenoid, o glucoză și, de asemenea, grupările n-butil. Corelațiile HMBC 3 J ale lui H2-1" (δ 4.04, 2H, t, J=7.5 Hz/δC 65.4) cu C{-1 (δ 178,5) și H-10 (δ 4,19, d, J=8,0 Hz/δC 104,4) cu C{-4 (δ 68,4) au sugerat că gruparea n-butil și o -glucoză fragmentul [8] au fost conectați la C-1 și, respectiv, C-4 (Figura 2). Corelațiile cheie HMBC și COZY sunt prezentate în Figura 2. Configurația R a H3-5 la C-2 din 2 a fost determinat prin hidroliza acidă a lui 2 pentru a oferi compusul de tulipalină corespunzător, 3-metildihidrofuran{-2(3H)-ona (Figura S28) [8] cu o rotație optică pozitivă valoare ([ ] 23 D plus 18,7, CH2Cl2) (R: [ ] 25 D plus 14,7, CHCl3) [10]. Structura compusului 2 a fost identificată ca butil 4- -D-glucopiranoză-(R){{ 81}}butanoat de metil.

Formula moleculară a lui 3 a fost dedusă ca C11H20O8 datorită apariției unui ion [M plus Na] plus la m/z 3{03,1049 (calculat pentru 303,1050) în HRESIMS. Unsprezece semnale de carbon, inclusiv un metil (δ 17,6), trei metilen (δ 34,7, 62,8 și 68,6), șase metine (δ 37,6, 71,6, 75,1, 77,9, 78,0 și 104,4) și un carbon cuaternar (6) δ. , au fost observate în spectrele 1D RMN de 3 (Tabelul 1). Carbonul cuaternar a fost identificat ca un carbon carbonil pe baza deplasării chimice a carbonului la 5 180,6. Mai mult, compusul 3 a arătat date spectroscopice similare cu cele din 2, cu excepția semnalelor n-butil. În spectrul HMBC (Figura S15), protonul anomeric la δ 4,23 (d, J=8,0 Hz) a prezentat o interacțiune de 3 J cu C{-4 (δ 68,6) conducând la -glucoză situată la C-4. Conexiunile cheie HMBC și COSY sunt prezentate în Figura 2. Compusul 3 nu a fost izolat într-o cantitate suficientă pentru a determina configurația absolută la C-2. În cele din urmă, partea de lalele J (3), acidul 4- -D-glucopiranoză-(R){-2-metil butanoic, a fost identificată din cauza elucidărilor structurale menționate mai sus pentru 1 și 2 în acest studiu.

Compușii 1–3 sunt laturi de lalele, un fel de produs specializat constând din 4-hidroxi2-acid metilen butanoic (HMBA) și/sau (3S)-3,4-dihidroxi Grupări de -2-acid metilen butanoic (DHMBA) acilate în pozițiile C-1 și/sau C{-6 ale unei -D-glucoze (Glc) găsite în principal în genul Tulipa [8,11] . Până acum, analogi de lalele, inclusiv 1-latura A, 6-latura A, 1-latura B, 6-latura B și laturile D–G , au fost izolate din Tulipa [8,11]. Cu toate acestea, structura părții C a lalelei nu a fost raportată și ar putea lipsi în literatura anterioară [11]. Tulipalinele, cum ar fi tulipalina A și (-)-tulipalina B, sunt porțiunile aglicone ale părților laterale de lalele, care lactonează spontan după eliberarea grupurilor HMBA și/sau DHMBA de către enzimele de conversie a părții lalelelor [8,11]. În acest studiu, compușii 1-3 denumiți laturile de lalele H-J aparțin laturilor de lalele, dar legăturile lor duble la C-2 au fost reduse și grupările -D-glucoză au fost atașate la C-4 (oximetilen ), în loc de C-1 (funcționalitate O-acil) în HMBA sau DHMBA (Figura 1). În plus, compusul 10 (2S,3S) este tulipalina, dar nu a putut fi metabolizat din 1 (2R,3S) din cauza diferitelor configurații la C-2. Biosintezele posibile ale părților 1–3 ale lalelelor sunt prezentate în Figura S29 [8,11].

În plus, au fost 11 compuși cunoscuți, inclusiv trei analogi ai acidului piroglutamic (4–6), trei derivați ai acidului citric (7–9), două furanone (10–11), un furan (12) și doi steroizi (13–14). izolat de A. edulis pentru prima dată. Compușii 1–9 și 10–14 au fost obținuți din fracțiile brute TEB și, respectiv, TEE. Au fost identificați ca acid (plus )-piroglutamic (4) [12], (plus )-metil 5-oxo pirolidin-2-carboxilat (5) [12], (plus )-butil {{23 }}oxo pirolidină-2-carboxilat (6) [12], 1-citrat de butil (7) [13], 1,10 -dibutil 5-citrat de metil (8) [ 13], citrat de tributil (9) [13], (–)-3-hidroxi-2-metil butirolactonă (10) [14–16], (–)-metil 3-hidroxi{{ 44}}oxo tetrahidrofuran-3-carboxilat (11) [17], 5-(hidroximetil)furfural (12) [18], sitosterol (13) [19] și sitosterol-3- -D -glucoza (14) [20] din datele spectroscopice si comparate cu literatura de specialitate.

2.2. Elucidarea componentelor chimice ale TEW

Spectrele 1H și 13C RMN ale TEW, o fracție brută solubilă în apă din extractul TEM, au arătat foarte similare cu cele ale carbohidraților (Figurile S16 și S17). Polizaharidele preparate din această specie au fost raportate că posedă ramnoză, xiloză, arabinoză, galactoză, manoză, glucoză și fructoză după analiza monozaharidelor [3,8]. Datele spectroscopice RMN și factorul de retenție TLC (cromatografie în strat subțire) al TEW în comparație cu cele ale standardelor de zahăr (Figurile S18-S23) au sugerat că D-glucoza și D-fructoza au fost componentele principale în extractele TEW.

2.3. Efectele extractelor și izolatelor asupra melanogenezei

Extractul MeOH (TEM) al acestei specii a fost separat în fracții brute TEE, TEB și TEW, iar cele patru extracte menționate mai sus au fost evaluate pentru efectele de citotoxicitate și melanogeneză în celulele melanomului B16 la concentrații de la 12,5 la 200 µg/mL (Figura S24) . TEE a arătat o citotoxicitate evidentă față de B16 la 200 µg/mL și TEB, precum și TEW au avut activități citotoxice la concentrații de la 12,5 la 200 µg/mL (Figura S24A-1, B-1, C{{13} }, D-1). În biotestul, hormonul de stimulare a melanocitelor (-MSH) a fost folosit pentru a activa celulele B16 pentru a sintetiza mai multă melanină, iar TEM ar putea stimula moderat melanogeneza (Figura S24A-2).

Cele mai multe dintre toate izolatele (Figura 1), cu excepția 13 și 14, au fost testate în continuare pentru reglarea efectelor melanogenezei la concentrații de la 10 la 40 pM, cu arbutina utilizată ca martor pozitiv (Figura 4). După cum se arată în Figura 4, compusul 9 a inhibat în mod evident și dependent de doză producția de melanină care a rezultat din citotoxicitatea față de celulele B16 cu o valoare IC50 (concentrație inhibitorie maximă pe jumătate) de 81,9 pM (Figura S25). Izolatele 4, 6, 10 și 12 au crescut conținutul de melanină în funcție de doză până la procentele maxime de 11,9 la sută, 29,8 la sută, 27,2 la sută și, respectiv, 17,6 la sută, la 40 pM fără toxicitate celulară. Tirozinaza joacă un rol cheie în primele două etape ale melanogenezei [6]; prin urmare, efectele compușilor 4, 6, 10 și 12 asupra tirozinazei intracelulare au fost evaluate în continuare. -MSH a crescut activitatea tirozinazei până la 254,3-305,5% în comparație cu grupul de control (100%) (Figura 5 și Tabelul S1).

În consecință, 4 (14,1–21,9 la sută), 6 (15,8–21,9 la sută), 10 (8,5–13,1 la sută) și 12 (7,5–11,8 la sută) au crescut moderat activitatea enzimei, tirozinaza, într-o manieră dependentă de doză. la concentrații de 10 până la 40 pM, în comparație cu grupul -MSH (Figura 5 și Tabelul S1). Un grafic de corelație între conținutul de melanină celulară și efectele asupra tirozinazei compușilor 4, 6, 10 și 12 sunt prezentate în Figura S26. Mai mult, pentru a confirma efectele de inducere a melanogenezei ale 4, 6, 10 și 12, fiecare compus a fost adăugat în celule B16 fără -MSH co-tratat, care a fost utilizat ca control pozitiv în acest test (Figura S27). În consecință, indivizii 4, 6, 10 și 12 nu au crescut singuri producția de melanină (Figura S27) similar celor prezentate în Figura 4. S-a sugerat că cei patru compuși menționați mai sus ar putea pur și simplu spori efectele melanogenezei -MSH. În consecință, căi de semnal suplimentare în melanogeneză, cum ar fi proteina asociată tirozinazei-1 (TRP-1), TRP{-2, factorul de transcripție asociat microftalmiei, receptorul melanocortinei 1, adenozin monofosfat ciclic, proteine kinaza A, proteina de legare a elementului de răspuns cAMP, kinazele N-terminale c-Jun, kinaza reglată de semnal extracelular, p38 și fosfoinozitid 3-kinaza/protein kinaza B [7,21], ar trebui testate și confirmate în continuare pentru acele componente active.

3. Materiale și Metode

3.1. Proceduri generale experimentale

Spectrele RMN au fost măsurate pe un instrument Bruker Avance Ill 500 MHz (BrukerBillerica, America) pentru 1H și 125 MHz pentru 13C-RMN. Valorile deplasării chimice (0) au fost în ppm, iar constantele de cuplare () au fost în Hz cu CD; OD, CDCI și/sau D, O au fost utilizați ca solvenți. Rotațiile optice au fost obținute pe un polarimetru JASCO-P-2000 (JASCO, TokyoJapan) (lungimea celulei 1{0 mm). Spectrele IR au fost înregistrate pe un spectrometru PerkinElmer Spectrum TwoFT-IR (PerkinElmer, Waltham, MA, SUA). Spectrometria de masă cu ionizare ESIMSelectrospray cu rezoluție joasă și înaltă) au fost măsurate pe un spectrometru de masă cu capcană de capacitate ultra-înaltă Bruker Daltonics EsquireHCT și, respectiv, pe un spectrometru de masă Orbitrap (LIOOrbitrap XL, Thermo Fisher Scientific). TLC a fost efectuat pe Kieselgel60 F254 (0,25 mm; Merck) și/sau RP{-18 F254S (0,25 mm; Merck), plăci acoperite și apoi colorate prin pulverizare cu 5% (o/u) sulfuric acid într-o soluție de MeOH și încălzire pe o placă fierbinte. Silicagel (Silicycle: 70 230 și 230 400 mesh), RP{-18 (LiChroprepe 4063 um: Merck. Sephadexn C20 CE episodul 0 pe deschis cu Bre aplicat foSupelcoTM, Bellefonte) și MCI CHP20P (Cromatografie pe coloană SupelcoT. O pompă Shimadzu LC-20AT și un Shimadzu RID-10Un detector cu indice de refracție (Shimadzu Inc, Kyoto, Japonia), împreună cu un Cosmosil 5C18-MS-II ( Pentru HPLC s-au folosit o coloană de 250 x 10 mm id, 5 um) la un debit de 2,0 mL/min. Reactivi de zahăr, inclusiv D-glucoză (MP Biomedicals, LLC, Illkirch, Franța) și D-fructoză (TCI, Tokyoapan) au fost utilizat pentru analiza fracției brute solubile în apă (TEW).

3.2. Material vegetal

Bulbi uscati de A. edulis (fost T. edulis) au fost achiziționați de la o farmacie de medicină tradițională chineză din Taichung, Taiwan, în septembrie 2018 și identificați de autorul Prof. Chang. Un exemplar de voucher (TE201809) a fost depus la Centrul de Cercetare și Dezvoltare în Medicina Chineză, CMUH Taiwan.

3.3. Extracție și izolare

Bulbii de A. edulis (5,0 kg) au fost extrași de opt ori cu MeOH (8,0 L fiecare) la temperatura camerei pentru a obține un extract brut. Extractul de MeOH (TEM, 525,0 g) a fost împărțit de trei ori între acetat de etil (EtOAc) și H2O (1500:1500, v/v) pentru a da un EtOAc -fracție solubilă (TEE, 45,0 g) și o fază apoasă, care a fost împărțită în continuare cu n-BuOH/H2O (1500:1500, v/v × 3), și apoi separată în n-BuOH solubilă (TEB, 53,6 g ) și fracțiuni solubile în H2O (TEW, 410,0 g).

TEE a fost supus cromatografiei pe coloană deschisă pe un gel de silice ({{0}}.063–0,2{0{0 mm, coloană: 7 × 26 cm, diametru × lungime), folosind gradienți de hexan–EtOAc–MeOH (3{{20}}:1:0; 1:1:{0; { {67}}:0:1, v/v/v) și a dat 14 subfracții (TEE1–TEE14). Precipitatul 14 (249,0 mg; randament de izolare: {0.{{{1{0}}}0498 la sută) obținut din subfracția TEE12 (2,2 g) a fost filtrat și spălat cu MeOH. TEE9 (3,6 g) a fost fracţionat în şapte subfracţii (TEE9-1 la 9-7) cu silicagel (coloană: 5 × 24 cm; CH2Cl2–MeOH, 7:1; 1:1; 0:1) , v/v), cu subfracția TEE9-4 (1,1 g), și apoi supus cromatografiei pe coloană Sephadex LH-20 (coloană: 5 × 54 cm; CH2Cl2–MeOH, 1:1 până la 0: 1, v/v), pentru a da șapte subfracții (TEE9-4-1 la 9-4-7). TEE9- 4-5 și TEE{9-4-6 au fost combinate (total 551,7 mg) și purificate în mod repetat prin RP-HPLC (MeOH-H2O, 45:55; 20:80, v/v) pentru a da 12 (21,0 mg). ; tR=13 min; randament de izolare: 0,00042 la sută) și o soluție mamă (131,2 mg), care a fost supusă în continuare la RP-HPLC (MeOH-H2O; 10:90, v/v) pentru a da compușii 10 ( 35,5 mg; tR=13 min; randament de izolare: 0,00071 la sută) și 11 (1,2 mg; tR=15 min; randament de izolare: 0,000024 la sută). Fracția TEE6 (2,7 g) a fost izolată de Sephadex LH-20 (coloană: 2,5 × 45 cm; CH2Cl2–MeOH, 1:1; 0:1, v/v) pentru a obține 13 (6,8 mg; randament de izolare: 0,000136 la sută).

TEB a fost cromatografiat pe o coloană Diaion HP{{0}} (6 × 60 cm; H2O–MeOH– acetonă, 100:{{15} }:0; 25:75:0; 50:5{{2{0}}:0; 75:25:{{41 }}; 0:10{{70}}:{{{0}}; {{1{{1{05} }0}}:0:10{0, v/v/v) pentru a da șase subfracții (TEB1–TEB6). Subfracția TEB5 (502.{0 mg) a fost purificată prin RP-HPLC (MeOH–H2O, 85:15, v/v) pentru a obține compușii 8 (9,3 mg; tR {{34} } min; randament de izolare: 0.{00{0186 la sută ) și 9 (144,2 mg; tR {{4{{2{{{218} }9}}3}}}} min; randament de izolare: 0,002884 la sută). Fracția TEB3 (5,5 g) a fost supusă cromatografiei RP-18 (coloană: 7 × 25 cm; MeOH–H2O, 1:1; 1:0, v/v) și subfracției TEB3-6 ( 1,0 g) au fost izolate în continuare de Sephadex LH-20 (coloană: 5 × 54 cm; MeOH) pentru a obține șapte subfracții (TEB{3-6-1 la 3-6-7). TEB3-6-4 (377,1 mg) a fost separat prin cromatografie pe gel MCI (coloană: 2,5 × 23 cm; H2O–MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 40:60; 20:80; 0: 100, v/v) pentru a da șapte subfracții (TEB3-6-4-1 la 3-6-4-7). TEB{83}} (38,1 mg) a fost purificat prin RP-HPLC (MeOH-H2O, 45:55 în acid formic 0,1 procente, v/v) pentru a da 1 pur (12,2 mg; tR=17 min); randament de izolare: 0,000244 la sută). În plus, TEB3-6-4-6 (31,0 mg) a fost condus cu RP-HPLC (MeOH-H2O, 40:60 în acid formic 0,1 procente, v/v) pentru a produce 6 (7,1 mg; tR=28 min. randament de izolare: 0,000142 la sută). TEB3-6-5 (410,7 mg) a fost izolat prin cromatografie pe gel MCI (coloană: 2,5 × 23 cm; H2O–MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 50:50; 40:60; 30: 70; 20:80; 0:100, v/v) pentru a da opt subfracții (TEB3-6-5-1 la 3-6-5-8). TEB3-6-5-3 (75,1 mg) a fost purificat prin cromatografie pe gel MCI (coloană: 1 × 20 cm; H2O–MeOH, 80:20; 70:30; 0:100, v/v) pentru a da compușii 4 (59,3 mg; randament de izolare: 0,001186 la sută) și 5 (10,2 mg; randament de izolare: 0,000204 la sută). Subfracția TEB3-6-5-4 (97,0 mg) a fost purificată prin RP-HPLC (MeOH-H2O, 40:60 în acid formic 0,1 procente, v/v) pentru a obține 7 (46,4 mg; tR=18 min; randament de izolare: 0,000928 la sută). TEB3-10 (925,4 mg) a fost cromatografiat pe o cromatografie pe gel MCI (coloană: 2,5 × 28 cm; H2O–MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 50:50; 40:60; 30) :70; 10:90; 0:100, v/v) pentru a da opt subfracții (TEB3-10-1 la 3-10-8) și 2 pur (393,4 mg; randament de izolare: 0,007868 la sută). Compusul 3 (6,3 mg; tR=8 min; randament de izolare: 0,000126 la sută) a fost obținut din TEB3-10-2 (20,9 mg) prin purificare RP-HPLC (MeOH-H2O, 30:70 în 0,1 la sută formic acid, v/v).

3.3.1. Tuliposide H (1)

[]23D -23,1 (c 0,12, MeOH); IR (pură) νmax 3376 (OH), 2960, 2934, 2875 (CH), 1725 (C=O), 1640, 1589, 1459, 1382, 1259, 1167, 1075, C–10-4 C), 926, 900, 632, 521 cm-1; Date spectroscopice 1H și 13C RMN, vezi Tabelul 1; HRESIMS m/z 351,1652 [M-H]- (calculat pentru C15H27O9, 351,1655).

3.3.2. Tuliposide I (2)

[]23D -25,8 (c 0,2, MeOH); IR (pură) νmax 3404 (OH), 2961, 2934, 2876 (CH), 1729 (C=O), 1638, 1461, 1378, 1277, 1185, 1165, 1077, C–10–3 C), 897, 736, 625, 517 cm-1; Date spectroscopice 1H și 13C RMN, vezi Tabelul 1; HRESIMS m/z 359,1686 [M plus Na] plus (calculat pentru C15H28O8Na, 359,1682).

3.3.3. Tuliposide J (3)

[ ] 23 D plus 9.0 (c 0.1, MeOH); IR (pură) νmax 3424 (OH), 2953, 2924, 2853 (CH), 1740 (C=O), 1632, 1441, 1401 (C–O–C), 1284, 1205, 1182, 1120 , 1078, 1039, 893, 768, 721 cm−1; Date spectroscopice 1H și 13C RMN, vezi Tabelul 1; HRESIMS m/z 303,1049 [M plus Na] plus (calculat pentru C11H2008Na, 303,1050).

3.4. (R)- și (S)-MTPA Derivate de 1

Prepararea derivatului de ester (S)-MTPA din 1 a fost efectuată printr-o procedură convenabilă de ester Mosher [22,23]. Compusul 1 (3,4 mg, 0.01 mmol) a fost transferat într-un tub RMN curat și apoi uscat complet sub vid înainte de a fi umplut cu azot. În plus, clorură de C5D5N ({{20}},5 mL) și (R)-(−){- -metoxi{- -(trifluormetil)-fenil-acetil (clorura MTPA, 12,2 mg, 0,05 mmoli) au fost adăugate imediat în tubul RMN sigilat care a fost agitat în continuare cu grijă pentru a amesteca proba și clorura de MTPA. S-au înregistrat spectrele 1H RMN și 1H-1H COZY ale amestecului după reacția timp de 24 de ore la temperatura camerei. Esterul (R)-MTPA din 1 a fost de asemenea preparat în mod similar prin procedeul menţionat mai sus. Compus 1: 1H RMN (C5D5N, 500 MHz) 5 0,78 (H-400, t), 1,26 (H{-300, sext), 1,28 (H{3-5, d), 1,52 ( H-200, quint), 3,08 (H{-2, quint), 3,95 (H{-50, m), 4,03 (H{-4a, dd), 4,05 (H{-4) -20, suprapunere), 4,15 (H{-100, t), 4,23 (H{-30, suprapunere), 4,23 (H{-40, suprapunere), 4,36 (H{{{ 68}}a, dd), 4,39 (H-3, suprapunere), 4,43 (H{-4b, dd), 4,53 (H{-60b, d) și 4,95 (H{-60b, d) -10, d).

3.4.1. (S)-MTPA Ester de 1 (1a)

1H RMN (C5D5N, 500 MHz) 5 0,77 (H{-400, t), 1,17 (H{-300, sext), 1,21 (H{3-5, d) , 1,37 (H-200, quint), 3,18 (H{-2, quint), 3,92 (H{-100, t), 3,97 (H{-4a, dd), 4,33 (H-50, m), 4,39 (H{-30, t), 4,49 (H{-4b, brd), 4,64 (H{-60a, dd), 4,96 (H-10, d), 5,05 (H{-60b, d), 5,70 (H{-20, t), 5,76 (H{-40, t) și 5,82 (H-3, m).

3.4.2. (R)-MTPA Ester de 1 (1b)

1H RMN (C5D5N, 500 MHz) 5 0,79 (H-400, t), 1,26 (H{-300, sext), 1,30 (H{3-5, d) , 1,50 (H-200, quint), 3,33 (H{-2, quint), 3,60 (H{-50 , m), 3,94 (H{-4a, dd), 4,11 (H-100, t), 4,12 (H{-30, t), 4,13 (H{-60a, dd), 4,50 (H{-4b, brd), 4,70 (H-10, d), 4,85 (H{-60b, d), 5,56 (H{-20, t), 5,66 (H{-40, t) și 5,81 (H-3, m).

3.5. Hidroliza acidă a tuliposidei I (2)

Izolatul 2 (78,6 mg) a fost hidrolizat în HCI 1 M (1,5 ml) la 100 ◦C timp de 2 ore [8]. După răcire, amestecul de reacție a fost extras cu CH2CI2 (2,0 mL × 3) pentru a oferi analogul tulipalinei, 3-metildihidrofuran-2(3H)-onă (11,1 mg). []23D plus 18,7 (c 1,1, CH2CI2); 1H RMN (CDC13, 400 MHz) 5 1,30 (3H, d, J=7,0 Hz), 1,94 (m), 2,45 (m), 2,61 (m), 4,20 (ddd, J {{43} }.8, 6.8, 6.4 Hz), 4.33 (ddd, J=8.8, 8.8, 2.8 Hz). 13C RMN (CDC13, 100 MHz) 5 15,2, 30,7, 34,1, 66,2, 180,1 (Figura S28); ESIMS m/z 101,06 [M plus H] plus.

3.6. Cultură de celule

Celulele de melanom B16 murin au fost cultivate în Mediu Eagle Modificat Dulbecco (DMEM; GIBCO Invitrogen Corporation, New York, NY, SUA) suplimentat cu 10% ser fetal bovin, 100 U/mL de penicilină și 100 µg/mL de streptomicina la 37%. ◦C într-un incubator cu 5% CO2.

3.7. Măsurarea viabilității celulelor B16

Citotoxicitatea celulelor B16 pentru compușii de testat a fost măsurată prin MTT cu un protocol descris anterior, cu ușoare modificări [6]. Celulele au fost însămânțate în plăci de 96-godeuri (1 × 103 celule/godeu) și cultivate timp de 24 de ore înainte de a fi tratate cu compuși pentru încă 72 de ore. După aceea, mediul a fost îndepărtat, 100 uL de reactiv MTT (Thermo Scientific, Waltham, MA, SUA) (la concentrația finală de 0,5 mg/mL) au fost adăugate în fiecare godeu și apoi incubat la 37 °C timp de 1 oră. Cristalul de formazan a fost dizolvat în 100 uL DMSO, iar densitatea optică a fost măsurată utilizând un cititor de microplăci (SPECTORstar® Nano, BMG LABTECH, Ortenberg, Germania) la 570 nm.

3.8. Măsurarea conținutului de melanină în celulele B16

Conținutul de melanină din celulele B16 a fost testat conform unei metode descrise anterior, cu ușoare modificări [6]. Celulele au fost însămânțate la o densitate de 5 × 103 celule/godeu în plăci de 24-godeuri timp de 24 de ore. Mediul a fost înlocuit cu un mediu de cultură proaspăt de 500 uL care conține 0,5 uM -MSH cu sau fără compuși timp de 72 de ore. Arbutina (1 mM) a fost utilizată ca martor pozitiv. După aceea, mediul a fost îndepărtat și spălat cu PBS (pH 6,8) de două ori. Celulele au fost recoltate cu NaOH (200 uL, 2 N) și apoi încălzite la 85 °C timp de 30 de minute. După răcire la temperatura camerei și centrifugare, absorbanța a fost măsurată la 405 nm folosind un cititor de microplăci.

3.9. Activitatea tirozinazei intracelulare

Analiza activității tirozinazei intracelulare a fost efectuată printr-o metodă ușor modificată, care a fost raportată anterior [6]. Celulele au fost însămânțate în plăci de 24-godeuri la o densitate de 5 × 103 celule/godeu timp de 24 de ore. Celulele au fost tratate în DMEM care conține 0,5 pM -MSH cu sau fără compuși timp de 72 de ore. După îndepărtarea mediului, celulele au fost spălate cu PBS rece (pH 6,8) de două ori. Celulele au fost lizate cu 100 µL tampon de liză (1% triton X-100 în PBS) și congelate la -80 ◦C timp de 15 minute.

Apoi, lizatele celulare au fost centrifugate la 13.200 x g la 4 °C timp de 30 de minute pentru a obține supernatantul. Conținutul total de proteine ​​al supernatantului a fost cuantificat prin testul proteinei BCA. Apoi, fiecare lizat cuantificat (30 µg/90 µL) a fost amestecat cu 10 µL de L-DOPA (15 mM) într-o placă de godeuri și apoi incubat la 37 ◦C timp de 1 oră, iar absorbanța a fost măsurată. la 405 nm folosind un cititor de microplaci.

4. Concluzii

În total, 14 compuși puri, inclusiv trei glicozide izoprenoide noi și părțile de lalele H–J (1–3), au fost izolați din A. edulis. Derivatul 9 al acidului citric, citratul de tributil, a avut o activitate semnificativă anti-melanogeneză, dar a arătat citotoxicitate față de celulele melanomului B16, care ar putea fi cercetat în continuare pentru medicamentele anti-melanom. În timp ce analogii acidului piroglutamic 4 și 6, furanona 10 și furanul 12 aveau conținut crescut de melanină în funcție de doză și tirozinaza activată, care ar putea fi studiate în continuare pentru boala pielii vitiligo sau agenți anti-albire și anti-hipopigmentare pentru păr. Cu toate acestea, mecanismele in vitro și/sau studiile in vivo sunt necesare pentru a fi investigate mai detaliat pentru a verifica eficacitatea componentelor active.

Materiale suplimentare:

Următoarele sunt disponibile online, Figurile S1–S5: Date spectrale RMN ale compusului 1, Figurile S6–S10: Date spectrale RMN ale compusului 2, Figurile S11–S15: Date spectrale RMN ale compusului 3, Figurile S16–S22: Date spectrale RMN a TEW, Figura S23: Analiza TLC a TEW, Figura S24: Citotoxicitatea și reglarea efectelor melanogenezei TEM, TEE, TEB și TEW, Figura S25: Datele citotoxicității compușilor 1–12, Figura S26: Un grafic de corelație între Conținutul de melanină celulară și efectele asupra tirozinazei compușilor 4, 6, 10 și 12, Figura S27: Efectele de melanogeneză ale compușilor 4, 6, 10 și 12 singuri fără -MSH, Figura S28: Datele de rotație spectrală și optică RMN ale produs obţinut din hidroliza acidă a compusului 2, Figura S29: Biosinteza posibilă a compuşilor 1−3, Tabelul S1: Efectele activităţii tirozinazei ale compuşilor 4, 6, 10 şi 12.

Contribuții ale autorului:

Conceptualizare, C.-LL; identificarea materialului vegetal, Y.-SC; efectuarea izolării și epurării, C.-LL și Z.-AG; efectuarea biotestelor, Y.-LJ; toate analizele spectrale și determinarea structurii, C.-LL și C.-JC; redactarea proiectului original de pregătire, C.-LL Toți autorii au citit și au fost de acord cu versiunea publicată a manuscrisului.

Finanțarea:

Această cercetare a fost finanțată de Ministerul Științei și Tehnologiei (MOST 108-2320-B{039-035-) și China Medical University (CMU108-MF{-84), Taiwan. APC a fost finanțat de „Centrul de Cercetare în Medicină Chineză, Universitatea Medicală din China” din Programul Centrului de Cercetare Zonele Featured în cadrul Proiectului Sprout de Învățământ Superior de către Ministerul Educației (MOE) din Taiwan (CMRC-CHM{{5} }).

Declarația Comisiei de revizuire instituțională:

Nu se aplică.

Declarație de consimțământ informat:

Nu se aplică.

Declarație de disponibilitate a datelor:

Nu se aplică.

Mulțumiri:

Această activitate a fost susținută financiar de Ministerul Științei și Tehnologiei (MOST 108-2320-B{-039-035-) și China Medical University (CMU108-MF{-84), Taiwan, precum și „Centrul de Cercetare în Medicină Chineză, Universitatea Medicală din China” din Programul Centrului de Cercetare pentru Zonele Prezentate în cadrul Proiectului Învățămînt Superior Sprout de către Ministerul Educației (MOE) din Taiwan (CMRC-CHM-1) acordat lui C .-LL

Conflicte de interes:

Autorii nu declară niciun conflict de interese.

Disponibilitatea eșantionului:

Probele de compuși 1-14 sunt disponibile de la autori.

Referințe

1. Lin, R.; Li, Z.; Lin, J.; Da, J.; Cai, Q.; Chen, L.; Peng, J. Extractul etanolic de Tulipa edulis Bak induce apoptoza în celulele de carcinom gastric uman SGC-7901 prin calea de semnalizare mitocondrială. Oncol. Lett. 2015, 10, 2371–2377. [CrossRef] [PubMed]

2. Ventilator, Y.; Hou, X.; Guo, P.; Lv, X.; Zhao, L.; Wang, H.; Zhou, L.; Feng, Y. Extracția de Amana edulis induce apoptoza cancerului hepatic. Evid.-Complement bazat. Altern. Med. 2018, 2018, 3927075. [CrossRef] [PubMed]

3. Ji, YH; Liao, AM; Huang, JH; Thakur, K.; Li, XL; Wei, ZJ Potențialul fizico-chimic și antioxidant al polizaharidelor extrase secvenţial din Amana edulis. Int. J. Biol. Macromol. 2019, 131, 453–460. [CrossRef]

4. Ji, YH; Liao, AM; Huang, JH; Thakur, K.; Li, XL; Wei, ZJ Proprietățile reologice și comportamentul emulsionant al polizaharidelor extrase secvenţial din Amana edulis. Int. J. Biol. Macromol. 2019, 137, 160–168. [CrossRef]

5. Cao, YY; Ji, YH; Liao, AM; Huang, JH; Thakur, K.; Li, XL; Hu, F.; Zhang, JG; Wei, ZJ Efectele modificărilor sulfatate, fosforilate și carboximetilate asupra activităților antioxidante in vitro ale polizaharidelor extrase secvenţial din Amana edulis. Int. J. Biol. Macromol. 2020, 146, 887–896. [CrossRef]

6. Lai, KY; Hu, HC; Chiang, HM; Liu, YJ; Yang, JC; Lin, YA; Chen, CJ; Chang, YS; Lee, CL Noi diterpene leojaponins G−L din Leonurus japonicus. Fitoterapia 2018, 130, 125−133. [CrossRef]

7. Ullah, S.; Chung, YC; Hyun, CG Inducerea melanogenezei de către fosfomicină în celulele B16F10 prin suprareglarea căilor de semnalizare P-JNK și P-p38. Antibiotice 2020, 9, 172. [CrossRef] [PubMed]

8. Christensen, LP; Kristiansen, K. Izolarea și cuantificarea părților laterale de lalele și a lalelelor la lalele (Tulipa) prin cromatografie lichidă de înaltă performanță. Contactați Dermat. 1999, 40, 300−309. [CrossRef]

9. Tripathi, A.; Puddick, J.; Prinsep, MR; Lee, PPF; Tan, LT Hantupeptine B și C, ciclodepsipeptide citotoxice din cianobacteria marine Lyngbya majuscula. Fitochimie 2010, 71, 307−311. [CrossRef]

10. Qabaja, G.; Wilent, JE; Benavides, AR; Bullard, GE; Petersen, KS Sinteză uşoară a esterilor hidroxi-substituiţi enantio-imbogaţiţi prin intermediul unei rezoluţii cinetice catalizate cu acid Brønsted. Org. Lett. 2013, 15, 1266−1269. [CrossRef]

11. Nomura, T.; Kato, Y. Identificarea tuliposidei G, un nou tuliposide de tip ester glucozidic și distribuția sa în lalele. Z. Naturforsch. CJ Biosci. 2020, 75, 75−86. [CrossRef]

12. Gang, FL; Zhu, F.; Li, XT; Wei, JL; Wu, WJ; Zhang, JW Sinteza și evaluarea bioactivităților analogilor acidului L-piroglutamic din plumb de produs natural. Bioorg. Med. Chim. 2018, 26, 4644–4649. [CrossRef]

13. Vereshchagin, AL; Anikina, EV; Syrchina, AI; Lapin, MF; Azin, LA; Semenov, AA Investigarea chimică a substanțelor amare ale fructului de Lonicera caerulea. Chim. Nat. Compd. 1989, 25, 289−292. [CrossRef]

14. Jaime, C.; Ortuño, RM; Font, J. Di- și trisubstituite -lactone. Un studiu conformațional prin calcule de mecanică moleculară și analiză constantă de cuplare. J. Org. Chim. 1986, 51, 3946−3951. [CrossRef]

15. Larchevêque, M.; Henrot, S. Enantiomeric pur, -epoxiesteri din -hidroxilactone: Sinteza -hidroxiesterilor și (-)-GABOB. Tetrahedron 1990, 46, 4277−4282. [CrossRef]

16. Jaime, C.; Segura, C.; Dinarés, I.; Font, J. -lactone substituite cu atomi de hidrogen vicinali. Studiu conformatiilor prin calcule MM2 si analiza constanta de cuplare. J. Org. Chim. 1993, 58, 154−158. [CrossRef]

17. Mori, K.; Fukamatsu, K. O sinteză a (1R,5S)-( plus )-frontalină din acidul (S)-(−)-2-hidroxiparaconic. Liebigs Ann. Chim. 1992, 11, 1191−1193.

18. Miyazawa, M.; Anzai, J.; Fujioka, J.; Ishikawa, Y. Compuși insecticizi împotriva Drosophila melanogaster din Cornus officinalis Sieb. et Zucc. Nat. Prod. Res. 2003, 17, 337−339. [CrossRef] [PubMed]

19. Lee, CL; Wang, CM; Hu, HC; Yen, HR; Song, YC; Yu, SJ; Chen, CJ; Li, WC; Wu, YC Alcaloizii indolici indigo-dolii A–C din părțile aeriene din bucătăria Strobilanthes din medicina tradițională chineză Qing Dai au proprietăți anti-IL-17. Fitochimie 2019, 162, 39−46. [CrossRef] [PubMed]

20. Faizi, S.; Ali, M.; Saleem, R.; Irfanullah; Bibi, S. Completați atribuirile 1H- și 13C-RMN ale stigmatei-5-en{-3-O- -glucozidei și derivatului său acetil. Magn. Reson. Chim. 2001, 39, 399–405. [CrossRef]

21. Kuo, YH; Chen, CC; Wu, PY; Wu, CS; Sung, PJ; Lin, CY; Chiang, HM mecanismele de inhibare a melanogenezei induse de cafeamidă N-(4-metoxifenil). Complement BMC. Altern. Med. 2017, 17, 71. [CrossRef] [PubMed]

22. Ohtani, I.; Kusumi, T.; Kashman, Y.; Kakisawa, H. Aplicarea FT RMN cu câmp înalt a metodei Mosher. Configurațiile absolute ale terpenoidelor marine. J. Am. Chim. Soc. 1991, 113, 4092−4096. [CrossRef]

23. Lee, CL; Chang, FR; Hsieh, PW; Chiang, MEA; Wu, CC; Huang, ZY; Lan, YH; Chen, M.; Lee, KH; Yen, HF; et al. Diterpene ent-abietanice citotoxice din Gelonium aequoreum. Phytochemistry 2008, 69, 276−287. [CrossRef] [PubMed]

1 Departamentul de Cosmeceutică, China Medical University, Taichung 406040, Taiwan.

2 Centrul de Cercetare și Dezvoltare în Medicină Chineză, Spitalul Universitar Medical din China, Taichung 40402, Taiwan.

3 Centrul de Cercetare în Medicină Chineză, Universitatea Medicală din China, Taichung 40402, Taiwan.

4 Departamentul de Științe Farmaceutice Chineze și Resurse de Medicină Chineză, China Medical University, Taichung 40402, Taiwan.

5 Institutul Absolvent de Medicină Integrată, China Medical University, Taichung 40402, Taiwan.

6 Proteomics Core Laboratory, Departamentul de Cercetare Medicală, China Medical University Hospital, Taichung 40402, Taiwan.

For more information:1950477648nn@gmail.com