Eficacitatea de albire a ginsenozidei F1 prin inhibarea transferului de melanină în melanociteseeratinocite umane cultivate în cocultură și echivalent tridimensional al pielii umane

Ginsenozidele sunt principalele ingrediente active ale ginsengului. În fiziologia pielii, ginsenozidele afectează reglarea pigmentului și prezintă activitate anti-îmbătrânire. Conform rapoartelor recente, ginsenozidul Rg1 crește melanogeneza și activitatea tirozinazei în melanocitele umane [1]. În contrast, ginsenozida F1 (GF1) (sFig. 1), un metabolit produs prin hidroliza Rg1, este raportat că inhibă pigmentarea vizibilă. Un studiu clinic realizat de Han și colab. a demonstrat un efect de albire a pielii al GF1 asupra pielii umane bronzate artificial, cauzat de producția de interleukină 13 din celulele T gd epidermice umane [2]. Kim și colab. au arătat că GF1 reduce secreția de melanină prin retracția dendritei, fără efecte asupra conținutului intracelular de melanină și asupra expresiei tirozinazei în celulele melanomului murin B16F10 stimulate de hormonul stimulator al melanocitelor (MSH) [3]. Până în prezent, totuși, nu au fost obținute constatări directe asupra efectelor de albire ale GF1 în mediul epidermic uman format din melanocite și keratinocite într-un sistem experimental in vitro.

Interpolare, în același timp am constatat că există și tirozinază în Cistanche deserticola, iar metoda de oxidare a vitezei tirozinaze-dopa a efectuat cercetările de reglare a activității tirozinazei asupra extractului de glicozid feniletanoid din Cistanche deserticola, rezultatele arată că: feniletanoid total glicozide de Cistanche deserticola Extractul poate reduce semnificativ activitatea tirozinazei. Glicozidul feniletanoid din Cistanche deserticola poate absorbi, de asemenea, eficient radiațiile ultraviolete în lumina soarelui. Structura moleculară a glicozidei feniletanoid are mai multe sisteme conjugate. După scanarea ultraviolete, se constată că are o absorbție puternică între 280nm și 380nm, iar lungimea de undă maximă de absorbție este de 281nm și 333nm. , indicând faptul că glicozidul feniletanoid din Cistanche deserticola are un efect bun de absorbție asupra razelor ultraviolete și poate preveni și atenua mai bine daunele radiațiilor ultraviolete asupra pielii.

Click jing herbs cistanche extract pulbere produs

Fig. 1. Efectul GF1 asupra conținutului de melanină și expresiei tirozinazei în melanocitele umane. GF1 (10 mM, 50 mM, 100 mM) a fost tratat cu celule MNT-1 timp de 24 ore, 48 ore și 72 ore. (A) Conținutul de melanină a fost apoi analizat. (B) A fost analizat nivelul de expresie a tirozinazei. În plus, GF1 (10, 50, 100 uM) a fost tratat cu celule MNT-1 stimulate cu a-MSH (500 nM) timp de 48 de ore și 72 de ore. (C) Conținutul de melanină a fost apoi analizat. (D) A fost analizat nivelul de expresie a tirozinazei. Am tratat melanocitele epidermice umane normale primare (NHEM) cu GF1 (50 mM și 100 mM) în prezența sau absența stimulării a-MSH timp de 48 de ore. (E) Conținutul de melanină a fost apoi analizat. (F) A fost analizat nivelul de expresie a tirozinazei. Celulele MNT-1 au fost tratate cu GF1 (50 mM și 100 mM) timp de 48 de ore într-un mediu de cultură care conține L-tirozină 100 mM sau 500 mM. (G) Apoi, conținutul de melanină a fost analizat. GADPH, gliceraldehidă 3-fosfat dehidrogenază; GF1, ginsenozidă F1.

Aici, am investigat efectele anti-melanogenice ale GF1 asupra celulelor coculturii MNT-1/HaCaT și echivalentului tridimensional (3-D) al pielii umane. În plus, ne-am concentrat pe formarea dendritelor în melanocite și transferul melanozomilor în keratinocite după tratamentul cu GF1. În mod colectiv, descoperirile noastre demonstrează pentru prima dată că GF1 a arătat efectele de albire în epiderma umană coexistând cu melanocite și keratinocite.

Pentru acest studiu, celulele MNT-1 au fost cultivate în mediu minim esențial (MEM) care conține 20% ser fetal bovin (FBS), 1% gentamicină și acid hidroxietil piperazinetansulfonic (HEPES) 20 mM. Celulele HaCaT au fost cultivate în mediu de vultur modificat de dulbecco (DMEM) care conține 10% FBS, 1% gentamicină și 20 mM HEPES. Melanocitele epidermice umane normale (NHEM) au fost achiziționate de la (Lonza, Basel, Elveția) și au fost cultivate în mediu de creștere a melanocitelor-4 (MGM-4). Celulele au fost incubate la 37 C sub o atmosferă de 5% CO2.

Pentru a măsura conținutul de melanină, celulele (2 105) au fost cultivate într-o placă cu 6-godeuri timp de 24 de ore. Celulele au fost tratate cu concentrațiile indicate de GF1. După aceea, celulele au fost spălate de două ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și apoi detașate cu tripsină/EDTA. Celulele au fost lizate prin incubare în 200 ml de NaOH 1 N la 80°C timp de 2 ore. Lizatele celulare au fost transferate pe o placă de 96-godeuri și absorbanța a fost măsurată la 405 nm.

Pentru a efectua Western blotting, celulele au fost spălate de două ori cu PBS rece și apoi lizate în tampon pentru testarea radioimunoprecipitării modificată cu gheață (RIPA) (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% Nonidet P-40 , 0,5% deoxicolat de sodiu, 150 mM NaCl) care conține inhibitori de protează și set de cocktail cu inhibitori de fosfatază (Calbiochem, San Diego, CA, SUA). Proteinele au fost separate prin electroforeză pe gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă (SDS-PAGE) și transferate pe membrane de nitroceluloză. Membranele au fost incubate cu anticorpi primari la 4 C timp de 24 de ore, apoi spălate cu soluție salină tamponată cu tris, inclusiv 0,1% Tween-20, expuse la anticorpi secundari conjugați cu peroxidază timp de 1 oră la temperatura camerei, spălate și apoi vizualizate. folosind un sistem de imagistică Odyssey.

Pentru a analiza transferul de melanozom, celulele MNT{{0}}/HaCaT au fost cultivate într-o placă de 12-godeuri în raport de 1 la 1{0 timp de 24 de ore și apoi, GF1 a fost tratată cu concentrația indicată. Celulele au fost spălate de două ori cu PBS rece și fixate cu 3,5% paraformaldehidă timp de 10 minute. Celulele au fost spălate și tratate cu 0,1% Triton X-100 timp de 10 minute și apoi 0,5% albumină serică bovină (BSA) timp de 1 oră. Anticorpii împotriva proteinei 1 (1:200, roșu) înrudite cu tirozinază și citokeratinei-18 (1:200, verde) au fost utilizați pentru detectarea melanocitelor și a keratinocitelor.

MelanoDerm Skin Tissue Model (TM) este un echivalent viabil reconstituit {{0}}D de piele umană, care conține melanocite și keratinocite normale (MatTek Corp., Ashland, MA). Am folosit MelanoDerm TM (MEL-300-A) care este derivat de la donatori asiatici. Acestea au fost întreținute în noul mediu de întreținere-113, așa cum este recomandat de producător. GF1 a fost aplicat pe MelanoDerm TM în zilele 0, 4, 6, 8, 11, 13 și 15. Înainte de tratamentul cu GF1, țesuturile au fost spălate cu 1 mL de PBS pentru a îndepărta orice compus rezidual. Țesuturile au fost fixate în ziua 18 pentru analiza histologică. Evaluarea histologică a fost efectuată la microscop cu lumină (Bx-41; Olympus, Tokyo, Japonia), iar microfotografiile au fost realizate cu o cameră digitală (DP72; Olympus). Melanodermul a fost fixat într-o soluție de formaldehidă tamponată cu 4 procente pentru colorare. Probele au fost încorporate în ceară de parafină, tăiate la o grosime de 3 mm și colorate folosind soluție de colorare Hematoxilină și Eozină și Fontana și Mason. Toate datele sunt exprimate ca valori medii SD (deviația standard), iar testul t Student a fost folosit pentru comparații statistice. O valoare p < 0,05 a fost considerată semnificativă statistic (valorile p individuale sunt date în legendele figurilor).

Pentru a stabili efectul GF1 asupra melanocitelor umane, am tratat celulele melanomului uman foarte pigmentate (MNT-1) cu GF1 timp de 24, 48 și 72 de ore, urmată de o analiză a conținutului de melanină intracelulară și a expresiei proteinei tirozinazei. . După cum se arată în Fig. 1A, GF1 nu a avut niciun efect inhibitor asupra conținutului de melanină într-un interval de concentrație de 10-100 mM. În plus, expresia tirozinazei nu a fost scăzută de GF1 în celulele MNT-1 (Fig. 1B, sFig. 2A). Tratamentul celulelor MNT-1 stimulate de a-MSH cu GF1 timp de 48 de ore și 72 de ore nu a dus la suprimarea conținutului de melanină (Fig. 1C) sau a expresiei tirozinazei (Fig. 1D, sFig. 2B). Pentru a confirma în continuare efectul GF1 asupra melanocitelor umane, am tratat NHEM primar cu GF1 în prezența sau absența stimulării a-MSH timp de 48 de ore. Similar cu datele obținute cu celulele MNT-1, GF1 nu a afectat conținutul de melanină (Fig. 1E) sau expresia tirozinazei (Fig. 1F, sFig. 2C) în NHEM. În cele din urmă, am evaluat dacă nivelul de L-tirozină din mediul de cultură afectează activitatea GF1, deoarece L-tirozina este substratul tirozinazei pentru sinteza melaninei. În consecință, celulele MNT-1 au fost tratate cu GF1 timp de 48 de ore în mediu de cultură care conține L-tirozină 100 mM sau 500 mM. După cum se arată în Fig. 1G, GF1 nu a inhibat conținutul de melanină din celulele MNT-1, indiferent de concentrația de L-tirozină.

Fig. 2. Efectul GF1 asupra formării dendritelor și transferului de melanozomi în celulele MNT-1/HaCaTcocultivate și un echivalent 3-D de piele umană. Celulele MNT-1/HaCaT cultivate au fost tratate cu 100 mM GF1 în prezența sau absența stimulării a-MSH (5{00 nM) timp de 48 de ore. (A) După fixare, am observat formarea de dendrite în melanocite folosind microscopie optică (bară de scară; 50 mm). (B) Pentru imunocolorare, am colorat melanozomii cu anticorp TRP-1 (culoare roșie) și keratinocitele cu citokeratină-18 (culoare verde). Săgețile albe indică melanozomul transferat la HaCaT din celulele MNT-1 (bară de scară; 20 mm). Echivalentul pielii umane (MelanoDerm; n ¼ 3) a fost tratat cu acid Kojic 1% ca compus de albire de referință și GF1 (10 și 50 ug/ml) timp de 18 zile. (C) După tratament, echivalentele pielii au fost fotografiate. (D) S-a calculat valoarea de 6 L (gradul de lejeritate în comparație cu martor tratat cu vehicul) pentru fiecare probă de testat. (E) Colorarea cu hematoxilină și eozină (H&E) a secțiunilor de țesut. (F) Colorarea Fontana-Mason (F&M) a secțiunilor de țesut. Lamelele au fost fixate într-o soluție de formaldehidă și încorporate în ceară de parafină pentru colorare (bară de scară; 50 mm). Săgețile negre indică melanozomul transferat de la melanocite din stratul bazal la keratinocite din stratul superior. Săgețile albastre indică melanocitele care formează dendritele extinse. (*p < 0,05, **p < 0,01, *p < 0,001). CON, control; GF1, ginsenozidă F1; KA, acid kojic.

În urma constatării că GF1 nu exercită un efect anti-melanogenic în melanocite umane monocultivate, am analizat în continuare dacă GF1 afectează sinteza melaninei în melanocite într-un sistem experimental care conține atât keratinocite, cât și melanocite cu posibilitatea de comunicare celulă-celulă. Celulele MNT-1 și HaCaT (o linie de celule de keratinocite normale umane imortalizate) au fost cocultivate cu 100 mM GF1 în prezența sau absența iradierii UV-B. După 48 de ore (sFig. 3A) sau 72 de ore (sFig. 3B), am evaluat conținutul de melanină din celulele MNT-1 izolate și cocultivate. Datele noastre au arătat că GF1 nu inhibă sinteza melaninei atât în ​​grupurile de celule izolate MNT-1, cât și în cocultură.

În plus față de sinteza melaninei, ne-am concentrat pe eficacitatea inhibitoare a GF1 asupra transferului melanozomilor de la melanocite la keratinocite. Mai exact, celulele MNT-1/HaCaT cocultivate au fost tratate cu 100 mM GF1 în prezența sau absența stimulării a-MSH (Fig. 2A), urmată de o examinare a formării dendritelor în melanocite, care este necesară pentru transferul melanozomului. . Interesant, dendritele întinse induse de aMSH au fost retrase la tratamentul cu GF1. Apoi, am colorat melanozomii TRP-1-pozitivi (roșu) pentru celulele MNT1 și citokeratină-18 (verde) pentru celulele HaCaT în coculturi. După cum se arată în figura 2B, melanozomii TRP-1-pozitivi în celulele MNT-1 au fost transferați în celulele HaCaT după stimularea a-MSH, care a fost inhibată semnificativ de GF1. Aceste rezultate indică faptul că GF1 suprimă transferul melanozomilor, provocând retragerea dendritei a melanocitelor.

Pentru a extinde această investigație la un sistem mai fiziologic, am examinat capacitatea de albire a GF1 într-un echivalent al pielii umane 3-D, care este un strat epidermic format din melanocite și keratinocite. În Fig. 2C, țesutul tratat cu GF1-a apărut mai ușor decât țesutul de control, iar valoarea L (un indice de luminozitate/întuneric) a fost modificată la tratamentul cu GF1 (Fig. 2D). În plus, colorarea cu hematoxilină și eozină a secțiunilor de țesut nu a evidențiat nicio colaps sau toxicitate tisulară (Fig. 2E). Experimentele de colorare Fontana și Mason au arătat că GF1 inhibă formarea dendritelor melanocitelor în stratul bazal și suprimă simultan transferul melanozomilor de la melanocitele din stratul bazal la keratinocitele din stratul superior diferențiat (Fig. 2F). Aceste descoperiri susțin în mod colectiv eficacitatea inhibitoare a GF1 în transferul melanozomilor, ceea ce duce la promovarea albirii în modelul de țesut al pielii umane.

În studiul de față, GF1 nu a inhibat sinteza melaninei și exprimarea tirozinazei; mai degrabă, GF1 a crescut ușor conținutul de melanină intracelulară și expresia tirozinazei în celulele MNT-1 și celulele cocultivate (Fig. 1A și 1B și sFig. 3A). Totuși, simultan, am descoperit că GF1 a inhibat transferul melanozomilor prin formarea scăzută de dendrite a melanocitelor. Bănuim că creșterea conținutului de melanină intracelulară de către GF1 ar putea fi cauzată de acumularea melanozomilor din cauza blocării transferului melanozomului și inducerea expresiei tirozinazei. Pigmentarea vizibilă a pielii este determinată de cantitatea de dispersie a melanozomilor din diferitele zone ale dendritelor extinse ale melanocitelor către keratinocitele din jur [4]. Câțiva compuși, cum ar fi centaureidina și metilofiopogonanona B, au demonstrat eficacitate de albire, ducând la retragerea dendritei melanocitelor fără a influența expresia enzimei melanogene sau sinteza melaninei [5]. Prin urmare, blocarea transferului melanozomilor în keratinocite din melanocite este considerată o abordare eficientă pentru a induce un efect de albire, deși biosinteza melaninei nu este inhibată. Prin urmare, am considerat că conținutul crescut de melanină de către GF1 are un impact redus asupra eficacității de albire a GF1. În plus, melanozomii acumulați ar fi degradați prin autofagie pentru homeostazia pielii, deși soarta melanozomilor este neclară [6].

Am demonstrat pentru prima dată că GF1 suprimă formarea dendritei indusă de a-MSH, ducând la inhibarea transferului melanozomilor în keratinocite în coculturi de celule umane. În plus, GF1 a perturbat transferul de melanină de la melanocite din stratul bazal la keratinocite din stratul superior, exercitând un efect de albire în echivalentul pielii umane. Experimentele recente de cocultură indică faptul că melanocitele furnizează pigment la keratinocite prin modificări ale morfologiei dendritice, cum ar fi dezorganizarea microfilamentelor de b-tubulină în citoscheletul intracelular [7,8]. Monofosfatul de adenozină ciclică, un inductor de melanogeneză, mediază formarea dendritei prin reglarea în sus a Rac și reglarea în jos a activității Rho [9,10]. Prin urmare, studiile viitoare ale grupului nostru se vor concentra pe o evaluare cuprinzătoare a proteinelor țintă ale GF1, cum ar fi moleculele implicate în calea de semnalizare a adenozinei monofosfatului ciclic.

În mod colectiv, rezultatele noastre oferă dovezi preliminare că GF1 are potențialul de dezvoltare ca un reactiv de albire eficient pentru tratamentul tulburărilor pigmentare și deschiderea culorii întunecate a pielii ca ingredient cosmetic.

Conflicte de interes

Toți autorii care contribuie declară că nu există conflicte de interese.

Mulțumiri

Această cercetare a fost susținută și finanțată de Centrul de cercetare și dezvoltare Amorepacific.

Referințe

[1] Lin M, Zhang BX, Zhang C, Shen N, Zhang YY, Wang AX, Tu CX. Ginsenozidele Rb1 și Rg1 stimulează melanogeneza în melanocitele epidermice umane prin semnalizarea PKA/CREB/MITF. Evid. Bazat. Completa. Alternat Med 2014;2014: 892073

[2] Han J, Lee E, Kim E, Yeom MH, Kwon O, Yoon TH, Lee TR, Kim K. Rolul interleukinei 13 derivate din celulele T epidermale gd în efectul de albire a pielii al Ginsenoside F1. Exp Dermatol 2014;23:860e2.

[3] Kim JH, Baek EJ, Lee EJ, Yeom MH, Park JS, Lee KW, Kang NJ. Ginsenozidul F1 atenuează hiperpigmentarea celulelor melanomului B16F10 prin inducerea retragerii dendritei și prin activarea semnalizării Rho. Exp Dermatol 2015;24:150e2.

[4] Ando H, Niki Y, Ito M, Akiyama K, Matsui MS, Yarosh DB, Ichihashi MJ. Melanozomii sunt transferați de la melanocite la keratinocite prin procesele de ambalare, eliberare, absorbție și dispersie. Invest Dermatol 2012;132:1222e9.

[5] Ebanks JP, Wickett RR, Boissy RE. Mecanisme de reglare a pigmentării pielii: creșterea și scăderea colorării tenului. Int J Mol Sci 2009;10:4066e87.

[6] Katsuyama Y, Taira N, Yoshioka M, Okano Y, Masaki H. Perturbarea transportului melanozomului în melanocitele tratate cu teofilină determină degradarea acestora prin autofagie. Biochem Biophys Res Commun 2017;485: 126e30.

[7] Ni J, Wang N, Gao L, Li L, Zheng S, Liu Y, Ozukum M, Nikiforova A, Zhao G, Song Z. Efectul căii de semnalizare dependentă de receptorul NMDA asupra morfologiei celulare și transferului melanozomului în melanocite. J Dermatol Sci 2016;84:296e304.

[8] Scott G. Rac și rho: povestea din spatele formării dendritelor melanocite. Pigment Cell Res 2002;15:322e30

[9] Scott G, Leopardi S. Calea de semnalizare cAMP are efecte opuse asupra Rac și Rho în celulele B16F10: implicații pentru formarea dendritelor în celulele melanocitare. Pigment Cell Res 2003;16:139e48.

[10] Ma HJ, Ma HY, Yang Y, Li PC, Zi SX, Jia CY, Chen R. Hormonul de stimulare a a-melanocitelor (MSH) și prostaglandina E2 (PGE2) determină transferul melanozomilor prin promovarea eliberării filopodiilor și eliminarea granulelor sferoide: dovezi din observarea microscopiei cu forță atomică. J Dermatol Sci 2014;76: 222e30.

Chang-Seok Lee 1,3 , Gibaeg Nam 1 , Il-Hong Bae 1 , Junseong Park 1,2*

1 Amorepacific CO R&D Center, Yongin-si, Republica Coreea

2Departamentul de Inginerie Chimie, Universitatea Națională Chungbuk, Cheongju-si, Chungbuk, Republica Coreea

3Departamentul de Frumusețe și Științe Cosmetice, Colegiul de Științe ale Sănătății, Universitatea Eulji, Seongnam-si, Republica Coreea

For more information:1950477648nn@gmail.com