Exozomii urinari identifică căile inflamatorii în leziunea renală acută asociată cu vancomicină

A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Linda Awdishu 1,*, Amy Le 1, Jordan Amato 1, Vidhyut Jani 1, Soma Bal 2, Robert H. Mills 1, Marvic Carrillo-Terrazas 1, David J. Gonzalez 1, Ashita Tolwani 3, Anjali Acharya 4, Jorge Cerda 5, Melanie S. Joy 6,7, Paola Nicoletti 8, Etienne Macedo 2, Sucheta Vaingankar 2, Ravindra Mehta 2, Satish P. Ramachandra Rao 9 și în numele anchetatorilor direcți †

1 Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Universitatea din California, San Diego, CA 92093, SUA;a6le@ucsd.edu (AL); jegilmor@ucsd.edu (JA); vgjani@ucsd.edu (VJ); rhmills@health.ucsd.edu (RHM);mac215@health.ucsd.edu (MC-T.); djgonzalez@ucsd.edu (DJG)

2 School of Medicine, University of California, San Diego, CA 92093, SUA; sobal@ucsd.edu (SB);emacedo@ucsd.edu (EM); svaingankar@health.ucsd.edu (SV); rmehta@ucsd.edu (RM)

3 School of Medicine, University of Alabama, Birmingham, AL 35233, USA; atolwani@uab.edu

4 Albert Einstein College of Medicine, The Bronx, NY 10461, USA; anjali2526@gmail.com

5 Albany Medical College, Albany, NY 12208, SUA; jorge.cerda82@gmail.com

6 Division of Renal Diseases and Hypertension, Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical, Aurora, CO 80045, SUA; MELANIE.JOY@cuanschutz.edu

7 Școala de Medicină, Universitatea din Colorado, Aurora, CO 80045, SUA

8 Mount Sinai School of Medicine, New York, NY 10029, SUA; paola.nicoletti@mssm.edu

9 Departamentul de Medicină Celulară și Moleculară, Universitatea din Michigan Medical System, Ann Arbor, MI 48109, SUA; satishpr@med.umich.edu

* Corespondență: lawdishu@ucsd.edu; Tel.: plus 858-534-3919

† Calitatea de membru al anchetatorilor direcți este prevăzută în Mulțumiri.

Abstract:

Fundal:Vancomicina este utilizată în mod obișnuit ca terapie de primă linie pentru organismele gram-pozitive, cum ar fi Staphylococcus aureus rezistent la meticilină. Acut indus de vancomicinărinichirănire(V-AKI) a fost raportat la până la 43 la sută dintre pacienți, în special la cei cu concentrații minime țintite mai mari. Mecanismul precis de vătămare la om rămâne evaziv, cu dovezi recente îndreptate către apoptoza celulelor tubulare proximale. În acest studiu, am investigat conținutul de proteine ​​al exozomilor urinari la pacienții cu V-AKI pentru a elucida în continuare biomarkerii mecanismelor de leziune și răspunsurile potențiale. Metode: Au fost incluse în analiză probe de urină de la pacienții cu V-AKI care au fost înrolați în studiul DIRECT și controale sănătoase potrivite de la UAB-UCSD O'Brien CenterBiorepository. Exozomii au fost extrași folosind principiul de excludere a solventului și precipitarea indusă de polietilen glicol. Identitatea proteinei și cuantificarea au fost determinate prin cromatografie lichidă fără etichetă-spectrometrie de masă (LC/MS). Creatinina serica maximă medie a fost de 3,7 ± 1,4 mg/dL, iar timpul până larinichirănirea fost de 4,0 ± 3,0 zile. La externare, 90 la suta dintre pacienti au demonstrat recuperare partiala; 33% au experimentat o recuperare completă până în ziua 28. Analizele proteomice pe cinci V-AKI și 7 probe de control au evidențiat proteine ​​din 2009 în toate probele și 251 de proteine ​​asociate semnificativ cu V-AKI (scor Pi > 1). Cele mai importante proteine ​​discriminatorii au fost complementC3, complement C4, proteina de legare a galectinei-3-, fibrinogenul, alfa-2 macroglobulina, mu constanta grea a imunoglobulinei și serotransferina.

Concluzie:Exozomii urinari relevă o reglare în sus a proteinelor inflamatorii după leziuni nefrotoxice în V-AKI. Sunt necesare studii suplimentare pentru un eșantion mare de pacienți pentru a confirma aceste constatări pentru elucidarea mecanismelor fiziopatologice și validarea potențialilor biomarkeri de leziune.

Cuvinte cheie:vancomicină; AKI; nefrotoxicitate; exozomi; inflamație; completa; căi imune

Cistanche herbapoate trata leziunile renale

Chengdu Wecistanche arecistancheproduse pentru tratarea leziunilor renale

1. Introducere

Vancomicina este un antibiotic glicopeptidic utilizat pentru tratamentul infecțiilor cu Staphylococcus aureus rezistent la meticilină la pacienții în stare critică. Nefrotoxicitatea este un eveniment advers grav care afectează 10-20% dintre pacienții tratați și este asociată cu o durată crescută de spitalizare, cu 30-rate de readmisie în spitale de zi și cu mortalitate zilnică 30-toate cauzele [1]. Acut asociat cu vancomicinărinichirănire(V-AKI) este legat de doză și cu un debut de inițiere a terapiei de 4-17 zile. Deși V-AKI a fost mult timp recunoscut ca un efect secundar major al vancomicinei, mecanismele nefrotoxicității au rămas prost înțelese. Înțelegerea răspunsurilor celulare și moleculare declanșate de vancomicină este de o importanță cheie pentru înțelegerea mecanismelor și dezvoltarea strategiilor pentru a minimiza riscul de V AKI și costurile asociate, maximizând în același timp eficacitatea acestuia în tratamentul infecțiilor. Răspunsul renal toxic pare să fie cauzat de un efect direct al vancomicinei asupra epiteliului tubilor proximali [2]. Până în prezent, abordările toxicogenomice standard au fost aplicate pentru a studia V-AKI pe modele de șoarece, dar studiile pe oameni lipsesc [3–5]. Modelele animale demonstrează că administrarea de vancomicină induce stres oxidativ care poate contribui la afectarea rinichilor [6,7]. Un posibil mecanism de leziune este prinderea medicamentului în celulele tubulare proximale, deoarece este transportat de transportatorii de cationi organici (OCT) prin membrana bazolaterală și în celula tubulară proximală, dar nu au fost identificate mecanisme active de transport de eflux [6] –8].

Exozomii sunt vezicule microcitare derivate din membrană care joacă un rol cheie în comunicarea intercelulară și livrarea proteinelor/acizilor nucleici și oferă potențialul pentru descoperirea de noi biomarkeri pentru a ajuta la diagnosticarea clinică arinichirănire[9]. S-a propus că exozomii au o specificitate și o sensibilitate mai mare pentru descoperirea biomarkerilor, atribuită stabilității specimenelor în comparație cu abordările transcriptomice și proteomice care utilizează probe convenționale de ser și urină [9]. În acest studiu, am testat ipoteza că modificarea proteinelor exozomului urinar ca răspuns la V-AKI ajută la elucidarea mecanismelor de leziune și la identificarea de noi biomarkeri în rândul pacienților cu leziuni renale confirmate induse de medicamente. Pentru aceasta, am angajat subiecți din studiul Drug-Induced Renal Injury Consortium (DIRECT), care este o cohortă internațională, multicentrică de cazuri adjudecate clinic de acute induse de medicamente.rinichirănireși controale bazate pe populație pentru a examina predictorii farmacogenomicii folosind o asociere la nivel de genom. Detaliile studiului DIRECT sunt descrise în secțiunea Metode și într-o publicație recentă din laboratorul nostru [10].

2. Rezultate

Au fost incluse în analize probe de urină de la 22 de subiecți, 10 cazuri de V-AKI și 12 martori. Datele demografice ale pacientului au fost similare între cazurile V-AKI și controale și sunt rezumate în Tabelul 1. După cum era de așteptat, prevalența hipertensiunii arteriale, diabetului și insuficienței cardiace a fost mai mare în cazurile V-AKI comparativ cu martorii (Tabelul 1).

Toate cazurile V-AKI au dezvoltat AKI stadiul 2 sau mai mare, așa cum este definit de criteriile Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO) (Figura 1) [11]. Debutul V-AKI a avut loc la 4,0 ± 3,0 zile după inițierea cu vancomicină. Evoluția în timp a modificărilor creatininei serice (Scr) după internarea la spital la externarea și ulterior, este prezentată în Figura 1.

Figura 1. Modificări ale creatininei serice în cursul V-AKI. Această cifră ilustrează modificările creatininei serice în 10 cazuri de-a lungul cursului acut asociat cu vancomicină.rinichirănirede la internarea în spital până în ziua 90 după accidentare. Punctele de timp corespund momentelor de studiu ale Consorțiului de leziuni renale induse de medicamente (DIRECT). Abrevieri: SCr=creatinina serică, spital=internare în spital, premedicament=înainte de expunerea la medicament, DIRI=definiția leziunii renale induse de medicament îndeplinită, DrugDC {{8} } întreruperea medicamentului sau reducerea dozei, Nadir Scr=cel mai scăzut ser după V-AKI, Hospital Disch= externare din spital

Factorii de risc inițial în cazurile de V-AKI au inclus sepsis (30 la sută), boli de inimă (30 la sută), diabet zaharat (30 la sută), anemie (20 la sută), expunerea la radiocontrast (10 la sută), boli hepatice (10 la sută) și hipoalbuminemie (10 la sută) (Figura 2).

Cel mult, cazurile de V-AKI au primit episoade de vancomicină cu trei medicamente. Dozele zilnice de vancomicină au variat între 1000 și 4000 mg. Numărul mediu (interquartil interquartile (IQR)) de zile petrecute în fiecare episod de dozare este prezentat în Figura 3. Media (deviația standard (SD)) concentrațiilor plasmatice minime de vancomicină asociate cu episoadele de dozare 1-3 au fost crescute la 20,6 ± 8,1, 29,6 ± 16,3, respectiv 38,0 ± 13 mg/L. Cu toate acestea, diferența de concentrații dintre fiecare dintre episoade nu a fost semnificativă statistic (episodul 1 vs. 2 p=0.5, episodul 2 vs. 3 p=0}.41)

Alte date privind rezultatele sunt rezumate în Tabelul 2. Având în vedere severitatea leziunii, 20% dintre pacienți au necesitat terapie de substituție renală. Mortalitatea în spital a fost de 10%. După externarea din spital, 90 la sută dintre pacienți nu s-au recuperat de V-AKI. Șase pacienți au avut Scr măsurat în ziua 28 după accidentare și patru în ziua 90. Până în ziua 28, doi din șase (33 la sută) pacienți au avut AKD, dar niciunul dintre cei patru pacienți rămași nu a avut AKD până în ziua 90.Rinichibiopsiile au fost efectuate în 20% din cazurile V-AKI (Tabelul 2).

Cele 12 probe care au fost calificate pentru analize după impunerea filtrului pentru potrivirea peptidelor cu spectrele lor înrudite, au conținut un total de 2009 proteine. Aceste proteine ​​au fost analizate în continuare. În primul rând, a fost efectuată o analiză a coordonatelor principale (PCoA) pentru a compara proteomul total al fiecărei probe. Această analiză a evidențiat o separare semnificativă (valoarea p PERMANOVA=0.037) între AKI și probele de control (Figura 4), recapitulând fenotipul la nivel sistemic și la nivelul proteinei exozomului, crescând astfel încrederea noastră în aceste seturi de date. . Puterea asocierii dintre fiecare proteină și starea V-AKI a fost clasificată folosind metrica valorii pi, care combină semnificația valorii p cu schimbarea orificiului [12].

Figura 4. Compoziția proteomului distinge exozomii urinari ai pacienților cu V-AKI și ai controalelor. (A) Analiza coordonatelor principale ale proteomilor probei. Metrica de distanță Bray-Curtis a fost utilizată pentru a calcula diferențele dintre proteomul eșantionului și este prezentat un grafic al coordonatelor principale. Separarea de-a lungul axelor 1 și 3 a fost observată între probele AKI (roșu) și probele de control (albastru). (B) Boxplot care rezumă distanța Bray-Curtis dintre probele de control și AKI. Separarea statistică dintre AKI și probele de control prezentate în (A) a fost testată utilizând un test de analiză permutațională a varianței (PERMANOVA). Sunt afișate boxplot care rezumă rezultatele atunci când se compară distanțe ale probelor de control sau AKI cu probele de control.

Apoi, comparațiile binare între V-AKI și probele de control au dat 42 de proteine ​​asociate semnificativ cu fenotipul AKI și 26 de proteine ​​asociate cu fenotipul de control (scor Pi > 1) (Tabelul suplimentar S1). Un grafic vulcan care ilustrează semnificația și schimbarea pliurilor asociate cu fiecare proteină este prezentat în Figura 5A. Cele mai importante proteine ​​discriminatorii pentru cazurile de V-AKI au fost fibrinogenul, complementul C3, complementul C4, proteina de legare a galectinei-3-, macroglobulina alfa-2, mu constanta grea a imunoglobulinei și serotransferina (Figura 5B). Analiza de îmbogățire a setului de gene a fost efectuată printre proteinele semnificative pentru a identifica categoriile de proteine ​​modificate la pacienții cu V-AKI, iar rezultatele sunt rezumate în tabelul suplimentar S1. S-a demonstrat că mai multe proteine ​​care au fost asociate cu fenotipul AKI au funcții legate de inflamație și/sau mediază fenotipul inflamator. Pentru a testa dacă aceste modificări ale proteinei ar putea fi legate de modificări ale semnalizării citokinelor subiacente, a fost efectuată o inferență de citokine, care a indicat o relație puternică între proteinele asociate cu AKI și citokinele IL10, IL6 și TNF. Aceste citokine au conținut de 2,8, 2,3 și 2.1-ori mai multe conexiuni la proteinele asociate AKI decât proteinele asociate controlului, respectiv, așa cum este rezumat în Figura 5C. Rețelele de interacțiune proteină-proteină ale proteinelor asociate AKI și citokinelor deduse au arătat predominant conexiuni proinflamatorii între proteinele asociate AKI, așa cum este rezumat în Figura 5D.

Figura 5. Asociații la nivel de proteine ​​cu V-AKI. (A) Graficul vulcanului care afișează semnificația schimbării pliului și testului t a fiecărei proteine ​​în starea V-AKI. Primele 10 proteine ​​asociate cu AKI și starea de control sunt afișate în albastru și, respectiv, roșu. Alte proteine ​​asociate bazate pe un Scor Pi > 1 sunt afișate cu galben. (B) Pentru fiecare proteină a fost calculat un scor Pi, care ține cont atât de schimbarea pliului, cât și de semnificația testului t, iar proteinele cu cele mai puternice asocieri sunt reprezentate grafic. (C) Topcitokine asociate cu AKI sau proteine ​​de control. A fost adoptată o abordare a inferenței citokinelor bazată pe rețea și sunt prezentate citokinele care prezintă cele mai puternice scoruri de îmbogățire fie față de AKI, fie față de proteinele asociate de control. Barele roșii reprezintă citokinele legate de proteinele asociate cu AKI, barele albastre reprezintă citokinele legate de proteinele asociate controlului. (D) Rețeaua de interacțiune proteină-proteină a proteinelor asociate cu AKI și citokine deduse îmbogățite cu AKI. Marginea exterioară a nodurilor proteice este colorată în funcție de asocierile cu citokinele pro sau antiinflamatorii. Mărimea fiecărui nod reprezintă puterea asocierii statistice a fiecărei proteine ​​cu statutul AKI.

Cistanche tubulosapoate trata leziunile renale

3. Discuție

Raportăm o nouă abordare pentru a utiliza exozomi urinari pentru a informa mecanismele fiziopatologice implicate în induse de medicamente.rinichirănirefolosind vancomicina ca toxic renal prototip. Unul dintre punctele forte ale acestui studiu este încorporarea de date bine caracterizate la nivel de pacient din studiul DIRECT [10] dezvoltat pentru a elucida mecanisme, inclusiv genomica indusă de medicamente.rinichirănire. Subiecții cu AKI în stadiul 2 sau mai mare au fost expuși la factori de risc convenționali la momentul inițial. Toți subiecții studiului au avut concentrații plasmatice minime semnificativ crescute de vancomicină, în ciuda faptului că au primit doze zilnice mai mici decât pragul de nefrotoxicitate general acceptat de 4 g pe zi [13]. Mulți subiecți nu s-au recuperat complet de V-AKI la externarea din spital și au avut boală acută de rinichi în luna următoare accidentării. După cum era de așteptat, puțini pacienți au primit o biopsie renală.

Proteomica exozomului urinar/veziculelor extracelulare (EV) a demonstrat că proteinele discriminatorii vizate pentru cazurile de V-AKI includ complementul C3, complementul C4, proteina de legare a galectinei-3-, fibrinogenul, macroglobulina alfa{-2, imunoglobulina constantă grea mu și serotransferină. Aceste descoperiri exozomi informează mecanismele de leziune la nivel subcelular/supra-molecular pentru V-AKI și pot servi ca biomarkeri de-a lungul continuumului procesului de boală indus de medicament.

Exozomii, prezenți în sânge și urină, au roluri importante în comunicarea intercelulară, coagulare și gestionarea deșeurilor [14]. După acute legate de toxinerinichirănire, exozomii eliberați din celulele epiteliale tubulare pot comunica semnale de leziune pentru a recruta infiltrarea macrofagelor și pentru a promova inflamația tubulointerstițială [15]. Am argumentat că conținutul de proteine ​​al exozomilor ar diferi între cazurile de V-AKI și controalele sănătoase. Două sute cincizeci și una de proteine ​​au fost dereglate în V-AKI și acestea păreau a fi implicate predominant în căile inflamatorii și de coagulare. Dintre aceste 251 de proteine, analiza noastră a demonstrat că complementul C3, complementul C4, proteina de legare a galectinei-3-, fibrinogenul, alfa-2 macroglobulina, mu constanta grea a imunoglobulinei și serotransferina au fost asociate în mod semnificativ cu cazurile de V-AKI.

Pe baza rezultatelor noastre că C3 și C4 au fost printre proteinele exozomale V-AKI cu discriminare de top, propunem că activarea unui sistem de complement este implicată în leziunea tubulară renală indusă de vancomicină. Acest lucru este, de asemenea, în acord cu literatura publicată, că activarea sistemului complement joacă un rol în glomerulonefrita complexului imun și într-o gamă diversă de boli de rinichi [16]. Leziunile renale mediate de activarea complementului în AKI din cauza ischemiei sau expunerii la nefrotoxină au fost legate de evenimente inflamatorii sistemice care declanșează și contribuie la leziuni ale organelor de la distanță și la mortalitatea pacientului [17]. În modelele de leziuni de ischemie-reperfuzie (IR), hipoxia, depleția de ATP și deteriorarea mitocondrială duc la generarea de radicali liberi de oxigen la reperfuzie [18]. Citokinele, chemokinele și activarea complementului amplifică inflamația, ducând la leziuni tubulare acute. În plus, șoarecii cu deficit de receptor C3a și C5a sunt protejați de leziuni IR [19,20]. S-a demonstrat că leziunea IR reglează în creștere producția locală a componentelor complementului prinrinichicelule endoteliale și tubulare [16,21]. Mai multe studii pe modele animale și subiecți umani au identificat o depunere crescută a produselor proteice ale complementului, cum ar fi C3 și C4 de-a lungul membranei bazale tubulare, după traumatisme sau leziuni la nivelulrinichi. Aceste niveluri crescute de depuneri nu s-au dovedit a fi prezente în mod semnificativ în regiunea peritubulară sau glomerulară, dar sunt concentrate puternic în membrana tubulară, așa cum se observă în biopsiile de rinichi la om și la modelul animal [17]. Exozomii și EV-urile pot transporta componente ale complementului circulator atunci când activarea complementului este dereglată [22,23]. Mai multe experimente celulare și observații clinice au confirmat că EV-urile eliberate transportă și modulează proteinele complementului și, simultan, producția lor în condiții inflamatorii este, de asemenea, capabilă să influențeze numărul de vezicule circulatorii [23]. Această interdependență a celor două procese conduce la concluzia că EV-urile prezintă potențialul de a fi surse de biomarkeri, ținte și agenți de livrare terapeutică față de compuși complementari și imunomodulatori care sunt foarte relevanți în domeniul mecanismelor inflamatorii ale AKI. Constatarea noastră că probele V-AKI, în comparație cu martorii sănătoși, demonstrează rolul răspunsurilor imune la toxicitatea directă a vancomicinei în celulele tubulare renale. În plus față de tot conținutul de proteine ​​de mai sus, exozomii/EV-urile derivate din urină reprezintă, de asemenea, potențiali biomarkeri neinvazivi ca alternative la biopsia renală pentru a detecta și a informa cu privire la rolul sistemului de complement în tratamentul indus de medicamente.rinichirănire.

Deși multe studii anterioare (a se vedea următoarele câteva propoziții pentru referințe specifice) s-au concentrat pe rolul galectinei-3 (Gal-3) înrinichirănire, există puține date despre proteina de legare a galectinei-3 (Gal-3-bp). Gal-3 este exprimat în tubii colectori ai rinichilor și funcționează pentru a promova nefrogeneza, modulează interacțiunile celulă-celulă și celulă-matrice și reglează inflamația [24-26]. Henderson şi colab. a analizat rolul Gal-3 în inflamație și a constatat că Gal-3 este o componentă cheie în inflamația cronică și dacă leziunile tisulare devin recurente. Ea facilitează „delimitarea” leziunii tisulare, întârziind răspândirea leziunii [27]. În plus, Nishiyama și colab. a demonstrat la șobolanii cu AKI ischemică că ARNm Gal-3 a fost reglat în sens pozitiv, iar următoarea reperfuzie, imunohistochimia a evidențiat creșterea Gal{-3 în segmentele de nefron [25]. Tsuchiyama și colab. a constatat că administrarea Gal-3 la șobolani cu nefrită serică nefrotoxică a condus la o reducere a excreției urinare de proteine, la formarea semilunii și la scăderea infiltrației macrofagelor în glomeruli [28]. Acest lucru sugerează că după leziuni ischemice sau mediate imun, Gal-3 joacă un rol în regenerare. În calitate de partener înrudit cu Gal-3, rolul fundamental al Gal-3-bp și motivul reglării sale în leziunile nefrotoxice cauzate de vancomicina și alți agenți, ar fi un accent imperativ în investigațiile viitoare.

Studiul nostru a mai constatat că toate cele trei subunități ale fibrinogenului sunt dereglate, în acord cu datele publicate anterior. Fibrinogenul este o moleculă de plasmă dimerică solubilă și fiecare dimer este compus din trei polipeptide: alfa, beta și gamma [29]. Joacă un rol cheie în hemostază și coagulare, dar s-a dovedit a fi importantă și în reglarea stărilor mediate de inflamație [30-32]. Ajay şi colab. a arătat că disponibilitatea fibrinogenului este importantă pentru funcția rinichilor, inflamație și supraviețuire [33]. În plus, fibrinogenul ar putea avea un efect antiadeziv asupra celulelor epiteliale renale, care poate fi benefic, ajutând la prevenirea obstrucției tubulare [34]. Fibrinogenul este crescut și reglat în mod semnificativ în AKI și a fost evaluat anterior ca un potențial biomarker pentru detectarea precoce a AKI [29]. Hoffman și colab., au studiat modificarea fibrinogenului după ischemie/reperfuzie și administrarea de cisplatină la șobolani, iar ARNm a fost reglat la 30 de minute după leziunea IR bilaterală și a atins un vârf la 48-72 de ore, în timp ce în administrarea de cisplatină, expresia ARNm a fibrinogenului a fost detectat la 24 h [29]. Fibrinogenul urinar a fost detectat încă de la 3 ore după leziunea de reperfuzie ischemică și la 24 de ore după administrarea de cisplatină, corespunzând cu creșteri mari alerinichirăniremolecula 1 (KIM-1) [29].

Beneficii Cistanche: poate trataleziuni renale

Din punct de vedere istoric, două mecanisme fiziopatologice diferite pentru V-AKI au fost în general acceptate, necroza tubulară acută prin efecte toxice directe și nefrita interstițială acută. Epiteliul tubular proximal renal suferă pierderea integrității citoscheletice, necroză și apoptoză în necroza tubulară acută [35]. Celulele necrotice eliberează molecule care reglează în sens pozitiv sistemul imunitar înnăscut inducând inflamația și accelerând leziunea tubulară [35]. În studiul actual, am demonstrat markeri inflamatori în EV-urile urinare ale pacienților cu V-AKI. În plus, am găsit o relație proinflamatoare între citokinele IL10, IL6 și TNF și proteinele noastre de top discriminatoare AKI. Luate împreună, aceste date sugerează că patofiziologia V-AKI este una a toxicității tubulare cu reglarea în creștere a inflamației în perioada de 24-72 de ore după leziune.

Există mai multe limitări ale studiului nostru. Dimensiunea mică a eșantionului de 22 de pacienți care erau bărbați și predominant caucazieni limitează generalizarea constatărilor noastre la alte sexe, rase și etnii. O a doua limitare a studiului nostru a fost faptul că probă de exozom urinar a fiecărui pacient a avut cantități variabile de proteine ​​totale, făcând astfel dificilă măsurarea proteinelor specifice, în special pentru cele cu cantități absolute mai mici. Deși aceasta nu este neapărat limitarea acestui studiu în sine, deoarece capacitatea fiecărui individ de a împacheta proteine ​​în exozomii lor din urină este variabilă în mod natural, cantitățile mai mici de proteine ​​la unii indivizi limitează capacitatea noastră de analize ulterioare și de a trage concluzii semnificative care sunt generalizabile la populații mai mari. O a treia limitare este eșantionul unic punct de timp, care limitează înțelegerea noastră a modificărilor celulare care apar la diferite faze ale continuumului AKI, de exemplu, faza imediată a leziunii, faza de reparare etc. Eșantionarea secvenţială ne va aprofunda înțelegerea cursului de timp al conținutului exozomului. modificări, stresul oxidativ indus de acumularea de medicamente și reglarea în creștere a căilor imune în reparație. Studiul actual a inclus pacienți așa cum sunt definiți de pragurile Scr. Creatinina serică este un biomarker funcțional renal imperfect, deoarece creșterile Scr rămân adesea în urma leziunii [36]. Acest lucru limitează sensibilitatea și specificitatea Scr de a detecta precocerinichirănire[36] și au apărut studii de identificarerinichirănirebiomarkeri precumrinichi răniremolecula 1 (KIM1) și lipocalină asociată cu gelatinaza neutrofilă (NGAL) pentru detectarea precoce a nefrotoxicității [37,38]. După cum s-a raportat anterior, biomarkerii au potențialul de a detecta atât niveluri vizibile, cât și subclinice ale induse de medicamente.rinichirănire[39,40].

4. Materiale și Metode

4.1. Selectarea pacientului

Au fost incluse în analiză probe de urină de la 10 pacienți cu V-AKI, care au fost înscriși în studiul DIRECT [10] și 12 probe de urină de control sănătos din Biorepositoryul Centrului UAB-UCSD O'Brien. Subiecții de control au fost corelați în funcție de sex, rasă și vârsta de 10 ani cu subiecții de studiu și nu au avut expuneri la vancomicină sau cunoscute.rinichirănire. Studiul DIRECT este un studiu internațional care examinează predictorii farmacogenetici ai induși de medicamenterinichirănirefolosind un studiu de asociere la nivel de genom al cazurilor și controalelor bazate pe populație [10]. Studiul DIRECT a fost aprobat de consiliul de cercetare instituțional (IRB # 121651) și a fost obținut consimțământul informat scris de la toți participanții înainte de înscriere, care a inclus furnizarea de utilizare a specimenelor stocate pentru analize viitoare. AKI a fost definită în DIRECT ca o reducere bruscă a funcției renale demonstrată prin oricare dintre următoarele criterii: (1) creștere absolută a creatininei serice (Scr) (mai mare sau egală cu 0,3 mg/dl sau mai mare sau egală cu 26,4 µmol/). L) (în intervalul de 48-h) de la valoarea de referință Scr, (2) creștere procentuală a Scr de Mai mare sau egal cu 50 la sută (de 1,5 ori față de referință) în șapte zile, (3) reducerea urinei ieșire (oligurie documentată a<0.5 ml/kg/h="" for="">6 h) în ciuda unei resuscitări adecvate cu lichide, atunci când este cazul, (4) scăderea absolută a Scr mai mare sau egală cu 0,3 mg/dL sau Mai mare sau egală cu 26,4 µmol/L (în intervalul 48- h fereastră de timp) de la referința Scr și (5) scăderea relativă a Scr de Mai mare sau egală cu 50 la sută (de 1,5 ori față de referință) în decurs de șapte zile. Pacienții cu AKI în stadiul 2 sau mai mare în urma expunerii la vancomicină au fost înrolați în studiu. Datele clinice, inclusiv datele demografice, istoricul medical, constatările examenelor fizice, semnele vitale, chimia sângelui și urinei, rezultatele biopsiei și datele privind dozarea medicamentelor, au fost colectate la următoarele momente: (1) internare la spital, (2) inițierea vancomicinei, ( 3) vârf de vătămare, (4) întreruperea medicamentului sau reducerea dozei, (5) rezolvarea vătămării, (6) externarea din spital, (7) 28 de zile și (8) 90 de zile după accidentare. Un episod de dozare de vancomicină a fost definit ca o modificare a dozei sau a frecvenței. Boala renală acută (AKD) este definită ca persistența AKI în stadiul 1 sau mai mare Mai mare sau egală cu 7 zile după expunere [41]. Pacienții au fost clasificați cu AKD la externarea din spital dacă AKI stadiul 1 sau mai mare a persistat și timpul de la expunere până la externarea a fost mai mare de șapte zile. Au fost obținute probe de urină și sânge integral de la toți participanții. Toate cazurile de V-AKI au fost adjudecate de doi nefrologi independenți (EM, JC, RL) pentru a determina cauzalitatea. O descriere completă a metodelor a fost publicată anterior [10].

4.2. Prepararea exozomilor și colectarea datelor proteomice

Au fost colectate probe de urină și sânge de la participanții la studiu DIRECT și probele au fost congelate la -80 ◦ C înainte de pregătirea exozomului. Probele de urină utilizate în această analiză au fost selectate din perioada de timp cea mai apropiată de afectarea rinichilor, variind între 24 și 72 de ore după.rinichirănire. Exozomii au fost extrași din probe de urină AKI congelate folosind un protocol intern dezvoltat pe baza principiului de excludere a solvenților folosind precipitarea indusă de polietilen glicol (PEG), așa cum este descris în Rao și colab. publicația recentă [42] a proteinelor exosomale a fost făcută înainte de tripsinizarea gelului utilizând geluri cu 12 godeuri de acrilamidă NuPAGE bisTris10% pentru a elimina 40 µL de proteină din exozomii probelor de urină de control și-AKI.

Extractele de gel au fost combinate cu un tampon pentru a preveni proteoliza care conținea 75 mM NaCI (Sigma, St. Louis, MO, SUA), 3% dodecil sulfat de sodiu (SDS, Fischer, Arnold AFB, Tullahoma, TN, SUA), 1 mM NaF (Sigma, St. Louis, MO, SUA), 1 mM beta glicerofosfat (Sigma, St. Louis, MO, SUA), 1 mM beta-glicerofosfat (Sigma, Sigma, St. Louis, MO, SUA), 1 mM sodiu ortovanadat (Sigma, St. Louis, MO, SUA), 10 mM pirofosfat de sodiu (Sigma, St. Louis, MO, SUA), 1 mM fluorură de fenilmetilsulfonil (PMSF, Sigma) și 1× Mini EDTA complet Comprimat de inhibitor de protează liber, totul în HEPES 50 mM (Sigma, St. Louis, MO, SUA), pH 8,5. Pentru a denatura proteinele, s-a adăugat un volum egal de 8 M uree în 50 mM HEPES, pH 8,5 și s-a efectuat sonicarea sondei folosind intervale de două 10-s la amplitudine de 25%. Proteinele au fost reduse, alchilate și stinse folosind ditiotreitol și iodoacetamidă, așa cum s-a descris anterior [43]. Proteinele au fost precipitate prin adăugarea de acid tricloracetic (Sigma, St. Louis, MO, SUA) la probele pe gheață și peletizarea proteinelor prin centrifugare la 4 ◦ C. Peletele de proteine ​​au fost spălate de două ori cu acetonă rece ca gheață. Peletele de proteine ​​au fost uscate la 56 ◦C timp de 30 de minute, apoi resuspendate în 1 M uree în 50 mM HEPES apoi digerate peste noapte la temperatura camerei cu 6 ug de LysC (Wako, Richmond, Commonwealth of Virginia, SUA) urmată de {{27} }h digestie cu tripsină de gradul de secvențiere (Promega, Fitchburg, WI, SUA) la 37 ◦C. Probele au fost desarate prin C18 Sep-Paks și proteinele au fost cuantificate [44]. Un total de 1,0 ug de proteină per probă a fost analizat prin cromatografie lichidă-spectrometrie de masă în tandem (LC-MS [2]) folosind un gradient de cromatografie lichidă de 85 min pe un Easy-nLC 1000 (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, SUA) conectat în linie la un spectrometru de masă Orbitrap Fusion (Thermo Fischer Scientific).

Cromatografia a fost efectuată pe o coloană de 30 cm, împachetată și împachetată de acasă, a fost triplută cu 0,5 cm, 0,5 cm și 30 cm de 5 µm C4, 3 µm C18, respectiv 1,8 µm C18 și încălzit la 60 °C. Peptidele au fost mai întâi încărcate la 500 bar, care a fost urmată de un gradient de cromatografie variind de la 6 la 25% acetonitril timp de 70 de minute, urmat de un gradient de 5-min până la 100% acetonitril, care a fost menținut timp de 10 minute. Ionizarea prin electrospray a fost realizată prin aplicarea de 2000 V printr-o joncțiune T din oțel inoxidabil care conectează coloana analitică și sistemul Easy-nLC. Fiecare probă a fost urmată de două spălări, începând cu un gradient de la 3 la 100% acetonitril timp de 15 minute cu încă 10 minute la 100% acetonitril. Un interval de masă la încărcare (m/z) de 375-1500 a fost scanat pentru peptide cu stări de încărcare între 2-6. Datele centroide au fost utilizate pentru cuantificarea vârfurilor. Achiziția a fost efectuată într-un mod de ioni pozitivi dependent de date. Spectrele brute au fost căutate în Proteome Discoverer Versiunea 2.1 împotriva bazei de date de referință UniProt (www.uniprot.org (accesat la 5 noiembrie 2017)) pentru Homo sapiens folosind algoritmul Sequest [18], alături de o abordare inversă a bazei de date utilizată pentru a controla peptidele și descoperirile false. rate (FDR) la 1 la sută [17]. Digerarea in silico a tripsinei, așa cum este specificat în parametrii de căutare, alături de o lungime minimă a peptidei de șase aminoacizi. Setările de căutare au inclus, de asemenea, modificarea dinamică pentru oxidarea metioninelor și o modificare statică a carbamidometilării cisteinelor. Toleranța de masă a precursorului a fost setată la 50 ppm și toleranța de masă a fragmentului de 0,6 Da.

Pe lângă potrivirile spectrale și proteinele fiind limitate la<1% fdr,="" peptide="" matches="" were="" further="" screened="" to="" only="" include="" peptide="" spectral="" matches="" (psms)="" identified="" with="" high="" confidence.="" the="" summed="" abundance="" of="" the="" area="" under="" the="" curve="" of="" ms1="" peaks="" associated="" with="" psms="" was="" used="" to="" represent="" protein="" abundances.="" to="" help="" account="" for="" run-to-run="" variation="" in="" lc-ms2="" experiments,="" the="" raw="" protein="" abundances="" were="" next="" normalized="" by="" a="" two-step="" process.="" in="" the="" first="" step,="" protein="" abundances="" were="" divided="" by="" the="" average="" abundance="" of="" a="" given="" protein="" throughout="" the="" experiment="" divided="" by="" the="" median="" of="" the="" protein="" averages="" observed="" throughout="" the="" experiment.="" in="" the="" second="" step,="" the="" adjusted="" protein="" abundances="" were="" divided="" by="" the="" median="" protein="" abundances="" observed="" within="" their="" respective="" samples="" divided="" by="" the="" median="" protein="" abundance="" observed="" in="" the="" entire="" experiment.="" records="" of="" the="" normalization="" and="" analysis="" of="" proteomics="" data="" are="" available="" in="" a="" jupyter="" notebook="" form="" at="">

4.3. Analiza datelor de proteomică

Înregistrările analizei datelor proteomice au fost încărcate într-un format de notebook jupyter într-un depozit Github (accesat la 3 martie 2021)). Analiza coordonatelor de principiu (PCoA) a fost efectuată utilizând Qiime2 (versiunea 2019-7) [45]. Comanda core-metrics diversitatea timpului a fost utilizată pentru a calcula distanțe între eșantion, folosind metrica Bray-Curtis și vizualizarea folosind un PCoA. Analiza statistică a distanțelor dintre probele de control și V-AKI a fost efectuată folosind un test PERMANOVA în perechi prin comanda „qiime diversity beta-group signification”. O vizualizare boxplot a acestor rezultate a fost creată prin pachetul seaborn (accesat pe 3 martie 2021)). Comparațiile binare ale cazurilor V-AKI și subiecților de control au fost efectuate folosind pachetul scipy ((accesat la 3 martie 2021)) utilizând un test t independent cu varianță inegală. Puterea asocierii dintre fiecare proteină și starea V-AKI a fost clasificată utilizând metrica valorii pi care combină semnificația valorii p cu schimbarea de ori [12]. După cum s-a descris anterior [46], asocierile semnificative au fost definite ca având o valoare pi > |1|. Fiecare asociere de proteine ​​cu statutul V-AKI a fost reprezentată într-un grafic vulcan pentru a evidenția și mai mult locația proteinelor clasate în top-10. Analiza de îmbogățire a setului de gene a fost efectuată folosind serverul DAVID [47], comparând proteine ​​semnificative (valoarea pi > |1|) cu un fundal al tuturor proteinelor identificate în setul de date. Clusterele de îmbogățiri funcționale aferente sunt raportate în tabelul suplimentar S1.

To test for a relationship between V-AKI-associated proteins and inflflammatory cytokines, a recently developed network-based cytokine inference approach was utilized [48]. Briefly, a list of cytokines (TGFb, TNF, IFN, IL1-40, CXCL1-16, CCL1-27) was submitted alongside signifificantly altered proteins (pi-value > |1|) to the STRING-db tool [49]. Connections between proteins were determined using all interaction sources and a minimum interaction score >0.4. Citokinele au fost mai întâi filtrate pentru a avea cel puțin cinci conexiuni cu proteinele modificate semnificativ. Apoi, proporția de conexiuni dintre fiecare citokină și proteinele asociate cu V-AKI sau asociate cu controlul a fost comparată cu numărul total de conexiuni dintre proteinele V-AKI sau asociate cu controlul. Pentru a lua în considerare diferențele în numărul de conexiuni pe care le are fiecare citokină la alte proteine, această valoare a fost apoi comparată cu numărul de conexiuni pe care fiecare citokină le-a avut la toate proteinele modificate semnificativ. Scorurile de îmbogățire pentru citokinele selectate au fost reprezentate grafic pentru asocierile lor cu proteinele asociate fie cu V-AKI, fie cu proteinele de control. În cele din urmă, o căutare rafinată a proteinelor asociate V-AKI și a citokinelor cu conexiuni îmbogățite la proteinele asociate V-AKI au fost vizualizate pentru interacțiunile lor folosind Cytoscape versiunea 3.5.1 [50]. Rețelele de interacțiune proteină-proteină au fost decorate prin dimensionarea fiecărei proteine ​​​​asociate V-AKI în funcție de asocierea lor pi-score cu statutul V-AKI și colorate prin existența unei conexiuni deduse la citokinele îmbogățite cu efecte pro sau anti-inflamatorii.

ierburi de dragon cistanchepoate trataleziuni renale

5. Concluzii

Am căutat să înțelegem mai bine mecanismul leziunii pentru V-AKI din cazurile adjudecate clinic și, în mod interesant, am descoperit că complementul, proteina care leagă galectina-3 și fibrinogenul au fost asociate semnificativ cu V-AKI. Rezultatele studiilor anterioare și ale noastre sugerează un rol al sistemului complement și al căilor inflamatorii în V-AKI. Deși sunt necesare studii mai ample pentru a valida procesele moleculare în deteriorarea indusă de vancomicină și căile de reparare care rezultă, rezultatele indică faptul că exozomii urinari pot contribui cu informații importante asupra mecanismelor patofiziologice și pot servi ca biomarkeri pentru medicamentele induse.rinichirănire.

Contribuții ale autorului:

Conceptualizare, LA și SPR, metodologie, SV, SPR, DJG, RM; software, DJG, RHM, analiză formală, LA, AL, RHM; anchetă, AL, JA, VJ, SB, MC-T., PN; redactare—pregătirea proiectului original, AL, JA, VJ, LA; scris—revizuire și editare, RHM, DJG, MC-T., AT, AA, JC, MSJ, EM, RM, PN; supraveghere, SV, SPR; administrarea proiectelor, LA; achiziție de finanțare, LA Toți autorii au citit și au fost de acord cu versiunea publicată a manuscrisului.

Finanțarea:

Această cercetare a fost finanțată de Consorțiul internațional pentru evenimente adverse grave. MCT a fost susținut de T32 Training Grant DK007202.

Declarația Comitetului de revizuire instituțională: Studiul a fost realizat în conformitate cu liniile directoare ale declarației de la Helsinki și aprobat de Consiliul de examinare instituțional (sau Comitetul de etică) de la Universitatea din California, Programul de protecție a cercetării subiecților umani din San Diego (IRB#121651).

Declarație de consimțământ informat: a fost obținut consimțământul informat de la toți subiecții implicați în studiu

Mulțumiri:

Dorim să mulțumim contribuțiile anchetatorilor DIRECT: Dinna Cruz, Stuart Goldstein, Patrick Murray, Andrew Davenport, Andrew Lewington, DavidSelewski, Michael Zappitelli, Marlies Ostermann, Li Yang, Bhavna Pandya, Patrick Brophy, DanielaPonce, Julia Steinke, Josee Bouchard, Carlos Irarrazabal, David Askenazi, Nitin Kolhe, RolandoClaure-Del Granado, Nadine Benador, Clare Castledine, Jonathan Barratt, Sunil Bhandari, AlyssaRiley, Ayse Akcan-Arikan, TK Davis, Christopher Farmer, Mark Thomas, Fred Pang, Kar Hui Ng , Hansjoerg Rothe.

Conflicte de interes:

Autorii nu declară niciun conflict de interese.

Din: „Exozomii urinari identifică căile inflamatorii în leziunea renală acută asociată cu vancomicină” de Linda Awdishu

---Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 2784