pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com

Identificarea și verificarea proteinei de adeziune celulară vasculară 1 ca o genă legată de imunitate asociată cu leziunea tubulointerstițială în boala renală diabetică

Yan Jia și colab

ABSTRACT

Boală renală diabetică(DKD) este cauza principală aboală cronică de rinichi(CKD) și boala renală în stadiu terminal (IRST), dar patogeneza nu este complet înțeleasă. Leziunea tubulointerstițială joacă un rol critic în dezvoltarea și progresia DKD(boli renale diabetice). Prezentul studiu și-a propus să investigheze profilul infiltrării celulelor imune tubulointerstițiale și să dezvăluie mecanismele de bază dintre leziunea celulelor tubulare și inflamația interstițială în DKD.(boli renale diabetice)folosind strategii bioinformatice. În primul rând, analiza xCell a identificat celulele imune care prezintă modificări semnificative în DKD(boli renale diabetice)tubulointerstitium, inclusiv celule T CD4 plus reglate, celule Th2, celule T CD8 plus, macrofage M1, celule dendritice activate (DC) și DC convenționale, precum și Treg reglate în jos. În al doilea rând, piroptoza a fost identificată ca principală formă de moarte celulară în comparație cu alte forme de moarte celulară programată. Proteina 1 de adeziune a celulelor vasculare (VCAM1) a fost identificată ca gena hub de top. Analiza de corelație a arătat că VCAM1 a fost semnificativ corelat pozitiv cu piroptoza și celulele imune infiltrate în tubulointerstitium. Supreglarea VCAM1 în tubulointerstitiul DKD a fost verificată în continuare în cohorta European Renal cDNA Bank și s-a observat că se corelează negativ cu rata de filtrare glomerulară (GFR). Studiul nostru in vitro a validat creșterea expresiei VCAM1 în celulele HK-2 în condiții de diabet, iar inhibarea piroptozei de către disulfiram a scăzut expresia VCAM1, eliberarea de citokine inflamatorii și fibroza. În concluzie, studiul nostru a identificat expresia VCAM1 reglată în sus în celulele tubulare renale, care ar putea interacționa cu celulele imune infiltrate, promovând astfel fibroza. Medicamentul disulfiram aprobat de FDA ar putea îmbunătăți fibroza în DKD(boli renale diabetice)prin țintirea piroptozei tubulare și a expresiei VCAM1.

CUVINTE CHEIE:DKD; tubulointerstițiu; celule imunitare; piroptoza; VCAM1; disulfiram

Cistanche poate trataBoală renală diabetică

Faceți clic pe Cistanche pentru boală de rinichi

Introducere

Boală renală diabetică(DKD), una dintre complicațiile frecvente ale diabetului, este cauza principală a bolii renale cronice (IRC) și a bolii renale în stadiu terminal (IRST) în multe țări dezvoltate și în curs de dezvoltare [1,2]. Potrivit unui raport de la China Kidney Disease Network (CK NET), DKD(boli renale diabetice)reprezintă 26,70 la sută din toate cazurile de CKD și impune o povară medicală și economică mare [2]. Patogenia DKD este complexă și implică o multitudine de căi diferite. Clarificarea caracteristicilor patologice și a patogenezei DKD va ajuta la îmbunătățirea managementului clinic și la identificarea de noi ținte terapeutice.

Deși afectarea glomerulară este principala caracteristică patologică a DKD(boli renale diabetice), dovezi tot mai mari au dezvăluit recent că patologia tubulointerstițială [3,4], cum ar fi atrofia tubulară, fibroza interstițială și celulele imune interstițiale infiltrante, joacă un rol critic în dezvoltarea și progresia DKD.(boli renale diabetice)[5–7]. Analiza bioinformatică reprezintă o metodă eficientă de procesare a cantităților mari de date într-un timp extrem de scurt și oferă informații valoroase despre boală. Cu toate acestea, studiile de bioinformatică care investighează expresia genelor tubulointerstițiale și infiltrarea celulelor imune în DKD sunt relativ rare.

Scopul studiului a fost de a descrie caracteristicile DKD(boli renale diabetice)infiltrarea celulelor imune tubulointerstițiale și pentru a identifica unele gene imune și inflamatorii cheie pentru a oferi noi perspective asupra patogenezei și terapiei DKD. În primul rând, un set de date microarray tubulointerstițial al DKD(boli renale diabetice)a fost descărcat din baza de date Gene Expression Omnibus (GEO). Folosind xCell [8], un instrument bazat pe web care efectuează o analiză de îmbogățire a tipului de celule a datelor despre expresia genelor pentru 64 de tipuri de celule imune și stromale, am investigat mai întâi diferențele în infiltrarea celulelor imune între țesuturile renale de la indivizi cu DKD.(boli renale diabetice)și controale normale. În al doilea rând, a fost verificată o listă de gene exprimate diferențial (DEG) legate de imun, printre care gena de top, proteina de adeziune a celulelor vasculare 1 (VCAM1), a fost identificată ca o genă hub imun în DKD.(boli renale diabetice). Apoi, seturi de gene asociate cu diferite forme de moarte celulară au fost obținute din GeneCards, iar piroptoza a fost evaluată ca formă principală de moarte celulară folosind analize de variație a setului de gene (GSVA) ​​și analiza de îmbogățire a setului de gene (GSEA). Mai mult, o analiză de corelare a arătat că VCAM1 a fost corelat pozitiv cu infiltrarea celulelor imune tubulointerstițiale și piroptoza. Expresia reglată în sus a VCAM1 în tubulointerstitium DKD a fost verificată în continuare în cohorta European Renal cDNA Bank (ERCB) și s-a observat că se corelează negativ cu funcția renală la pacienții cu DKD. Un studiu in vitro a validat creșterea expresiei VCAM1 în celulele HK-2 cultivate în condiții diabetice, iar inhibarea piroptozei de către medicamentul aprobat de FDA disulfiram a scăzut expresia VCAM1, eliberarea de citokine inflamatorii și fibroza. Prin urmare, piroptoza tubulară și expresia VCAM1 reglată în sus ar putea fi ținte pentru imunoterapia DKD.

Metode

Date microarray

Setul de date despre expresia genelor umane GSE30529 a fost descărcat de la Centrul Național pentru Informații Biotehnologice (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO, baza de date. GSE30529 (GPL571 [HG U133A_2] Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array) ) a constat din 10 DKD(boli renale diabetice)probe tubulare și 12 probe martor

Procesarea datelor

Datele brute din setul de date GSE30529 au fost descărcate și procesate folosind pachetul Limma și, respectiv, pachetul Oligo [9,10]. Procesarea datelor a inclus corecția de fundal, normalizarea și calculul expresiilor. Când mai multe sonde au fost mapate la un simbol al unei gene, nivelul mediu de expresie al sondelor a fost calculat și considerat ca nivelul de expresie a genei respectivei gene. Sondele care nu s-au mapat la gene au fost îndepărtate.

Cistanche poate trataBoală renală diabetică

Analiza celulelor imune și stromale

Am aplicat o nouă metodă bazată pe semnătura genei, xCell [8], pentru a estima scorul de îmbogățire a tipului de celule și pentru a determina profilul celulelor imune infiltrante în tubulointerstitiul pacienților cu DKD.(boli renale diabetice). xCell este o metodă pentru analiza de îmbogățire a tipurilor de celule folosind analiza de îmbogățire a setului de gene cu un singur eșantion (ssGSEA) care calculează scorurile de îmbogățire pentru 64 de tipuri de celule, inclusiv 34 de tipuri de celule imune, 30 de tipuri de celule stromale și alte celule. Depășește alte analize in silico (inclusiv CIBERSORT), cuprinzând mai multe tipuri de celule imunitare și utilizând o tehnică de compensare a deversării pentru a reduce dependențele dintre tipurile de celule strâns legate. Cele 34 de tipuri de celule imune au fost clasificate în nouă grupuri, inclusiv subpopulații de celule CD4 plus T, subpopulații de celule CD8 plus T, celule T gamma delta (celule T δ), celule NK, celule NKT, subpopulații de celule B, subpopulații de monocite/macrofage, subpopulații de celule dendritice (DC) și subpopulații de granulocite.

Analize de îmbogățire a setului de gene (GSEA) și analize de variație a setului de gene (GSVA)

Folosind seturile de gene distinctive ca set de gene de referință, am efectuat analize de variație a setului de gene (GSVA) ​​între DKD(boli renale diabetice) and control tissues using the GSVA Bioconductor package [11]. The thresholds were set to enrichment score change > 1.0, p-value < 0.05 and t value >2. Au fost identificate atât căile reglate în sus, cât și cele subreglate. GSEA a fost realizat cu aplicația desktop GSEA [12] și o rată de descoperire falsă (FDR)<0.25 and="" p-value=""><0.05 were="" set="" as="" the="">

Construirea de seturi de gene reprezentând diferite forme de moarte celulară și analiză de îmbogățire

Seturi de gene reprezentând diferite forme de moarte celulară au fost construite prin căutarea cuvintelor cheie „piroptoză”, „necroză”, „necroptoză”, „apoptoză”, „ferroptoză” și „autofagie” în baza de date GeneCards (https://www.genecards). .org/). Genele care nu codifică proteine ​​au fost îndepărtate. Seturile de gene sunt enumerate în Tabelul S2. Apoi, setul de gene GSEA a fost efectuat folosind aplicația desktop GSEA pentru a evalua forma de moarte celulară în tubulointerstitium. Am efectuat analizele de corelație ale lui Pearson pentru a explora relația dintre căile pivotale de moarte a celulelor și celulele imune infiltrate în tubulointerstitiu

Analiza DEG-urilor și screening-ul genelor hub imun

DEG între pacienții cu DKD(boli renale diabetice)și controale sănătoase au fost identificate folosind pachetul „Limma” [13] din software-ul R. O valoare P ajustată<0.05 and="" log="" fold="" change="" (fc)="" ≥="" 1="" were="" set="" as="" the="" thresholds.="" a="" list="" of="" 1793="" immune-related="" genes="" was="" down-loaded="" from="" immport="" shared="" data="" (https://www.="" immport.org/shared/genelists),="" and="" shared="" genes="" from="" the="" two="" datasets="" (degs="" and="" immunerelevant="" gene="" list)="" were="" determined="" by="" constructing="" a="" venn="" diagram="" to="" identify="" immune-related="" hub="" genes.="" an="" analysis="" of="" the="" functional="" interactions="" between="" proteins="" might="" provide="" insights="" into="" the="" mechanisms="" of="" dkd="">(boli renale diabetice). În studiul de față, rețelele de interacțiune proteină-proteină (PPI) a nouăzeci și patru de gene partajate au fost generate utilizând baza de date STRING (https://string-db.org/) și vizualizate cu software-ul Cytoscape (versiunea 3.7.1, http ://www.cytoscape.org/). Un scor de interacțiune mai mare de 0,4 (încredere medie) a fost considerat semnificativ statistic. CytoHubba, un plugin Cytoscape, a fost utilizat pentru a explora genele hub-ului rețelei PPI [14]. Printre acestea, VCAM1 a fost gena de top. Analizele de îmbogățire a celor treizeci de gene hub imun identificate mai sus au fost efectuate folosind instrumentul online Metascape [15]. În plus, modulele dominante din rețeaua PPI au fost identificate folosind pluginul MCODE (versiunea 1.4.2, http://apps.cytoscape.org/apps/ MCODE) în software-ul Cytoscape.

Verificarea VCAM1 și analiza corelației cu funcția renală

Expresia diferențială a VCAM1 în tubulointerstitiul pacienților cu DKD(boli renale diabetice)a fost validat în cohorta ERCB (31 de martori sănătoși și 17 pacienți cu DKD). Apoi, am folosit baza de date online Nephroseq v5 (http://v5.nephroseq.org), o platformă integrată de extragere a datelor pentru seturile de date privind expresia genelor afecțiunilor renale, pentru a valida corelația dintre expresia VCAM1 și trăsăturile clinice ale pacienților cu DKD folosind Analiza corelației lui Pearson în ERCB. O valoare p a<0.05 was="" considered="" statistically="">

Colorarea prin imunofluorescență pentru VCAM1

Secțiuni de rinichi cu parafină de la un pacient diagnosticat clinicopatologic cu DKD(boli renale diabetice)au fost colorate cu VCAM1. Acest lucru a fost aprobat de Comitetul de etică a cercetării al Primului Spital Universitar din Peking (NR. 20171280). Legarea nespecifică a fost blocată cu 3% BSA după fixare și tratament termic pentru recuperarea antigenului. Secțiunile de rinichi au fost apoi incubate cu un anticorp primar împotriva VCAM1 (Abcam, ab134047, 1:200) peste noapte la 4 grade. Anticorpul secundar marcat Cy3-a fost obținut de la Jackson ImmunoResearch. Țesutul renal adiacent tumorii din probele de nefrectomie a fost utilizat ca martor normal. Imaginile reprezentative au fost capturate folosind o cameră Leica DFC 7000 T prin intermediul software-ului Leica Application Suite V4.7.1.

Cultură de celule

Celulele de rinichi uman 2 (HK-2), o linie de celule epiteliale tubulare proximale ale rinichiului uman, au fost cultivate în DMEM (11885084, Gibco, SUA) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (10099141 C, Gibco, SUA) și 1% penicilină/streptomicina (10378016, Gibco, SUA) la 37 de grade cu 5% CO2. Glucoza ridicată (30 mM D-glucoză, G8644, Sigma) [16] și TNF (40 ng/ml, 300–01A, PeproTech) [17] au fost utilizate pentru a induce leziuni ale celulelor HK-2 in vitro. Disulfiram (DSL, 0,3 μM [18,19], NSC190940, Selleck), un inhibitor de formare a porilor, a fost adăugat cu 3 ore înainte de inducerea leziunii celulelor HK-2.

Western blot

Proteina totală a fost extrasă din celulele HK{{0}} utilizând tampon RIPA (Sigma, R0278), iar concentrația de proteine ​​a fost determinată folosind un kit Pierce BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, 23227). În continuare, proteinele denaturate au fost separate prin electroforeză pe gel de dodecil sulfat-poliacrilamidă de sodiu (SDS-PAGE) și apoi transferate electric pe membrane de difluorură de poliviniliden (Millipore, IPVH00010). Membranele au fost blocate timp de 60 de minute cu lapte fără grăsimi 5% dizolvat în soluție salină tamponată Tris care conține 0,1% Tween 20 (TBST). Petele au fost incubate cu următorii anticorpi primari relevanți peste noapte la 4 grade: GSDMD (Abcam, ab209845, 1:1000), VCAM1 (Abcam, ab134047, 1:2000) și tubulină (ZSBio, TA{20}}, 1). :5000). Incubarea cu o diluție 1:1000 a anticorpului secundar conjugat cu HRP a fost efectuată timp de 1 oră la temperatura camerei. După cinci spălări cu TBST, membranele au fost incubate cu substratul de chemiluminiscență (Millipore, WBKLS0100) timp de 5 minute și imaginile au fost capturate folosind un sistem Image Quant LAS 4000 Mini (GE Healthcare). Analiza semicantitativă a fost efectuată folosind software-ul ImageJ (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).

Izolarea ARN și analiza RT-PCR

ARN-ul total a fost extras din celule HK-2 folosind un kit ARNsimple Total ARN (Tiangen, DP419) conform instrucțiunilor producătorului și transcris invers în cADN-uri folosind un kit FastKing RT (Tiangen, KR116). PCR cantitativă a fost efectuată utilizând un sistem StepOne Real-Time PCR (Applied Biosystems, SUA) cu metode în două etape. Secvențele primerilor utilizați sunt prezentate în Tabelul S4. Expresia comparativă a genei a fost calculată utilizând metoda 2-ΔΔCt așa cum s-a descris anterior.

analize statistice

Pentru analizele statistice a fost folosit software-ul GraphPad Prism 6.0, iar datele sunt prezentate ca medie ± SEM. Un test t nepereche cu două cozi a fost aplicat pentru comparații între două grupuri. Diferențele la nivelul P < 0.05="" au="" fost="" considerate="" semnificative="">

Cistanche poate trataBoală renală diabetică

Rezultate

Dovezile acumulate au dezvăluit recent că patologia tubulointerstițială joacă un rol critic în dezvoltarea și progresia DKD.(boli renale diabetice). Scopul studiului a fost de a descrie caracteristicile DKD(boli renale diabetice)infiltrarea celulelor imune tubulointerstițiale și pentru a identifica unele gene imune și inflamatorii cheie pentru a oferi noi perspective asupra patogenezei și terapiei DKD. În acest studiu, am investigat profilul infiltrării celulelor imune tubulointerstițiale și am identificat piroptoza ca principală formă de moarte celulară programată în DKD.(boli renale diabetice)folosind analiza bioinformatică. VCAM1 a fost identificat ca gena hub legată de imunul de top și a fost corelată pozitiv cu piroptoza și celulele imune infiltrate. În plus, expresia VCAM1 a fost validată pentru a fi crescută în celulele tubulare renale cultivate în condiții de diabet. Medicamentul disulfiram aprobat de FDA a inhibat piroptoza celulelor tubulare renale și a scăzut expresia VCAM1, nivelurile de citokine inflamatorii și fibroza in vitro.

1. Fluxuri de lucru de analiză bioinformatică

Principalii pași ai fluxului de lucru sunt prezentați în Figura 1. Am evaluat mai întâi infiltrarea celulelor imune în țesuturile tubulointerstițiale de la pacienții cu DKD.(boli renale diabetice). Apoi, piroptoza, principala formă de moarte celulară în tubulointerstitium, a fost descoperită folosind GSEA și GSVA. Apoi, am analizat o listă de gene strâns legate de infiltrarea celulelor imune și am identificat genele hub. A fost efectuată o analiză de corelație între celulele imune infiltrate, piroptoză și gena hub superior VCAM1. În plus, au fost efectuate validarea clinică și validarea imunocolorării a VCAM1. În cele din urmă, am efectuat în continuare un studiu in vitro pentru a valida rezultatele analizei bioinformatice.

2. Analize deconvoluția celulelor imune și stromale

Am folosit xCell, care generează scoruri de îmbogățire a tipului de celule utilizând date de exprimare a genelor în vrac, pentru a determina tipurile de celule potențial implicate în leziuni tubulointerstițiale înboala de rinichi diabetic. Scorurile de îmbogățire a 64 de tipuri de celule, inclusiv 34 de tipuri de celule imune și 30 de tipuri de celule stromale și alte celule, au fost obținute pentru fiecare probă (Figura 2 (a)). Harta termică a 34 de scoruri de îmbogățire a celulelor imune a fost ilustrată pentru a identifica peisajul imunitar al DKD(boli renale diabetice)tubulointerstitium (Figura 2(b)). Comparativ cu controalele normale, majoritatea scorurilor de îmbogățire a celulelor T au fost relativ mai mari la pacienții cu DKD(boli renale diabetice), cu excepția celulelor CD4 plus Tcm, Tregs, Th1, CD8 plus celule T naive și celule NKT. Scorurile de îmbogățire ale aDC și cDC au fost mai mari la pacienții cu DKD(boli renale diabetice)decât la martori, în timp ce scorurile de îmbogățire a celulelor Pro-B au fost mai mici la pacienții cu DKD. Scorurile de îmbogățire ale celor mai multe subseturi de monocite/macrofage și granulocite nu au fost semnificativ diferite între DKD(boli renale diabetice)și țesuturi normale, cu excepția macrofagelor și neutrofilelor M1 și a eozinofilelor (Tabelul 1).

Figura 2. Analiza infiltrației celulelor imune prin xCell în tubulointerstitiul DKD(boli renale diabetice). (a) Comparație a scorurilor celulare a 64 de tipuri de celule din tubulointerstitium între DKD și țesutul renal de control din setul de date GSE30529. (b) Peisajul celular al micromediului imunitar în DKD(boli renale diabetice). Harta termică reprezintă scorul de îmbogățire a tipului de celulă al fiecărui tip de celulă imună pentru toate probele. DC, celulă dendritică; Tcm, celula T cu memorie centrală; Tem, celula T cu memorie eficientă; Celula T 5, celula T gamma delta.

3. GSVA și GSEA ale seturilor de gene distinctive

Am efectuat GSVA și GSEA ale setului de gene distinctive în setul de date GSE30529 pentru a explora procesele biologice din DKD(boli renale diabetice)tubulointerstitiu. Căile de semnalizare „răspunsul interferon-alfa”, „răspunsul interferon-gamma” și „complement” au fost activate semnificativ în patogeneza leziunii tubulointerstițiale la pacienții cu DKD (Figura 3(a)) și este afișat un rezumat al rezultatelor GSVA în tabelul S1. Apoi, am efectuat GSEA a celor trei seturi de gene și am constatat că acestea au fost îmbogățite pozitiv în setul de date. Scorurile de îmbogățire normalizate (NESs) au fost 1,89, 1,89 și 1,7{{10}}, cu valori p normalizate (valori p NOM) de 0.000, 0,002 și 0,019, respectiv (Figura 3(bd)). Toate căile semnificativ îmbogățite identificate folosind GSEA sunt prezentate în Tabelul 2. Aceste date sugerează că răspunsul imun tubulointerstițial joacă un rol important în patogeneza DKD.(boli renale diabetice).

4. GSEA și GSVA de seturi de gene asociate cu diferite forme de moarte celulară

Moartea celulară include piroptoza, necroza, necroptoza, apoptoza, ferroptoza și autofagia, care au mecanisme fiziopatologice și căi de semnalizare diferite. S-a raportat că diferite forme de moarte celulară programată sunt asociate cu răspunsuri inflamatorii și imune. Am construit seturi de gene de mai multe tipuri de moarte celulară din GeneCards (Tabelul S2) și apoi am efectuat atât GSEA, cât și GSVA pentru a explora implicarea morții celulare în inflamația tubulointerstițială la pacienții cu DKD.(boli renale diabetice). GSEA a arătat că numai seturile de gene de piroptoză au fost semnificativ îmbogățite la pacienții cu DKD(boli renale diabetice)comparativ cu controalele normale (NES=1.65, FDR q valoare=0.023, FWER=0.013) (Figura 3(e)). Între timp, scorul GSVA pentru piroptoză a fost cel mai mare dintre toate diferitele tipuri de moarte celulară analizate (Tabelul S3). Pe baza acestui rezultat, piroptoza ar putea juca un rol în patogeneza leziunilor tubulointerstițiale la pacienții cu DKD.(boli renale diabetice).

Figura 3. Analize de îmbogățire a setului de gene (GSEA) și analize de variație a setului de gene (GSVA). (a) Graficul cu bare a rezultatelor GSVA a 50 de seturi de gene distinctive. (b)-(d) Rezultatele GSEA ale „Răspunsului interferon-alfa Hallmark_, „Răspunsului interferon-gamma Hallmark_ și „complementului Hallmark”. (e) rezultatul GSEA al piroptozei.

5. Corelația dintre scorurile de îmbogățire a piroptozei și infiltrarea celulelor imune

Scorurile de îmbogățire GSVA pentru piroptoză au fost corelate cu proporția de infiltrare a celulelor imune prin efectuarea analizei de corelație a lui Pearson pentru a evalua corelația dintre piroptoză și infiltrarea celulelor imune. Am observat o corelație semnificativă între 15 tipuri de celule imune și piroptoză (Figura 4), sugerând o interacțiune strânsă între celulele imune și piroptoză.

6. Descoperirea genelor de bază

Analiza expresiei diferențiale a fost efectuată pentru a explora în continuare relația dintre celulele tubulare renale și celulele imune interstițiale. Patru sute opt DEG au fost identificate între DKD(boli renale diabetice)grup și grupul de control, dintre care 65 au fost reglați în jos și 343 au fost reglați în sus (Figura 5). O listă de gene legate de imun a fost descărcată pentru a identifica DEG-uri legate de imun și nouăzeci și patru de gene imune hub au fost achiziționate din două seturi de date (DEG și lista de gene legate de imun) printr-o diagramă Venn (Figura 6 (a)). Analiza PPI a acestor nouăzeci și patru de gene imune hub a dezvăluit 97 de noduri și 694 de interacțiuni (Figura S1). Primele 30 de noduri calculate de algoritmul MCC au fost identificate ca gene hub (Figura 6(b) și Tabelul 3). Apoi, a fost efectuată o analiză de îmbogățire a genelor hub. „Respingerea alogrefei”, „răspunsul interferon-gamma”, „răspunsul inflamator”, „răspunsul interferon-alfa”, „tranziția epitelial-mezenchimală” și „complementul” au fost elementele cele mai îmbogățite în analiza caracteristicilor. „Artrita reumatoidă”, „interacțiunea receptorilor de citokine”, „Cale de semnalizare a receptorilor de tip Toll”, „pertussis” și „calea de semnalizare NF-kappa B” au fost termenii KEGG cei mai îmbogățiți. „Răspunsul celular interferon gamma”, „activitatea chemokinei”, „aderența celulelor leucocite-celulă” și „reglarea producției de citokine” au fost termenii GO cei mai îmbogățiți (Figura 6 (c)). În plus, sistemul de notare MCODE a identificat două grupuri cu un scor mai mare sau egal cu 5. PTRPC, TRIM22, PSMB8, KNG1 și CXCL6 au fost noduri hub cu grade de noduri mai mari în modulul 1 (Figura 6 (d)) și CD1C, EGF, FCER1G, CD3D și CD48 au fost noduri hub în modulul 2 (Figura 6 (e)).

7. Corelația dintre expresia VCAM1 și celulele imune infiltrate

Printre genele hub identificate, gena de top, VCAM1, a fost identificată ca o genă hub imun în DKD(boli renale diabetice). Expresia VCAM1 a fost semnificativ crescută la pacienții cu DKD(boli renale diabetice)(Figura 7 (a)). Analiza corelației a arătat că expresia VCAM1 a fost corelată pozitiv cu celulele CD4 plus T (r=0.6877, P=0.0004), CD4 plus celule de memorie T (r=0,7102, P=0,0002), celule Th2 (r=0,7358, P <0,0001), cd8="" plus="" tcm="" (r="" {{18="" }}.6026,="" p="0.0030)," celule="" t="" δ="" (r="0.5864," p="0.0041)," celule="" nk="" (r="0.5692," p="0,0057)," macrofage="" (r="0,5068," p="0,0161)," macrofagi="" m1="" (r="0,4441," p="0" .0384),="" adc-uri="" (r="0.4814," p="0.0233)" și="" cdc="" (r="0.6562," p="0.0009)," dar="" corelate="" negativ="" cu="" naive="" cd8="" plus="" celule="" t="" (r="-0,4909," p="0,0204)" și="" celule="" nkt="" (r="-0,5548," p="0,0074)" (figura="" 7(b)="">

8. Corelația dintre expresia VCAM1 și piroptoză

Analiza corelației lui Pearson a fost efectuată pentru a explora dacă expresia VCAM1 reglată în sus în tubulointerstitiul pacienților cu DKD(boli renale diabetice)este legată de piroptoză. Expresia VCAM1 a fost strâns legată de piroptoză (r=0.6118, P=0.0025) (Figura 7 (c)), indicând că piroptoza ar putea induce expresia VCAM1.

9. Verificarea, relevanța clinică și validarea prin imunofluorescență a expresiei VCAM1

Am efectuat o analiză relevantă a pacienților cu DKD(boli renale diabetice)de la ERCB pentru a valida modificarea expresiei VCAM1 în DKD(boli renale diabetice)tubulointerstitiu. În mod constant, nivelurile de ARNm VCAM1 au fost semnificativ mai mari la pacienții cu DKD(boli renale diabetice)(Figura 8(a)). Expresia VCAM1 a fost corelată negativ cu rata de filtrare glomerulară (RFG) (r=- 0.5920, P=0.0123) (Figura 8(b)) și corelată pozitiv cu serul nivelurile creatininei (r=0.5189, P=0.0328) (Figura 8(c)). În plus, am efectuat colorarea prin imunofluorescență pentru VCAM1 în țesutul renal al unui pacient cu DKD.(boli renale diabetice)și a constatat că expresia VCAM1 tubulară renală a fost semnificativ upregulată în comparație cu cea din rinichii normali (Figura 8 (d)).

10. DSL a inhibat piroptoza celulelor HK-2 indusă de HG, expresia VCAM1 și inflamația

Am expus celulele HK-2 cultivate la glucoză ridicată (HG) și TNF- timp de 48 de ore pentru a determina în continuare relația dintre piroptoza celulelor tubulare, expresia VCAM1 și răspunsul imun tubulointerstițial la persoanele cu DKD.(boli renale diabetice). Deoarece miezul piroptozei celulare este formarea porilor membranei indusă de GSDMD scindat, am detectat nivelurile domeniului N-terminal GSDMD (GSDMD-NT) și VCAM1 utilizând western blot. Atât HG, cât și TNF-au indus o creștere semnificativă a nivelului GSDMD-NT, indicând apariția piroptozei mediate de GSDMD (Figura 9 (a)). Expresia VCAM1 a fost crescută semnificativ statistic în grupurile HG și TNF- (Figura 9 (b)). Disulfiram (DSL) este un inhibitor eficient al formării porilor GSDMD [18]. Pretratamentul cu DSL a atenuat creșterea nivelurilor GSDMD-NT, indicând faptul că piroptoza celulară a fost suprimată. Între timp, expresia VCAM1 a fost scăzută în grupurile HG și TNF pretratate cu DSL (Figura 9 (ab)). Apoi, profilul citokinei inflamatorii a fost determinat folosind qPCR. Rezultatele au arătat că nivelurile suprareglate ale ARNm MCP-1, IL{-1 și IL{-18 induse de HG au scăzut semnificativ după pretratamentul DSL. În grupul TNF, nivelul IL-1 a scăzut semnificativ în grupul pretratat cu DSL, iar nivelurile MCP{-1 și IL{-18 nu s-au schimbat semnificativ. Nu s-au găsit modificări semnificative ale nivelurilor IL-6 și IL{-8 ARNm în niciun grup. Important este că nivelurile de ARNm TGF- 1 au fost, de asemenea, scăzute în grupurile DSL pretratate. Astfel, celulele tubulare piroptotice au crescut expresia VCAM1 în condiții de diabet, iar un tratament care abrogă piroptoza a inhibat expresia, inflamația și fibroza VCAM1 în celulele HK-2.

Cistanche poate trataBoală renală diabetică

Click aici pentru partea a II-a

Din: „Identificarea și verificarea proteinei de adeziune a celulelor vasculare 1 ca genă hub legată de imunitate asociată cu leziunea tubulointerstițială în boala renală diabetică” de Yan Jia și colab.

---BIOENGINEERED 2021, VOL. 12, NR. 1, 6655–6673