Activitatea xantinei oxidoreductazei în plasma săracă în trombocite și bogată ca indicator al stresului oxidativ la pacienții care necesită terapie de substituție renală

Fundal abstract: Xantin oxidoreductaza(XOR) este o enzimă hidroxilază implicată în metabolismul purinelor. Activitatea XOR poate varia: proteina homodimer poate fi transformată în două izoforme diferite XD (antioxidant) și XO (prooxidant). Stresul oxidativ și infamația care însoțescboală cronică de rinichi(CKD), dializa și transplantul de rinichi, au dus la activarea trombocitelor. Prezentul studiu și-a propus să determine influența terapiei de substituție renală aplicată asupra xantin-oxidoreductazei și activității izoforme ale acesteia.

Materiale și metode: Grupul de studiu a fost format din 117 pacienți, împărțiți în 4 grupuri: pacienți cu hemodializă - 30, pacienți cu dializă peritoneală - 30, pacienți cu transplant de rinichi - 27 și tratament conservator {{5} } pacienţi. Grupul de control a fost format din 30 de voluntari sănătoși. Rezultate: s-au găsit diferențe semnificative în activitatea XOR în plasma săracă în trombocite (PPP) în cadrul grupurilor studiate (p=0.001). A existat o relație între tipul de terapie de substituție renală a tuturor izoformelor de oxidoreductază din PPP (p<0.001 all isoforms) and XD (p=0.008), XO (p<0.001) in platelet-rich plasma (PRP). A relationship was observed between the activity of all oxidoreductase isoforms in PPP and PRP, the type of renal replacement therapy the duration of dialysis, and the age of patients. Thecauza bolii cronice de rinichis-a reflectat și în diferențele în activitatea XD și XO în PPP.

Concluzii: Tipul de terapie de substituție renală utilizată la pacienții cu IRC, vârsta pacienților, durata dializei, cauzele IRC și stadiul de progresie afectează semnificativ activitatea XOR și izoformele sale.

Cuvinte cheie: Xantin oxidoreductază, trombocite, terapie de substituție renală,Boala cronică de rinichi, Enzime antioxidante

CÂT TIMP TREBUIE PENTRU CISTANCHEA?

fundal

Xantin oxidoreductaza (XOR) este o enzimă hidroxilază implicată în metabolismul purinelor. Catalizează oxidarea hipoxantinei în xantină și a xantinei în acid uric (UA). Activitatea XOR poate varia: proteina homodimer poate fi convertită în două izoforme diferite. Xantin dehidrogenaza (XD) este exprimată predominant în țesutul sănătos, iar xantinoxidaza (XO) este generată prin modificarea XD post-translațională, reziduuri de cisteină de oxidare, precum și proteoliză limitată, jucând un rol dominant în celule și țesuturi în timpul leziunilor [1–3] ]. Activitățile izoformelor menționate se opun între ele [4]. XOR acționează în prezența NAD+ ca dehidrogenază și cu oxigenul molecular ca oxidază. Capacitatea XOR de a se transforma rapid de la antioxidant la oxidant, în diferite tipuri de leziuni tisulare, este un element esențial pentru un răspuns imun înnăscut rapid, benefic, de exemplu, în infecțiile bacteriene sau fungice [5].

Intermediarii de reacție ai xantin dehidrogenazei (XDO) și oxigenului pot reacționa atât cu NAD+, cât și cu O2, dar prezintă o afinitate mai mare pentru NAD+ [6]. Această izoformă intermediară nu a fost izolată, dar determinarea activității sale facilitează urmărirea transformării XD în XO [7].

Activitatea XOR seric în diferite boli a fost investigată pe scară largă. Motivul interesului pentru această enzimă este dualismul acțiunii sale: capacitatea de a produce antioxidanți și, pe de altă parte, crearea de specii reactive de oxigen. O creștere a activității XOR are loc în condiții patologice, cum ar fi hepatita virală, mononucleoza infecțioasă, bolile autoimune, pneumonia, schizofrenia și diabetul de tip II. Creșterea activității XOR se observă și în serul pacienților după transplant renal sau hepatic [8]. S-a demonstrat că gena care codifică XOR poate fi responsabilă de maturarea renală și adipogeneza rinichilor și poate preveni transformarea celulelor epiteliale în țesut mezenchimal [9]. Cu toate acestea, datorită celor mai bune cunoștințe ale noastre, nu există rapoarte publicate care să investigheze activitatea XOR în plasma săracă în trombocite (PPP) și plasma bogată în trombocite (PRP) la pacienții care urmează terapie de substituție renală. Importanța activității XOR în acest grup de pacienți este legată de creșterea activării trombocitelor, care este cauzată de stresul oxidativ și infamația care însoțesc boala renală cronică (IRC), dializa și transplantul de rinichi. În plus, în timpul dializei și transplantului de organe, țesuturile și vasele de sânge sunt deteriorate, iar trombocitele sunt primele celule care ajung la locul leziunii tisulare, participând activ la etapele inițiale ale procesului inflamator și de vindecare [10].

PRP și PPP sunt fracțiuni de plasmă sanguină cu concentrații diferite de trombocite. Conținutul de trombocite din PRP și PPP este trombocite/ml și, respectiv, trombocite/ml. PPP și PRP sunt obținute prin centrifugare și spălare în mod repetat a întregului sânge al oamenilor la viteze de centrifugare diferite [11, 12].

PPP, ca produs secundar de centrifugare al sângelui anticoagulat, are o concentrație de trombocite mai mică decât sângele normal. Principalele componente ale PPP sunt fibrinogenul, fibronectina și trombina. Efectele biologice ale PPP participă la hemostaza și coagularea, acționând ca un vector de atașare celulară și promovând mitoza fibroblastelor și a celulelor epiteliale [13]. Deși PPP nu este la fel de concentrat în trombocite precum PRP, s-a demonstrat că PPP poate susține și creșterea și supraviețuirea celulelor. PPP promovează funcțiile celulare asociate cu vindecarea rănilor și accelerează migrarea celulelor și proliferarea fibroblastelor [14, 15]. Plasma bogată în trombocite are mai multe trombocite concentrate decât plasma normală (aproximativ 150–400 × 103 celule/dL). Este una dintre cele mai comune definiții ale PRP în literatură [16]. Până în prezent, studii limitate au caracterizat XOR și activitatea sa izoforme în plasma bogată în trombocite sau săracă la pacienții care suferă de boală cronică de rinichi. Tan şi colab. au arătat celulele afectate de specii reactive de oxigen (ROS) (în cazul terapiei de substituție renală cronică) „scurge” izoforme XOR, ducând la creșterea nivelului de enzime în plasmă [17]. Acest mecanism explică activitatea mai scăzută a XOR și a izoformelor sale în trombocite în comparație cu PPP. Prin urmare, activitatea oxidoreductazelor în PPP și PRP este de mare interes, deoarece ar putea ajuta la descoperirea proceselor celulare care au loc zilnic, sis. Astfel de investigații ar putea, de asemenea, să evidențieze indirect severitatea stresului oxidativ la acest grup de pacienți.

Berry și colab. descrie, de asemenea, că xantin oxidoreductaza este distribuită în ficat, intestinul subțire, glanda mamară și celulele endoteliale. Metodele de localizare subcelulară au demonstrat prezența xantin-oxidoreductazei atât în ​​citoplasmă, cât și pe membranele celulare. Ele indică, de asemenea, că xantinooxidoreductaza din plasmă se poate datora umbririi xantinooxidoreductazei din membranele celulare sau scurgerii din citoplasmă. Acesta este unul dintre motivele pentru care testăm activitatea XOR în PPP și PRP pentru a distinge activitatea enzimatică în trombocite și alte celule sanguine conținute în plasmă [18]. Pe baza activității enzimelor antioxidante, putem determina și ce tip de terapie de substituție renală este mai puțin probabil să expună pacientul la stres oxidativ. Datorită naturii duble a XOR, înțelegerea relației dintre tipul de terapii de substituție renală și activitatea izoformelor XOR poate fi foarte interesantă și utilă în selectarea tipului de terapie de substituție renală.

Materiale și metode

Aprobare și consimțământ etic

Comisia de Bioetică de la Universitatea de Medicină Pomeranian din Szczecin a aprobat cercetarea efectuată (nr KB−0012/36/11). Toți participanții, inclusiv voluntarii sănătoși din grupul de control, au fost informați cu privire la scopul și domeniul de aplicare al studiului și și-au dat consimțământul pentru donarea de mostre și publicarea datelor rezultate.

Grup de studiu

Au fost 147 de participanți: un grup de control format din 30 de voluntari sănătoși (NK) și 117 pacienți cu boală renală cronică (CKD) care frecventează Clinica de Nefrologie, Transplanetologie și Boli Interne a Universității de Medicină Pomeranian din Szczecin. Pacienții au fost împărțiți în 4 grupe în funcție de tratamentul primit: 30 de pacienți înainte și după hemodializă (HD A și HD B): 30 de pacienți au primit dializă peritoneală (DP); 27 de pacienți înainte și după transplant de rinichi (5-7 zile după intervenție chirurgicală) (TE, TE A); 30 de pacienți au primit tratament conservator (CT) (BRC stadiul 2-5). Sexul, vârsta, durata dializei, cauza și stadiul bolii renale cronice și concentrația creatininei în grupurile de testare și de control sunt prezentate în tabelele 1 și 2.

Mostre

Probele de sânge (K2EDTA (8 ml), citrat trisodic 3,8% (9: 1; v/v) și ser (8 ml)) au fost extrase de la toți participanții la studiu. Sângele pacientului hemodializat a fost extras din fistula lor arteriovenoasă; puncția venoasă periferică a fost utilizată pentru toți ceilalți participanți. Au fost prelevate probe de la pacienții hemodializați înainte de (HD A) și la aproximativ 10 minute după oprirea pompei (HD B). Sângele pacientului transplantat a fost recoltat înainte de transplant (TE) și la 5-7 zile după intervenție chirurgicală (TE A). Pacienții recrutați pentru grupul TE nu aparțineau grupului de pacienți cu hemodializă sau dializă peritoneală în acest studiu. Erau pacienți calificați pentru transplant din toată Polonia. Marea majoritate a pacienților cu transplant de rinichi au avut o analiză anterioară. K2EDTA și probele de sânge coagulat au fost centrifugate la 2600 rpm timp de 10 minute la 20 de grade pentru a obține plasmă și, respectiv, ser. Pentru a obține plasmă bogată în trombocite (PRP) și plasmă săracă în trombocite (PPP), sângele colectat cu citrat a fost centrifugat în condiții la 1100 rpm timp de 10 minute la 20 de grade. PRP rezultat a fost transferat într-un tub nou și centrifugat la 6000 rpm timp de 10 minute la 20 de grade: plasma săracă în trombocite (PPP) a fost transferată într-un tub separat; granula de trombocite a fost clătită de două ori și suspendată în tampon Tyroda (pH7,4). Plasma, serul, PPP și PRP au fost congelate la -80 de grade până când au fost efectuate testele. La pacienții cu hemodializă, sângele a fost recoltat înainte de administrarea heparinei și după dializă care a durat în medie 4-5 ore (timp de înjumătățire al heparinei - 4 h) pentru a elimina orice influență posibilă a heparinei asupra activității XOR.

Activitatea xantinei oxidoreductazei în plasma săracă în trombocite și trombocite

Determinările au fost efectuate cu un spectrofotometru Perkin Elmer UV/VIS Lambda 40P. Modificările de extincție au fost înregistrate la 340 nm (XD) și 302 nm (XDO, XO) timp de 5 minute la 30 de grade. Activitatea enzimatică a fost măsurată ca formare de acid uric și NADH (creșteri în A340 și A302) și exprimată în mU × mL-1 (miliuniți per mililitru). Activitatea enzimatică a fost calculată ținând cont de vitezele inițiale de reacție. Formarea acidului uric a fost măsurată la 302 nm (izoforme XDO și XO) deoarece absorbanța sa este încă mare acolo, în timp ce modificările concentrației NAD+ nu contribuie. Coeficientul de extincție pentru NADH+ H+ ε340=6.22× 103 [L∙mol−1 cm−1 ] a fost utilizat pentru a calcula activitatea izoformelor de xantin oxidoreductază NADH+ H+: ε302=2.30× 103 [ L∙mol−1 cm−1 ] [7, 19–22].

Tabelul 1 Caracteristicile generale ale pacienților cu hemodializă (HD), dializă peritoneală (DP) tratați conservator (CKD), transplant renal (TE) și grupul de control (C) care participă la studiu (media ± SD)

P * - semnificația statistică pentru diferențele dintre loturile HD, PD și CKD, testul Fisher exact TE și C pentru variabile calitative; pentru variabile cantitative - ANOVA unidirecțional și; P ** - semnificație statistică pentru diferențele dintre loturile HD, PD și CKD și testul Fisher exact TE pentru variabile calitative pentru variabile cantitative ANOVA unidirecțional sau; DM - nefropatie diabetică; HA - hipertensiune arterială; GIK - rinichi de infamație glomerulară; ADPKD - boală polichistică de rinichi moștenită autosomal dominant; NS - fără diferențe semnificative statistic.

Tabelul 2 Caracteristicile generale ale pacienților hemodializați (B - înainte de HD, A - după), dializă peritoneală (DP) tratați conservator (CKD) înainte și după transplant de rinichi (TE B și TE A) și grupul de control (NK) care participă la studiu (media ± SD)

P * - semnificație statistică pentru diferențele dintre grupurile HD A, HD B, PD și CKD, TE și C pentru variabile cantitative - Kruskal Wallis ANOVA, ANOVA unidirecțional sau testul t Student P ** - semnificație statistică pentru diferențele dintre HD A , HD B, PD și grupuri CKD și TE pentru variabilele cantitative ANOVA lui Kruskal Wallis sau analiza unidirecțională ANOVA Kt / V - indicele de dializă (fracția de volum V purificată prin clearance-ul K la momentul t) NS nu s-au găsit relații semnificative statistic

Analiza statistică Pentru evaluarea distribuțiilor s-a folosit testul KS (Kolmogorov-Smirnov), care în cazul unor variabile (activitatea izoformelor XD și XDO în PRP) a arătat o distribuție nenormală a parametrilor. Testele exacte Fisher și Chi-pătrat au fost utilizate pentru a analiza datele cantitative. Folosind testul t Student și analiza ANOVA pentru sisteme univariate, s-au evaluat diferențele dintre variabilele asociate (pereche) și cele neînrudite (nepereche) în cazul variabilelor cu distribuție normală. În cazul variabilelor cu distribuții non-normale, a fost efectuată analiza Kruskal-Wallis ANOVA pentru a evalua diferențele dintre parametri, precum și testul neparametric Mann-Whitney U pentru datele nepereche sau Wilcoxon pentru datele pereche. Un model de regresie multiplă liniară a fost utilizat pentru a determina evaluarea multifactorială a relațiilor dintre parametrii studiați. Analiza statistică a rezultatelor a fost efectuată folosind Statistica 12 (StatSoft).