Cistanche ameliorează infecția rinichilor din cauza lupusului eritematos sistemic

A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pentru partea 1, vă rugăm să faceți clic aici.

DISCUŢIE

O ruptură a toleranței față de antigenele nucleare este semnul distinctiv alsistemic lupuseritematosși, pe lângă celulele B, se crede că celulele T autoreactive joacă un rol central în patogeneza sa. Cu toate acestea, ca detectarea (auto)antigenului specificCD4^{la care se adauga} Celulele T reprezintă încă o provocare majoră în cercetarea autoimunității, până în prezent, se știe puțin despre CD4 reactiv la antigenul nuclear.^{la care se adauga}celulele T însistemiclupuseritematos.

Recent, noi metode pentru detectarea și enumerarea CD4 specific antigenului^{la care se adauga}Au fost dezvoltate celule T. Abordarea bibliotecii de celule T exploatează expansiunea policlonală anterioară a celulelor T pentru a permite detectarea clonelor rare de celule T specifice antigenului. Această strategie oferă o sensibilitate ridicată și permite lucrul cu cantități limitate de celule. Folosind această tehnică, am putut demonstra celulele T reactive împotriva a 5 antigene nucleare canonice la pacienții cu activsistemiclupuseritematos. Dezavantajele detectării bazate pe bibliotecă sunt, pe lângă faptul că necesită forță de muncă, că nu poate fi exclusă creșterea sau pierderea anumitor clone în timpul expansiunii, fazei și opțiunile limitate pentru analiza fenotipică a celulelor.

Citometria standard este limitată de numărul de evenimente detectabile, care de obicei restricționează analiza probelor la populația cu frecvențe peste 0,01 la sută . Observația noastră folosind biblioteca de celule T a arătat că frecvența circulației CD4 autoreactive^{la care se adauga}Celulele T pentru un anumit autoantigen la pacienții cu o apariție a bolii au fost celule w20 într-un milion de celule, reprezentând o frecvență de 0,002 la sută; prin urmare, detectarea CD4 autoantigen-specific^{la care se adauga}Celulele T folosind citometria standard, nemanipulată, este aproape imposibilă. Bacher et al. a introdus pre-imbogatirea CD4^{la care se adauga}Celulele T care sunt reactive la anumite antigene înainte de achiziție prin citometria colegilor, cunoscută sub numele de metoda ARTE. Adoptarea acestei abordări pentru detectarea CD4 specific antigenului nuclear^{la care se adauga}celulele T, am putut să confirmăm descoperirile noastre și să demonstrăm extinderea CD4 reactiv la antigenul nuclear^{la care se adauga}Celulele T sunt activesistemiclupuseritematos. În special, frecvența celulelor T reactive cu transtiretină și C. Albicans a fost indiferentă între martorii sănătoși și pacienții cusistemiclupuseritematoscu activitate diferită a bolii. Prin urmare, expansiunea observată aautoreactivT celuleprobabil nu este un rezultat al hiperreactivității generale inactivesistemiclupuseritematosci a expansiunii celulelor T specifice antigenului.

Thelupus eritematos sistemicinfecteazărinichi, deci cistanche este folosit pentru protejarerinichi.

Rapoartele anterioare au demonstrat deja existențaautoreactivcelulele Tînsistemiclupuseritematos, folosind în primul rând proliferarea, producția de citokine sau reglarea în sus a markerilor de activare, deși fără a putea cuantifica o populație clară a acestor celule. Cele mai bune dovezi privind frecvența celulelor T specifice antigenului nuclear există pentru reactivitatea împotriva ribonucleoproteinei mici U1, o țintă caracteristică autoantigenului în boala mixtă a țesutului conjunctiv și găsită doar la o fracțiune dintre pacienții cusistemiclupuseritematos. Ribonucleoproteină nucleară mică U1 – CD4 reactiv^{la care se adauga}Celulele T au fost determinate utilizând diluția de limitare și Testul Imuno Spot Enzimatic (ELISPOT) și s-a raportat că apar la o frecvență de (40 până la 250) 106 celule T și, respectiv, (20 până la 60) 106 PBMC-uri, care este similară. magnitudinea ca frecvența celulelor autoreactive din studiul nostru. În munca noastră, am investigat reactivitatea față de mai multe caracteristicisistemiclupuseritematos-antigeni nucleari asociati. Interesant, deși toți pacienții cu LN activ au prezentat frecvențe crescute ale CD4 reactiv la antigen antinuclear^{la care se adauga}celulele T, pacienții diferă în portofoliul lor țintă, iar reactivitatea a fost îndreptată împotriva unui set mai larg de antigene în comparație cu pacienții cu inactiv.sistemiclupuseritematos. Semnificația biologică a acestui lucru este în prezent necunoscută. CD4 diferit^{la care se adauga}Reactivitățile celulelor T se pot asocia cu anumite manifestări clinice ale diferitelor reactivități care pot fi redundante pentru patogeneza bolii.

Similar altor boli autoimune, am putut demonstra existența CD4 autoreactiv^{la care se adauga}Celulele T la indivizi sănătoși, deși la frecvențe mult mai mici în comparație cu pacienții cu lupus eritematos sistemic activ. Aceste celule au fost nedetectabile prin compararea numărului de celule activate cu sau fără stimulare cu antigen, chiar și cu tehnici foarte sensibile precum bibliotecile de celule T sau metodele ARTE. Cu toate acestea, prin clonarea unei singure celule, am reușit să demonstrăm că semnalul „de fundal” conținea într-adevăr CD4 specific autoantigenului.^{la care se adauga}celulele T. Care evenimente specifice duc la ruperea tolerantei si cresterea frecventelor deautoreactivT celulerămâne speculativ; cu toate acestea, datele noastre demonstrează că extinderea clonelor autoreactive joacă un rol în patogeneza lupusului eritematos sistemic.

CD4 reactiv cu antigenul nuclear circulant^{la care se adauga}Celulele T au produs în principal IFN-g și, într-o măsură mai mică, IL-17 și IL-10. Acest profil de citokine împreună cu corelația slabă/nicio cu producția de autoanticorpi sugerează că rolul CD4 reactiv la antigenul nuclear^{la care se adauga}Este posibil ca celulele T să nu fie furnizorul exclusiv de ajutor pentru celulele B. IFN-g s-a dovedit a fi indispensabil în patogeneza LN. S-a demonstrat că celulele Th1 sunt recrutate îninfectat rinichitesut insistemic lupuseritematos, făcând celulele T reactive la antigenul nuclear candidații primi pentru a invadarinichi, unde ar întâlni autoantigenul lor omniprezent. Celulele T urinare au fost descrise anterior ca reflectă activitatea bolii și oglindesc fenotipul celulelor intrarenale din LN20,33; astfel, am folosit celulele T urinare ca proxy pentrurinichicelulele T. Celulele T urinare au evidențiat o variabilitate limitată a TCR, care este în conformitate cu observațiile dinrinichibiopsii, indicând îmbogățirea anumitor clone de celule T îninfectatrinichitesut. Printre celulele T urinare, am putut detecta celulele T reactive la antigenul nuclear, iar frecvența lor a fost îmbogățită în comparație cu celulele T circulante. În consecință, pare probabil ca celulele reactive la antigenul nuclear să participe direct la propagarea leziunilor locale ale organelor.

În rezumat, demonstrăm aici că CD4 reactiv la antigenul nuclear^{la care se adauga}Celulele T sunt extinse inactivesistemiclupuseritematos; ele sunt fenotipic în principal celule T Th1 producătoare de IFN-g și invadeazăinfectatorgane țintă, cum ar firinichi.

Cistanche poate evita infectarea larinichidin cauzasistemiclupuseritematos.

METODE

Metodele detaliate sunt date în Materialul suplimentar.

Subiecți și probe de sânge și urină

S-au obţinut probe de sânge de la 17 indivizi sănătoşi, 12 pacienţi cu inactivsistemiclupus eritematos(sistemiclupuseritematosScorul DAI<10), and="" 20="" patients="" with="" active="">sistemiclupuseritematos(sistemiclupuseritematosDAI score >10). În plus, au fost obținute probe de urină de la 12 pacienți cu activsistemiclupuseritematosși LN. Toți subiecții și-au dat consimțământul în cunoștință de cauză pe baza aprobării etice obținute de consiliul de evaluare instituțional și de autoritățile de etică de la Charité – Universitätsmedizin Berlin (EA 1/342/12, EA 1/098/07 și EA 1/036/16). ). PBMC-urile și celulele urinare au fost preparate folosind un gradient de densitate FicollHypaque.

Anticorpi și urmați citometria

În funcție de experimente, mai multe molecule de suprafață au fost colorate pe celule stimulate de antigen în diferite combinații ale următorilor anticorpi monoclonali: anti-CD3, -CD4, -CD8, -CD14, -CD20, -CD69 și -CD154; pentru a discrimina celulele vii și cele moarte, kitul LIVE/DEAD Aqua (Life Technologies Ltd.,Paisistemiclupuseritematos, Marea Britanie) a fost folosit.

Pentru a colora compartimentul celular intracelular, celulele au fost fixate cu 2 procente (v/v) paraformaldehidă timp de 15 minute la temperatura camerei și permeabilizate cu BD FACS Permeabilizing Solution 2 (BD Biosciences, San Jose, CA); următorii antigeni au fost colorați intracelular utilizând un protocol standard: CD154, IFN-g, IL-2, IL-4, IL-10 și IL-17.

Probele au fost achiziționate pe BD FACSCanto II și BD LSRFortessa (BD Biosciences) follow citometre la Flow Cytometry Core Facility Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin utilizând software-ul BD FACSDiva (BD Biosciences). Datele de citometrie în flux au fost analizate folosind software-ul FlowJo (FlowJo v10, Three Star, Ashland, VA).

Prepararea antigenului și a pool-ului de antigen

Am folosit următoarele antigene pentru a stimula CD4^{la care se adauga}Celulele T din analiza bibliotecii de celule T: {{0}},5 mg/ml de proteină recombinată umană SNRPD1 (SmD1) (Biorbyt Ltd., Cambridge, Marea Britanie), 50 ng/ml de proteină recombinată SNRP70 (RNP70) umană (Abcam Plc., Cambridge, Marea Britanie), 0,5 mg/ml de proteină histonă umană naturală (Abcam Plc.), 0,5 mg/ml de SS umană - Proteină recombinată A/Ro (furnizată cu amabilitate de Euroimmun AG, Lübeck, Germania), 0,5 mg/ml de proteină recombinată umană SS-B/La (furnizată cu amabilitate de Orgentec Diagnostika GmbH, Mainz, Germania), 1 mg/ml de SEB (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Germania), 1 mg/ml de PepTivator Candida albicans MP65 (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germania) și 0,5 mg/ml de proteină recombinată transtiretină umană (ATGen, Seongnam, Coreea de Sud) ).

Biblioteci de celule T periferice și urinare Protocolul de generare a bibliotecilor de celule T periferice și urinare amplificate a fost adoptat și adaptat așa cum s-a descris anterior.14 Pe scurt, 200,000 CD4 periferic^{la care se adauga}celule T sau 500 până la 2000 CD4 urinar^{la care se adauga}Celulele T au fost izolate utilizând CD4 anti-uman^{la care se adauga}MicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH) conform instrucțiunilor producătorului. Puritatea CD4^{la care se adauga}Fracția de celule T a fost verificată în mod obișnuit utilizând citometria următoare pe baza CD3^{la care se adauga}CD4^{la care se adauga} expression, where the purity always reached >99% și 70% până la 75% pentru probele de sânge periferic și, respectiv, urinare. În paralel, celulele prezentatoare de antigen au fost preparate prin colectarea celulelor CD3 din PBMC după epuizare cu MicroBeads CD3 anti-umane (Miltenyi Biotec GmbH) și crioconservate. După 1 până la 2 săptămâni de cultură, fracțiuni de CD4 amplificat^{la care se adauga}Celulele T au fost distribuite în 96-plăci de godeuri, în funcție de numărul de antigene care trebuie analizate. Înainte de stimularea cu antigene, celulele au fost odihnite timp de cel puțin 4 zile. În ziua stimulării, celulele prezentatoare de antigen au fost dezghețate și distribuite în cultura de celule T într-un raport de cel puțin 1 celulă prezentatoare de antigen la 100 CD4.^{la care se adauga}celulele T. CD4^{la care se adauga}Bibliotecile de celule T pentru control negativ (celule nestimulate) și control pozitiv (celule stimulate cu SEB) au fost întotdeauna incluse în experimente. CD4^{la care se adauga} Celulele T au fost stimulate cu antigen timp de 4 zile, iar proliferarea a fost determinată utilizând un protocol standard de [3H]-timidină.

Blasturile de celule T amplificate au răspuns diferit la antigenele afișate prin CPM de scintilație foarte heterogenă; astfel, a fost necesară o normalizare a pragului de proliferare determinat ca scor z specific donatorului. Scorul z a fost calculat ca 5 diferențe ale percentilei 75 și 25 peste CPM median al microculturii nestimulate. Celulele din microculturi stimulate cu SEB au servit drept control pozitiv. De remarcat, microculturi cu un indice de stimulare SEB de<5 for="" peripheral="" blood="" samples,="" or="" 4="" for="" urinary="" samples,="" were="" excluded="" because="" it="" indicated="" poor="" cell="" viability.="" enumeration="" of="" the="" precursor="" frequency="" of="" antigen-specific="">^{la care se adauga}Celulele T au fost calculate folosind un număr de microculturi negative conform distribuției Poisson și exprimate la 1 milion de celule, așa cum s-a descris anterior. Utilizarea distribuției Poisson se bazează pe probabilitatea ca cel puțin 1CD4^{la care se adauga}Celula T este prezentă într-o singură microcultură de biblioteci de celule T atunci când semnalul radioactiv a fost detectat după stimularea specifică antigenului.

Metodele ARTE periferice și urinare am urmat protocolul care utilizează Kit-ul CD154 MicroBead (Miltenyi Biotec GmbH). Pe scurt, celulele au fost stimulate timp de 7 ore cu antigene și apoi marcate cu anticorpi anti-CD154-biotină umană și microbile anti-biotină conform instrucțiunilor producătorului. Celulele marcate au fost încărcate pe coloane MS calibrate (Miltenyi Biotec GmbH) pentru a îmbogăți celulele care exprimă CD154-. Marcarea celulelor cu diacetat de carboxifluoresceină N-succinimidil ester (Sigma-Aldrich Chemie GmbH) a fost făcută urmând un protocol standard.

Cistanche se îmbunătățeșterinichifuncții.

Generarea de clone unicelulare

Clonele unicelulare au fost generate din celule reactive la antigen, care au fost îmbogățite prin expresia CD154 urmând protocolul ARTE. Celulele care exprimă CD154-au fost filtrate cu un filtru de preparare de {30-mm (Miltenyi Biotec GmbH) și resuspendate în 1 ml de soluție salină tamponată cu fosfat 2{0 procente (v/v), 0,5 procent albumină serică bovină și acid etilendiaminotetraacetic 2 mM. Celulele au fost celule unice sortate pentru CD154^{la care se adauga}CD69^{la care se adauga}fenotipul și celulele unice sortate au fost cultivate în godeuri unice ale plăcilor de 96-godeuri în prezența celulelor alimentatoare. Culturile de celule au fost menținute timp de 3 până la 4 zile până când au fost vizibile mai multe clone. Cu o zi înainte de restimulare, celulele prezentatoare de antigen au fost dezghețate și distribuite în cultura de celule T într-un raport de

cel puțin 1 celulă prezentatoare de antigen la 100 CD4^{la care se adauga}celulele T. Celulele au fost stimulate cu 1 mg/ml de antigen, iar clonele nestimulate au servit drept control negativ.

Analiza repertoriului TCR bazată pe secvențiere de generație următoare

ADN-ul genomic a fost izolat din CD4 periferic^{la care se adauga}Celule T și celule urinare folosind AllPrep DNA/ARN Micro Kit (Qiagen, Venlo, Țările de Jos). Locusul TCR-b recombinat a fost amplificat urmând protocolul descris anterior. Citirile au fost procesate folosind IMSEQ, iar clonotipurile egale au fost grupate și analizate în continuare.

Statistici

Testele statistice au fost efectuate cu software-ul GraphPad Prism (Prism 8, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). A fost aplicată ajustarea Bonferroni pentru comparații multiple. Testul Mann-Whitney U și testul Wilcoxon cu semne au fost utilizate în experimentele cu setul de date independent și, respectiv, dependent. După ajustarea Bonferroni pentru comparații multiple, calculul valorilor P critice a fost corectat deoarece se bazează pe numărul de comparații planificate. valorile P<0.01 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.01,="" **p="" <="" 0.005,="" and="" ***p="" <="" 0.0005.="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" spearman="" rank="" correlations="" by="" showing="" the="" absolute="">sistemiclupuseritematosValorile DAI în loc de valorile clasate pentru a oferi o mai bună înțelegere a corelației dintre numărul de celule și activitatea bolii. Pentru analiza corelației, valorile P<0.5 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.05,="" **p="" <="" 0.01,="" and="" ***p="" <="" 0.001.="" when="" background="" frequencies="" were="" higher="" than="" the="" frequencies="" of="" nuclear="" antigen–reactive="">^{la care se adauga}celulele T, frecvențele fără fundal au fost definite ca zero. O transformare log(x + 1) a fost aplicată setului de date atunci când a inclus valori zero. Datele suplimentare despre pacient și datele statistice sunt disponibile în tabelele suplimentare S1 și S2.

CD4 reactiv la antigenul nuclear^{la care se adauga}celulele se extind în activsistemiclupuseritematos, produc citokine efectoare și infecteazărinichi,cistanche poate protejarinichi.

DEZVĂLUIRE

Toți autorii au declarat că nu există interese concurente.

MULȚUMIRI

Mulțumim lui Toralf Kaiser și Jenny Kirsch (Citometria în flux și instalația de sortare a celulelor, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin) pentru asistență cu citometria în flux și sortarea celulelor. Sprijinul pentru aceste studii a fost oferit de subvenții de la Deutsche Forschungsgemeinschaft din cadrul Sonderforschungsbereich 650 către GR și de subvenții de la Deutsche Gesellschaft für Nephrologie și Programul de cercetători clinici al Charité–Universitätsmedizin Berlin și Institutul de Sănătate din Berlin pentru PE.

MATERIAL SUPLIMENTAR Fișier suplimentar (PDF)

Figura S1. CD4 specific antigenului nuclear autoreactiv^{la care se adauga}Celulele T au fost detectate prin metoda bibliotecii de celule T. Figura S2. CD154^{la care se adauga}CD69^{la care se adauga}CD4^{la care se adauga}Celulele T izolate după stimularea cu antigene nucleare de la indivizi sănătoși sunt CD4 specifice antigenului bona-fife^{la care se adauga}celulele T.

Figura S3. Frecvențele CD4 autoreactive producătoare de citokine^{la care se adauga}Celulele T au fost comparate cu titrul de anticorpi antinucleari (anti-ANA) (A) și cu concentrația de anticorpi anti-ADN dublu catenar (anti-dsDNA) (B).

Figura S4. CD4 reactiv la antigenul nuclear^{la care se adauga}Celulele T au fost detectate în urina activelorsistemiclupuseritematospacientii cu LN.

Tabelul S1. Date clinice.

Tabelul S2. Rezumatul valorilor mediane.

Metode suplimentare.

Odata cerinichieste infectat din cauza CD4 reactiv cu antigenul nuclear^{la care se adauga}celulele care se extind în activsistemiclupuseritematos, celrinichifuncția este distrusă, cistanche este folosită pentru a îmbunătățirinichifuncţie.

REFERINȚE

1. Casciola-Rosen LA, Anhalt G, Rosen A. Autoantigens targeted insistemic lupuseritematossunt grupate în două populații de structuri de suprafață pe keratinocite apoptotice. J Exp Med. 1994;179: 1317–1330.

2. Arbuckle MR, McClain MT, Rubertone MV, et al. Dezvoltarea de autoanticorpi înainte de debutul clinic alsistemiclupuseritematos. N Engl J Med. 2003;349:1526–1533.

3. Suarez-Fueyo A, Bradley SJ, Tsokos GC. celulele T însistemiclupuseritematos. Curr Opin Immunol. 2016;43:32–38.

4. Crow MK, DelGiudice-Asch G, Zehetbauer JB, et al. Proliferarea celulelor T specifice autoantigenului indusă de proteina ribozomală P2 la pacienții cusistemiclupuseritematos. J Clin Invest. 1994;94:345–352.

5. Engler JB, Undeutsch R, Kloke L, et al. Demascarea CD4 autoreactiv^{la care se adauga}Celulele T prin epuizarea celulelor T reglatoare CD25 însistemiclupuseritematos. Ann Rheum Dis. 2011;70:2176–2183.

si etc.