Reactivă încrucișată, recunoașterea IgG naturale L. Major Promovează internalizarea paraziților de către celulele dendritice și promovează imunitatea protectoare

Abstract

Mesaje cheie

• Folosind diferiți șoareci modificați genetic, am constatat că acești anticorpi pot fi IgG, nu numai IgM.

Cuvinte cheie

Leishmania major · Celulă dendritică · Celulă B · IgG naturală

Introducere

Infecțiile cu Leishmania spp. reprezintă o povară majoră în țările endemice. Manifestarea bolii variază de la leishmanioză cutanată autolimitată la boală diseminată, recurentă, mucocutanată și viscerală. Leishmanioza viscerală netratată este o amenințare gravă la adresa vieții gazdei. Un vaccin nu există încă. Vindecare și pe tot parcursul viețiiimunitateîmpotriva acestui important agent patogen intracelular depind de dezvoltarea celulelor Th1/Tc1 producătoare de IFN, în timp ce persistența paraziților și progresia bolii sunt asociate cu dominanța celulelor Th2, celulele T reglatoare și/sau răspunsurile Th17. Eliberarea de IFN duce la producerea de NO care elimină paraziții.Imunitate protectoareeste indusă de celulele dendritice infectate (DC). După inocularea Leishmania major în piele de către musculița, formele de viață ale paraziților promastigoți sunt ingerate de macrofagele rezidente pe piele (MΦ) și neutrofile. În cadrul MΦ, paraziții se transformă în forme de viață amastigote neflagelate și se reproduc. Mai târziu, amastigoții eliberați sunt preluați de alte celule gazdă, cum ar fi DC. DC infectate procesează antigenele paraziților și migrează către ganglionii limfatici drenați și celulele T primare. Eliberarea IL-12, precum și a altor citokine din DC infectate, dirijează educația Th1/Tc1 a celulelor T specifice parazitului.

În timp ce MΦ utilizează receptorul complementului (CR)3 pentru captarea paraziților, în DC, Fc RI/III este responsabil pentruparazitinternalizare. Interesant, devreme, absorbția parazitului asociată CR{0}} duce la tăcere a MΦ infectat, în timp ce în infecțiile stabilite, absorbția Fc R mediată de amastigoți de către MΦ induce producția de IL-10 antiinflamatoare care promovează dezvoltarea Th2/Treg. și persistența paraziților. Captarea parazitului mediată de Fc R în DC, în schimb, induce activarea celulelor, amorsarea celulelor T CD4 și, de asemenea, prezentarea încrucișată a antigenului. Prin urmare, absorbția parazitului mediată de anticorpi de către DC este importantă pentru dezvoltarea protecției împotriva parazitului. Producerea de IgG anti-Leishmania este astfel o condiție prealabilă pentru amorsarea eficientă (încrucișată) a celulelor Th1/Tc1 specifice Leishmania. În mod similar, în absența celulelor B, dezvoltarea bolii a fost mai severă, cu volume de leziuni mai mari, sarcini mai mari de paraziți, amorsare întârziată a celulelor T și producție redusă de IFNΓ. Anterior, am arătat că IgG specifică Leishmania era prezentă în seruri în momentul acumulării DC în leziuni.

Rămâne o întrebare deschisă cum se dezvoltă răspunsul inițial al celulelor B la parazitul în sine în absența amorsării celulelor B de către DC infectate. Așa-numiții anticorpi naturali care recunosc Leishmania spp. poate facilita devremeinteriorizarea parazituluide către DC. În plus, deoarece membranele paraziților conțin fosfatidilserina similară cu corpurile apoptotice,reactiv încrucișatanticorpii pot juca un rol. În studiul de față, am evaluat dacă anticorpii anti-fosfolipidici generați, de exemplu, în timpul morții excesive a celulelor sau IgG naturale care recunosc Leishmania prezente la animalele neimune contribuie la preluarea paraziților de DC pentru a promova celulele B și celulele T. Am descoperit că anticorpii anti-fosfolipidici din serul murin sau uman, precum și „IgG naturală” din serul normal de șoarece (NMS) se leagă de paraziții Leishmania, ceea ce este suficient pentru a promovaparazitinternalizarede DC și promovează rezultate mai bune ale bolii in vivo.

Material si metode

Animale

Șoarecii C57BL/6 în vârstă de șase până la opt săptămâni au fost achiziționați de la Janvier. Șoarecii µMT cu deficit de celule B au fost furnizați cu generozitate de Hansjörg Schild, Institutul de Imunologie, Centrul Medical Universitar Mainz. Șoarecii IgGi și IgMi (amândoi pe fundal C57BL/6) au fost descriși anterior. Toate animalele au fost găzduite în condiții specifice fără patogeni (SPF) în Centrul de Cercetare a Animalelor Translaționale (TARC) al Universității Johannes Gutenberg, Mainz. Toate experimentele au fost efectuate cu o licență aprobată de la Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor din regiunea Rheinland-Pfalz.

Conform studiilor pe plante, s-a demonstrat că cistanche este un tip de ciupercă care a fost folosită de secole în medicina tradițională chineză. Este făcut din tulpinile și tulpinile uscate ale ciupercii, care crește în regiunile tropicale și subtropicale ale Asiei. Este obișnuit săîmbunătățește imunitatea, ameliorează oboseala și tratează răceala și alte infecții.

Cercetările au arătat căcistanchepoate crește producția de anticorpi, care pot ajuta organismul să lupte împotriva invadatorilor străini, cum ar fi virușii și bacteriile. S-a descoperit că crește numărul și activitatea celulelor T, un tip de globule albe din sânge care este responsabilă pentru a ajuta organismul să recunoască și să lupte împotriva invadatorilor dăunători.

În plus, studiile au arătat că cistanche poate reduce severitatea răcelilor, gripei și a altor infecții virale. S-a descoperit că scade timpul necesar organismului pentru a se recupera de la infecțiile virale sau bacteriene. cistanche poate reduce, de asemenea, durata febrei cauzate de anumite virusuri, precum si scade riscul de a dezvolta infectii secundare.

În plus,cistanchese știe că are proprietăți antiinflamatorii, care pot reduce inflamația asociată cu anumite boli. Studiile au arătat, de asemenea, că dendrobiul poate ajuta la îmbunătățirea eficacității anumitor antibiotice.

Faceți clic pe Cistanche organice vândute lângă mine

Pentru mai multe informații, vă rugăm să ne contactați la:david.deng@wecistanche.com

În general, cercetările sugerează că cistanche poate fi un tratament util pentruimbunatatireaimunitateși combaterea diferitelor infecții. Poate ajuta la îmbunătățirea apărării naturale a organismului, poate reduce severitatea și durata bolilor și poate chiar reduce riscul de a dezvolta infecții secundare.

Paraziți și infecții 

Amastigotele sau promastigotele metaciclice ale L. major clona VI (MHOM/IL/Friedlin) au fost preparați așa cum s-a descris anterior. Amastigoții au fost izolați din urechile infectate ale șoarecilor µMT cu deficiență de celule BALB/c sau B așa cum s-a descris mai înainte. Paraziții izolați au fost opsonizați cu 5% NMS, IMS sau anti-PL timp de 10 minute la 37 de grade și spălați înainte de infecțiile in vitro sau in vivo.

Seruri, îmbogățire cu IgG și test de legare a paraziților

Serul normal de șoarece (NMS) a fost generat de la șoareci C57BL/6 naivi, în timp ce serul imunitar (IS) a fost luat de la șoareci vindecați care au fost infectați cu promastigoți metaciclici 2 × 10E5 de L. major pentru Mai mare sau egal până la 6 săptămâni. Serurile de anticorpi antifosfolipidici (PL) au fost generate prin imunizare repetată cu timocite apoptotice. Înainte ca serul să fie recoltat, succesul imunizării a fost verificat prin evaluarea legării specifice de IgG la celulele apoptotice prin citometrie în flux sau într-un ELISA specific pentru glicoproteină. Grupuri de șoareci C57BL/6 au fost imunizate cu 2-glicoproteină recombinantă (2G) în prezența adjuvantului Freud (FA); serul care conține anti- 2G a fost recoltat după 4 săptămâni. IgG anti-Leishmania Mai mare sau egală cu 5–6-săptămâni L. șoareci BALB/c infectați major, IgG specifice PL sau b2G, au fost preparate din seruri combinate folosind coloane de proteină G (Pierce Chemical Co.) urmând protocolul producătorului. Serurile au fost depozitate la -20 de grade înainte de purificarea IgG. IgG purificată a fost păstrată la 4 grade (0,8 mg/ml) în PBS înainte de utilizare.

Ser uman normal (NHS) a fost obținut de la subiecți de control sănătoși, iar serul care conține anticorpi anti-Leishmania a fost obținut de la pacienți cu leishmanioză cutanată (LM) din Maroc. De asemenea, a fost utilizat ser de la pacienții cu sindrom antifosfolipidic (PL).

Paraziții (promastigoți sau amastigoți) au fost colorați pentru Ig asociate suprafeței folosind anticorpi secundari specifici izotipului reactiv cu Ig de șoarece: anti-IgM (Serotec), anti-IgG1 (A85-1) și anti-IgG2a/b ( R2-40, toate de la BD Biosciences). După colorare, paraziții au fost spălați cu PBS/2% BSA, fixați și analizați prin citometrie în flux.

Stimulare in vitro

DC derivat din măduva osoasă a fost generată în mediu RPMI/5% FCS suplimentat cu IL-4 (10 pg/mL) și GM-CSF (10 pg/mL) timp de 6 zile așa cum s-a descris anterior. Celulele au fost recoltate în ziua 6 ca DC imature. 2 x 105 DC au fost co-cultivate cu amastigote opsonizate de la șoareci BALB/c sau pMT infectați sau cultivate cu promastigote metaciclice opsonizate (MOI 1:5) timp de 18 ore. Ulterior, celulele au fost recoltate și citospinurile au fost generate așa cum s-a descris anterior. Celulele colorate cu DifQuick au fost analizate pentru prezența paraziților intracelulari și extracelulari. Au fost numărate cel puțin 200 de celule per probă.

Infecții in vivo

Volumele leziunilor au fost măsurate săptămânal în trei dimensiuni și sunt raportate ca elipsoizi [(a/2×b/2×c/2)×4/3×π]. Paraziții prezenți în țesutul lezional au fost enumerați folosind un test de diluție limitantă așa cum s-a descris anterior.

Pentru măsurarea producției de citokine specifice antigenului, celulele LN de drenare ale șoarecilor C57BL/6 infectați au fost recuperate și au fost preparate suspensii unicelulare. Un milion de celule LN/200 μL complet RPMI 1640 (Biochrome) au fost adăugate la plăcile de godeuri 96- în prezența a 25 ug/mL SLA. Supernatanții au fost recoltați la 48 de ore după stimulare și testați folosind ELISA-uri specifice pentru IFNΓ (sisteme de cercetare și dezvoltare), precum și IL-4 și IL-10 (BD).

DC uman mieloid infectat cu paraziți opsonizați

CD1c uman mieloid plus DC (hDC) a fost izolat din sângele periferic conform instrucțiunilor producătorului folosind un sistem de izolare a celulelor magnetice și kitul de izolare DC uman BDCA-1 (Miltenyi, Germania). 1,5 × 107 celule au fost placate în 2,5 ml plasmă autologă RPMI 1640/2%. Pentru a îmbogăți puritatea, celulele au fost spălate cu PBS cald și în cele din urmă cultivate cu X-VIVO 15/plasmă (1 la sută) suplimentat cu IL-4 uman recombinant (150 U/mL) și GM-CSF (400 U/mL) . HDC imature au fost recoltate în ziua 6. 2 x 105 hDC au fost co-cultivate cu amastigote opsonizate de la șoareci µMT infectați sau cultivate cu promastigoți metaciclici opsonizați (MOI 1:5) timp de 18 ore. Ulterior, celulele au fost recoltate și citospinurile au fost generate așa cum s-a descris anterior. Celulele colorate cu DifQuick au fost analizate pentru prezența paraziților intracelulari și extracelulari. Au fost numărate cel puțin 200 de celule per probă.

analize statistice

Analiza statistică a fost efectuată folosind software-ul StatView și testul t Student neîmperecheat.

Rezultate

Serul care conține anticorpi antifosfolipidici se leagă de L. major

Deoarece paraziții pot pătrunde în celulele gazdă printr-un proces numit „mimetism apoptotic” și deoarece formele de viață majore ale L. exprimă fosfolipide pe suprafața lor, am generat ser care conține anticorpi antifosfolipidici (PL) folosind protocoale stabilite. În acest scop, grupuri de șoareci C57BL/6 au fost infectați cu L. major, imunizați cu timocite apoptotice în prezența adjuvantului Freud (FA). Deoarece 2-glicoproteina ( 2G) este antigenul principal în sindromul antifosfolipidic (APS), am imunizat și șoarecii cu 2G în prezența FA pentru a obține ser care conține anticorpi anti- 2G. Ca martori, au fost utilizate ser de șoarece normal (NMS) de la șoareci C57BL/6 neinfectați și ser imunitar (IS) de la șoareci infectați cu L. major.

Pentru a testa dacă aceste diferite seruri de șoarece de la șoareci naivi sau imunizați conțin anticorpi care se leagă de L. major, am evaluat mai întâi legarea anticorpilor la antigenul parazit prin ELISA, utilizând lizat de îngheț-dezgheț de promastigot L. major (antigen Leishmania solubil, SLA) ca substrat. (Fig. 1A, coloane negre). Ca standard, am folosit IgG izolate din serurile de șoareci infectați cu L. major. În mod interesant, serul IS, precum și PL au conținut niveluri comparabile de legare a anticorpilor la lizat de Leishmania, care a fost de 3-4 ori mai mare în comparație cu legarea observată cu NMS sau ser de la șoareci imunizați numai cu adjuvant. În plus, serul care conține anticorpi 2G este, de asemenea, legat de SLA. Folosind un ELISA specific pentru 2G (coloane albe), am identificat niveluri ridicate de 2G-IgG în ser, în timp ce nivelurile de 2G IgG din toate celelalte seruri au fost sub limita de detectare.

Smochin. 1 Detection of L. major cross-reactive antibodies in serum of mice containing antiphospholipid antibodies. Serum was obtained from groups of C57BL/6 mice that were left untreated (normal mouse serum, NMS) or which were infected for>6 săptămâni cu 2× 105 L. major (ser imun, IS). Un alt grup a fost imunizat în mod repetat cu timocite apoptotice (antifosfolipide Ab, a-PL) sau glicoproteină recombinantă (a- 2G) în prezența adjuvantului Freuds (FA) incomplet, FA a fost folosit ca Control. Un ser a fost testat pentru reactivitate într-un ELISA folosind lizat de L. major ca substrat sau glicoproteină 2-. ELISA a fost dezvoltat folosind IgG anti-murine. Datele sunt exprimate ca medie (±SEM, n Mai mare sau egal cu 1). B Promastigotele metaciclice ale L. major au fost obținute din culturi în fază staționară (n{{10}}). C Amastigotele au fost preparate din leziuni ale șoarecilor µMT cu deficit de celule B (n=3). Preparatele de paraziți B și C au fost opsonizate cu seruri diferite (5 procente, 10 min, 37 de grade). Legarea anticorpilor a fost evaluată de FACS cu anticorpi secundari anti-șoarece. Legarea Ig a fost calculată în jurul nivelurilor de bază ale paraziților neopsonizați (*p mai mic sau egal cu 0,05, **p mai mic sau egal cu 0,005 și ***p mai mic sau egal cu 0,002)

Apoi, am incubat promastigoți metaciclici în stadiu infecțios de L. major cu diferite concentrații de IgG îmbogățite din seruri IS, PL sau 2G. Am observat o legare dependentă de doză a IgG derivate din IS și 2G cu un maxim de 100 ng/mL (Fig. 1B). Legarea IgG derivată din PL la promastigotele L. major nu a fost detectată.

În plus, am incubat amastigoți L. major izolați din leziuni ale șoarecilor µMT cu deficit de celule B cu seruri diferite timp de 10 minute. Paraziții au fost apoi spălați extensiv și, ulterior, anticorpul legat de suprafață a fost detectat prin citometrie în flux după marcarea cu anti-IgG1, antiIgG2a/b sau anti-IgM conjugat cu PE (Fig. 1C). După cum era de așteptat, IS conținea IgM, IgG1 și IgG2a/b specifice Leishmania. Confirmăm, de asemenea, munca anterioară, deoarece am detectat IgM specifice Leishmania în grupul de așa-numitul „Ab natural”. Interesant, am găsit, de asemenea, IgG și IgM în serul PL atât de puternicreacţionat încrucişatcu suprafaţa L. amastigote majore. Anticorpii IgG care conțineau- 2G nu s-au legat de Leishmania, dar serul 2G conținea IgMcu reacție încrucișatăcu suprafete amastigote.

Anticorpii reactivi încrucișați mediază internalizarea paraziților de către DC

În continuare, am intenționat să evaluăm dacă diferiții anticorpi IgG capabili să se lege la suprafața amastigotelor L. major sunt activi funcțional. Astfel, am generat DC folosind culturi de celule de măduvă osoasă (BM) suplimentate cu GMCSF și IL-4. BM-DC au fost recoltate ca celule imature în ziua 6 și placate la 2 x 105 celule/mL. Amastigoții paraziți derivați de la picioarele infectate ale șoarecilor BALB/c sau µMT cu deficiență de celule B de tip sălbatic au fost opsonizați cu diferite seruri (5% în volum), spălate extensiv și apoi adăugate la DC într-un raport parazit/celulă de 5:1. După 18 ore, celulele au fost recoltate, spălate și cytospin.

Parazitinternalizarea fost determinată pe lamele DifQuickstained la 100× (Fig. 2). După cum s-a descris, absorbția paraziților izolați de la șoarecii uMT a fost semnificativ afectată. Pre-incubarea cu NMS a îmbunătățit ușor absorbția paraziților, în timp ce incubarea cu IS a condus la „normalizarea” ratelor de infecție cu DC la niveluri observate cu amastigoții derivați de BALB/c. De notat, opsonizarea paraziților cu PL a îmbunătățit, de asemenea, în mod semnificativ și clar ratele de infecție cu DC cu ~ 100%. În conformitate cu nivelurile mai scăzute de opsonizare IgG ale amastigoților cu ser care conține b2G (comparați cu Fig. 1C), acest lucru a sporit și ratele de infecție cu DC, dar într-o măsură mai mică.

Fig. 2Opsonizarea L. major cu anticorpi reactivi încrucișați duce la absorbția sporită a paraziților de către DC. C57BL/6 BMDC imaturi (2× 105) au fost co-cultivate cu amastigote de la șoareci BALB/c sau µMT cu deficit de celule B (1:3). Înainte de co-incubare, amastigotele au fost opsonizate cu ser normal de șoarece (NMS), ser imun (IS), ser care conține anticorpi anti-fosfolipidici obținuți prin imunizare repetată cu timocite apoptotice (aPL) sau ser care conține anti- 2 glicoproteină. anticorpi (2G). După 18 ore, ratele de infecție au fost determinate pe citospinuri prin microscopie cu lumină (n=3, *p Mai mic sau egal cu 0.{05,**p Mai mic sau egal cu 0,005, și ***p mai mic sau egal cu 0,002 în comparație cu controalele neopsonizate)

Anticorpii antifosfolipidici reactivi încrucișați îmbunătățesc rezultatele bolii în leishmanioza cutanată

În experimentele ulterioare, am vrut să evaluăm dacă opsonizarea paraziților cureactiv încrucișatanticorpii modifică evoluția bolii in vivo. În acest scop, promastigoții metaciclici izolați și îmbogățiți din culturi de paraziți au fost opsonizați cu diferite seruri așa cum este descris mai sus. Parazitul opsonizat cu NMS a servit drept control negativ. După spălarea extensivă a paraziților, grupuri de cinci șoareci C57BL/6 au fost infectați intradermic cu 103 L. major. Dezvoltarea leziunii a fost monitorizată timp de ~4 luni. În conformitate cu descoperirile anterioare, paraziții opsonizați cu IS au indus leziuni mai mici ale urechii, în conformitate cu o frecvență crescută a DC a pielii infectate la momentele timpurii (Fig. 3). În mod surprinzător, paraziții opsonizați cu PL sau 2G au promovat în mod similar rezultate îmbunătățite în mod similar ale bolii, determinate de volumele leziunilor reduse cu 50% între săptămâna 5 și 8 post-infecție.

Anticorpii antifosfolipidici reactivi încrucișați îmbunătățesc rezultatele bolii în leishmanioza cutanată

În experimentele ulterioare, am vrut să evaluăm dacă opsonizarea paraziților cureactiv încrucișatanticorpii modifică evoluția bolii in vivo. În acest scop, promastigoții metaciclici izolați și îmbogățiți din culturi de paraziți au fost opsonizați cu diferite seruri așa cum este descris mai sus. Parazitul opsonizat cu NMS a servit drept control negativ. După spălarea extensivă a paraziților, grupuri de cinci șoareci C57BL/6 au fost infectați intradermic cu 103 L. major. Dezvoltarea leziunii a fost monitorizată timp de ~4 luni. În conformitate cu descoperirile anterioare, paraziții opsonizați cu IS au indus leziuni mai mici ale urechii, în conformitate cu o frecvență crescută a DC a pielii infectate la momentele timpurii (Fig. 3). În mod surprinzător, paraziții opsonizați cu PL sau 2G au promovat în mod similar rezultate îmbunătățite în mod similar ale bolii, determinate de volumele leziunilor reduse cu 50% între săptămâna 5 și 8 post-infecție.

Apoi, am folosit amastigoți µMT incubați cu 100 µg IgG îmbogățit din NMS, IS sau PL (Fig. 4). Din nou, am observat că atât IgG de la IS, cât și de la PL au dus la o boală mai ușoară, cu leziuni mai mici, în comparație cu paraziții neopsonizați (Fig. 4A). În linie, sarcinile de parazit ale țesutului lezional, așa cum au fost determinate în săptămâna 6 post-infecție, au evidențiat (semnificativ) sarcini mai mici de paraziți în infecțiile inițiate în prezența anticorpilor de legare a paraziților (Fig. 4B). Restimularea specifică antigenului a celulelor ganglionilor limfatici drenați cu SLA a evidențiat niveluri nealterate de IFN, în timp ce niveluri mai scăzute de IL-4 și IL{-10 au fost găsite la acei șoareci infectați cu paraziți opsonizați cu IgG (Fig. 4C) . Acest lucru este în concordanță cu scăderea dimensiunilor leziunilor, deoarece lucrările anterioare au arătat că eliminarea paraziților la șoareci depinde de activarea MΦ infectată de către IFN lezional, care este contracarat de IL-4 și, foarte important, de IL-10 . Ca atare, efectele IL-10 asupra MΦ infectată au condus la persistența paraziților. Astfel, raportul dintre IFN, pe de o parte, și citokinele asociate Th2/Treg, cum ar fi IL-4 și IL{-10, pare a fi cel mai relevant pentru rezultatul bolii.

Interesant, totuși, în acest cadru, au fost observate și volume mai mici de leziuni, când IgG din NMS a fost utilizată pentru opsonizare indicând prezențareactiv încrucișatanticorpi naturali și în serul șoarecilor naivi.

Atât anticorpii specifici pentru Leishmania, cât și anticorpii reactivi încrucișați pot înlocui lipsa genetică de IgG

Pentru a analiza mai bine contribuția specifică a subtipurilor de imunoglobuline în răspunsul la Leishmania, am folosit șoarecii IgMi și IgG1i pe care i-am generat anterior. Șoarecii IgMi sunt șoareci în care toate celulele B exprimă IgM, dar nu pot schimba clasa și nici nu pot secreta anticorpi. La șoarecii IgG1i, toate celulele B se dezvoltă folosind IgG1 ca receptor pentru celulele lor B, dar aceste celule, de asemenea, nu pot schimba clasa, dar sunt capabile să secrete anticorpi IgG1. Am infectat șoarecii IgMi și IgG1i pe fond genetic C57BL/6 cu 103 L. major. Am descoperit că prezența IgG1 în seruri a fost suficientă pentru ca șoarecii să dea un răspuns complet la parazit, similar animalelor de tip sălbatic (Fig. 5A). În contrast, absența anticorpilor secretați așa cum se observă la șoarecii IgMi a fost suficientă pentru a întârzia recuperarea șoarecilor (Fig. 5A).

Apoi, am reconstituit șoarecii IgMi sau martori de tip sălbatic fie cu NMS, fie cu IS și apoi i-am infectat cu L. major promastigotes. După cum era de așteptat, la ambele tulpini de șoarece, reconstituirea IS a indus leziuni semnificativ mai mici in vivo, confirmând faptul că absorbția accelerată a paraziților mediată de IgG de către DC promovează o îmbunătățire a anti-Leishmania.imunitate(Fig. 5B). În cele din urmă, am evaluat rezultatul bolii după utilizarea paraziților opsonizați. Înainte de infectarea șoarecilor IgMi, paraziții au fost opsonizați cu IgG îmbogățit din ser NMS, IS sau PL (Fig. 5C). În conformitate cu experimentul prezentat în Fig. 5B, paraziții opsonizați cu IS au facilitat apărarea îmbunătățită a paraziților. Din nou, anticorpii antifosfolipidici au fost capabili să înlocuiască IgG specifice Leishmania de la IS prin faptul că ambii anticorpi IgG legați la promastigoții majori de L. înainte de infecție au promovat rezultate mai bune ale bolii la șoareci IgMi. Paraziții opsonizati cu IS și PL au indus volume de leziuni semnificativ mai mici și vindecare mai devreme în comparație cu paraziții neopsonizați.

Foarte important, administrarea de NMS la șoarecii IgMi a „normalizat” fenotipul lor la rezultatul bolii observat la șoarecii C57BL/6 (Fig. 5B). Aceste constatări sunt în conformitate cu datele noastre prezentate mai sus, sugerând că NMS conține și areactiv încrucișatIzotipul anticorpului IgG care este capabil să se lege de paraziți cu consecințe funcționale ulterioare in vitro și in vivo. O confirmare suplimentară vine de la șoarecii IgMi infectați cu paraziți acoperiți cu NMS, care au fost, de asemenea, capabili să controleze mai bine infecția (Fig. 5C).

Smochin. 4Paraziții opsonizati cu anticorpi induc imunitate eficientă în µMT cu deficit de celule B. Paraziții au fost opsonizați cu ser normal de șoarece (NMS), ser imunitar (IS), ser care conține anticorpi antifosfolipidici (a-PL) sau - numai șoareci C57BL/6 - ser care conține anticorpi anti- 2glicoprotein (2G) în prezența adjuvantului Freud (FA). Grupuri de șoareci mai mari sau egali cu 5 µMT au fost infectați cu 103 promastigoți metaciclici opsonizați de L. major. Dezvoltarea leziunii a fost evaluată săptămânal. B În săptămâna 6, s-au determinat încărcăturile lezionale de paraziți de șoareci uMT infectați prin testul de limitare a diluției. Sunt afișate numerele individuale de paraziți; barele exprima mijloace. Profilele de citokine C ale celulelor µMT LN drenate au fost determinate prin restimulare cu antigen Leishmania solubil (SLA). Eliberarea de IFNΓ, IL{{10}} și IL{-10 în supernatanți de 48-h a fost evaluată prin ELISA (media ± SEM, n=15 șoareci/grup de la independenți 3 experimente, *p mai mic sau egal cu 0,05, **p mai mic sau egal cu 0,005 și ***p mai mic sau egal cu 0,002 în comparație cu șoarecii infectați cu paraziți neopsonizați)

Serul uman conține anticorpi activi funcțional, cu reacții încrucișate ale paraziților

Pentru a testa relevanța descoperirilor noastre pentru oameni, promastigoții sau amastigoții izolați de la șoareci µMT cu deficit de celule B au fost opsonizați cu ser uman normal (NHS), ser de la pacienți infectați cu L. major (LM) sau ser de la pacienți cu SPA (APS). ). IgG legată de suprafață pe paraziți a fost determinată folosind citometrie în flux. Interesant, serul LM s-a legat slab de suprafețele promastigotelor, dar puternic de amastigote. Interesant, serul APS conținea niveluri similare de IgGreactiv încrucișatcu suprafeţe parazite (Fig. 6A).

IgG a fost apoi îmbogățită din seruri LM utilizând coloane de proteină A (Fig. 6B). Aceasta și diferite concentrații de imunoglobuline intravenoase (IVIG) utilizate pentru tratamentul diferitelor tulburări (imune) ale pacienților au fost apoi utilizate pentru opsonizarea paraziților înainte de citometria în flux. Leishmania IgG se leagă semnificativ de promastigote și amastigote de L. major. Interesant, IVIG disponibil comercial conținea IgG carereacţionat încrucişatatât cu promastigot cât şi cu preparate parazitare amastigote.

În cele din urmă, CD1c plus DC uman mieloid primar din straturile leucoase au fost incubate cu amastigoți pMT de L. major incubați cu ser LM sau ser de la pacienți cu APS sau IVIG (MOI 3; Fig. 7). Confirmând datele noastre murine folosind celule umane, am observat că prezența IgG (reactiv încrucișatsau specifică Leishmania) pe suprafețele Leishmania este suficientă pentru a promova îmbunătățireaparazitinternalizarede către DC. Serul APS a crescut procentul de DC infectat cu aproape 100%, în timp ce serul LM și IVIG au crescut absorbția paraziților cu 30% în comparație cu paraziții neopsonizați. Interesant, serul NMS conținea și promovarea IgG reactivă la parazitparazitinternalizare.

Smochin. 5 Șoarecii C57BL/6, IgMi și IgGi reconstituiți cu seruri diferite sau infectați cu L. major opsonizat IgG purificat prezintă rezultate îmbunătățite ale bolii. Un grup de șoareci C57BL/6, C57BL/6 IgMi sau IgGi mai mare sau egal cu 5 au fost infectați cu inocule fiziologice în doză mică de L. major (103 promastigoți metaciclici). B Cu o săptămână înainte de infectare, șoarecii C57BL/6 și B6 IgMi au fost reconstituiți ip de două ori cu 100 µL fie de ser normal de șoarece (NMS) fie de ser imunitar (IS). C Înainte de infectarea șoarecilor IgMi, paraziții au fost opsonizați cu IgG îmbogățit din ser prin legarea la coloanele de proteină A [ser normal de șoarece (NMS), ser imun (IS) sau ser care conține anticorpi anti-fosfolipidici (a-PL)]. A-C Dezvoltarea leziunii a fost evaluată săptămânal (media ± SEM, n=10 șoareci/grup din 2 experimente independente, *p mai mic sau egal cu 0,05, **p mai mic sau egal cu 0,005 și *** p Mai mic sau egal cu 0,002 în comparație cu C57BL/6 [A], C57BL/6 sau IgMi [B] sau nici unul [C])

Smochin. 6Anticorpii antifosfolipidici din serurile umane reacţionează încrucişat cu moleculele de suprafaţă majore de L.. Promastigotele metaciclice din culturi în fază staționară sau amastigotele lezionale de L. major izolate de la șoareci uMT au fost opsonizate cu diferite tipuri de seruri umane (5 la sută) sau IgG purificate. Serurile umane normale (NHS) au fost obținute de la subiecți de control sănătoși. De asemenea, au fost utilizate seruri de la pacienți cu leishmanioză cutanată dovedită (LM, dobândită în Maroc, n=4) și de la pacienți cu sindrom antifosfolipidic (PL, n=3). B IgG a fost îmbogățită din seruri LM utilizând coloane de proteină A (n=3). Au fost utilizate diferite concentrații de imunoglobuline intravenoase (IVIG, n=2) (µg/mL). Paraziții A și B au fost analizați pentru legarea la suprafață a Ig-ului uman total folosind citometrie în flux. Legarea Ig a fost calculată în raport cu nivelurile inițiale ale paraziților neopsonizați (medie ± SEM, *p Mai mic sau egal cu 0.05, **p Mai mic sau egal cu {{10} }},005 și ***p Mai mic sau egal cu 0,002)

Discuţie

Vindecarea de leishmanioza cutanată necesită amorsare eficientă a celulelor T și eliberare de IFN, ambele depind de DC infectate pentru a prezenta antigene celulelor T naive. Spre deosebire de fagocitoza CR3-dependentă de MΦ, am arătat căparazitinternalizareprin DC apare prin Fc RI și Fc RIII, care se pot substitui unul pe celălalt. Ca atare, șoarecii cu deficiență de Fc -, Fc RI/Fc RIII și șoarecii µMT cu deficiență de celule B (toți pe fundal C57BL/6) au dezvoltat leziuni mai mari și au întârziat vindecarea, în comparație cu șoarecii de tip sălbatic, din cauza afectarii DC- amorsare dependentă de celule T. Studiul nostru de față confirmă această observație anterioară, dar în plus, datele noastre folosind șoareci IgMi și IgGi sugerează, de asemenea, că într-adevăr anticorpii secretați, și nu simpla prezență a celulelor B, sunt esențiale pentru a crea un răspuns eficient la parazit. Ca atare, similar cu șoarecii cu deficit de celule B, șoarecii IgMi cu celule B incapabile să producă IgG au prezentat dimensiuni mai mari ale leziunilor în comparație cu șoarecii IgGi sau șoarecii de tip sălbatic.

Deoarece atât amastigoții opsonizați cu NMS, cât și cu IS-au fost preluați în proporții similare, iar promastigoții opsonizați cu NMS nu au fost fagocitați de DC (cu legarea eficientă a IgM la suprafața lor), am concluzionat anterior că IgM nu este necesar pentru absorbția paraziților. În studiul de față, am reușit să confirmăm aceste constatări utilizând seruri normale de șoarece la șoareci cărora fie le lipsesc total celule B, fie au secretat doar anticorpi. În plus, am reușit să arătăm că serurile care conțin IgG1-au fost capabile să îmbunătățească intrarea amastigoților atât în ​​DC uman, cât și în DC de șoarece.

A rămas nerezolvat cum se dezvoltă răspunsul inițial al celulelor B în absența DC infectată. O posibilitate a fost ca în grupul de IgG „naturale”,reactiv încrucișatanticorpii pot fi capabili să recunoască paraziții și să servească drept înlocuitori pentru anticorpii specifici Leishmania care se dezvoltă mai târziu (crește între săptămâna 4 și săptămâna 6 post-infecție). Pe lângă anticorpii specifici antigenului, așa-numiții anticorpi naturali sunt produși de celulele B-1 atât la șoareci, cât și la oameni, după naștere. Unii au capacitatea de a recunoaște auto-antigenele; multă vreme, s-a crezut că le lipsesc specificitatea pentru antigenele străine. Mai târziu, datele au oferit dovezi că IgM naturală recunoaște diverse antigene microbiene și contribuie la eliminarea agenților patogeni. Cu toate acestea, recent, mai multe studii au arătat că IgG naturale joacă un rol înînnăscut imunitatede asemenea. Sa demonstrat că interacționează cu lectinele asociate patogenului (de exemplu, MBL) și formează complexe imune pentru a elimina agenții patogeni. De asemenea, se așteaptă ca IgG naturală legată de patogen să interacționeze cu alte PRR, cum ar fi C1q, pentru a activa calea clasică a complementului. Sa demonstrat că IgG naturală colaborează în mod specific cu lectinele asociate patogenului pentru a provoca o acțiune antimicrobiană eficientă împotriva infecției oportuniste cu Pseudomonas aeruginosa și Staphylococcus aureus.

În timpul morții celulelor apoptotice, se observă expunerea la fosfatidilserina (PS) pe corpurile apoptotice. Recunoașterea gazdei PS pe suprafața celulelor moarte sau moarte prin intermediul anticorpilor este un pas important în eliminarea acestora. Într-un proces numit „mimetism apoptotic”, paraziții Leishmania sunt cunoscuți că expun PS pe propria lor suprafață, servind drept semnal „mănâncă-mă” pentru celulele fagocitare, similar cu ceea ce se vede de celulele apoptotice. În plus, unii dintre promastigoții în stadiu infecțios mor (fără implicarea caspazelor) și expun PS ei înșiși. Cu toate acestea, formele de viață amastigote intracelulare obligatorii expun PS pe suprafața lor, permițându-le să intre eficient în celulele gazdă. Acum am evaluat dacă anticorpii PL induși artificial sunt capabili să recunoască paraziții Leishmania și dacă aceștia sunt activi funcțional pentru a facilita intrarea paraziților în celulele gazdă relevante. Am observat că anticorpii anti-fosfolipidici murini și umani leagă formele de viață ale Leishmania. Folosind diferite abordări, am identificatreactiv încrucișatanticorpi din serul PL care pare să se lege preferenţial de fosfolipidele de suprafaţă ale L. major. Interesant, deși paraziții promastigoți exprimă și aceste fosfolipide așa cum s-a demonstrat folosind antigenul parazit solubil din această formă de viață a parazitului într-un ELISA, fosfolipidele de suprafață par să fie expuse mai puternic pe amastigoți. În plus, am arătat că această opsonizare IgG a fost suficientă pentru a promova absorbția paraziților de către DC. Este important că in vivo, paraziții opsonizați cu PL au indus un rezultat îmbunătățit al bolii, cu volume de leziuni mai mici și rezoluție mai devreme a leziunilor. Astfel, în conformitate cu observațiile anterioare din grupul nostru, din cauza infecției DC intensificate în prezența(reactiv încrucișat)IgG asupra paraziților, a fost indusă o inducție preferențială a celulelor Th1/Tc1 asociată cu un număr scăzut de celule Th2 și Treg și, prin urmare, un rezultat mai bun al bolii.

Fig. 7DC mieloide primare din sângele uman internalizează preferabil paraziții cureactiv încrucișatIgG antifosfolipide legate de suprafața lor. CD1a plus DC uman mieloid a fost izolat din straturile leucoase folosind margele MACS și placat la 2 × 105 celule/mL. Amastigoții izolați de la șoareci µMT au fost incubați cu 5% ser sau 10 µg/mL IVIG înainte de coincubarea cu DC (1:3). După 18 ore, ratele de infecție au fost determinate pe citospinuri prin microscopie cu lumină (n=3, *p mai mic sau egal cu 0,05 și ***p mai mic sau egal cu 0,002 în comparație cu martorii neopsonizati)

Interesant, am descoperit că paraziții opsonizați cu NMS au promovat rezultate mai bune ale bolii în comparație cu paraziții neopsonizați, indicând prezența IgG naturale în NMS care este capabil să recunoască Leishmania. Acest lucru a fost cel mai bine vizibil în IgMi (lipsă de celule B capabile să producă orice IgG) substituită cu NMS. Aici, dimensiunile leziunilor clar mai mari ale șoarecilor IgMi au fost reduse la cele ale șoarecilor C57BL/6 de tip sălbatic (Fig. 5). Cu toate acestea, prezența naturală, Leishmaniareactiv încrucișatIgG a fost observată și la șoarecii de tip sălbatic infectați cu paraziți opsonizați cu NMS, comparativ cu paraziții neopsonizați. Specificitatea acestor IgG naturale în serul murin și uman este neclară până în prezent. Este tentant să speculăm că aceștia sunt, de asemenea, anticorpi care recunosc PS pe suprafețele paraziților, deoarece se leagă de preferință la amastigoți cu o expunere mai mare cunoscută la PS în comparație cu promastigoți.

Am descoperit că serul subiecților de control uman sănătos (dintr-o regiune în care leishmanioza este raportată doar ca o boală de călătorie și fără antecedente de infecție anterioară) conținea, de asemenea, IgG capabile să se lege de amastigoții L. major și să promoveze absorbția crescută a paraziților de către DC. Este important de reținut că IgIV utilizat pentru studiul nostru este preparat în Germania (non-endemică pentru leishmanioză). În mod interesant, IgG umană îmbogățită de la IVIG de la indivizi negativi pentru Leishmania conținea astfel IgG care a fost capabilă să lege atât promastigoți, cât și (probabil datorită expunerii mai mari la PS) L. amastigote majore. În linie, serul pacienților cu APS cu niveluri ridicate de anticorpi antifosfolipidici conținea IgG care se leagă preferabil de amastigoți, mai puțin de promastigoți. Atât IgG din serurile APS, cât și IgG din IVIG au promovat absorbția îmbunătățită a paraziților de către DC umană primară într-un grad comparabil (sau chiar mai bun în cazul serurilor APS care conțin PL) cu IgG derivate din ser imun de la pacienții cu leishmanioză.

În rezumat, datele noastre arată că serurile normale de șoarece, precum și cele umane, chiar și luate de la indivizi niciodată expuși la Leishmania, conțin anticorpi IgG care sunt capabili să se lege de acest parazit, facilitând înghițirea acestuia de către DC și sporind un răspuns imun protector al gazdă. Chiar dacă antigenul (antigenele) Leishmania recunoscut nu este complet clar, o parte din reactivitate poate fi direcționată împotriva fosfolipidelor mai abundente pe amastigot, în comparație cu suprafețele promastigote. Descoperirile noastre pot deschide calea pentru a concepe o terapie mai bună pentru acest parazit și pot servi chiar drept precauție de primă linie pentru persoanele care călătoresc în zonele infectate cu Leishmania.

Mulțumiri

Autorii le mulțumesc sincer lui Mark C. Udey și Philipp von Landenberg pentru discuțiile utile și pentru furnizarea de mostre de pacienți.

Contribuția autorului 

FD, SLK și ST au efectuat experimentele descrise în acest manuscris. ST, AW și EvS au asigurat finanțarea pentru proiect și au supravegheat lucrările. AW și EvS au scris manuscrisul.

Finanțarea

Finanțare cu acces deschis activată și organizată de Projekt DEAL. Studiul a fost susținut de fonduri de la DFG (SFB 490 la EvS și AW și SFB 1292 la EvS, AW și ST) și Centrul de Medicină Moleculară (CMMC) Köln la EvS.

Disponibilitatea datelor și materialelor 

Nu se aplică.

Declarații

Aprobarea etică și acordul de participare

Toate experimentele cu șoareci au fost făcute conform îndrumărilor statului Rhineland Pfalz.

Consimțământ pentru publicare

Toți autorii sunt de acord pentru publicare.

Interese concurente

Autorii nu declară interese concurente.

Acces deschis Acest articol este licențiat în baza unei licențe internaționale Creative Commons Attribution 4.0, care permite utilizarea, partajarea, adaptarea, distribuirea și reproducerea în orice mediu sau format, atâta timp cât acordați credit corespunzător autorului original. (s) și sursa, furnizați un link către licența Creative Commons și indicați dacă s-au făcut modificări. Imaginile sau alte materiale ale terților din acest articol sunt incluse în licența Creative Commons a articolului, cu excepția cazului în care se indică altfel într-o linie de credit a materialului. Dacă materialul nu este inclus în licența Creative Commons a articolului și utilizarea dorită nu este permisă de reglementările legale sau depășește utilizarea permisă, va trebui să obțineți permisiunea direct de la deținătorul drepturilor de autor.

Referințe

1.Burza S, Croft SL, Boelaert M (2018) Leishmaniasis Lancet 392:951–970.

2. von Stebut E, Tenzer S (2018) Leishmanioza cutanată: funcții distincte ale celulelor dendritice și macrofagelor în interacțiunea sistemului imunitar al gazdei cu Leishmania major. Int J Med Microbiol 308:206–214.

3. Sacks D, Noben-Trauth N (2002) Imunologia susceptibilității și rezistenței la Leishmania major la șoareci. Nat Rev Immunol 2:845–858.

4. de Freitas ESR, von Stebut E (2021) Unraveling the role of immune checkpoints in leishmaniasis. Front Immunol 12:620144.

5. Schonlau F, Scharfetter-Kochanek K, Grabbe S, Pietz B, Sorg C, Sunderkotter C (2000) În deficiența experimentală a leishmaniozei CD18 are ca rezultat diseminarea paraziților asociată cu funcțiile macrofage alterate și răspunsul incomplet al celulelor Th1. Eur J Immunol 30: 2729–2740.

6. Woelbing F, Kostka SL, Moelle K, Belkaid Y, Sunderkoetter C, Verbeek S, Waisman A, Nigg AP, Knop J, Udey MC, et al (2006) Absorbția Leishmania major de către celulele dendritice este mediată de receptorii Fcgamma și facilitează dobândirea imunității protectoare. J Exp Med 203:177–188

7. Nagele EP, Han M, Acharya NK, DeMarshall C, Kosciuk MC, Nagele RG (2013) Autoanticorpii IgG naturali sunt abundenți și omniprezent în serurile umane, iar numărul lor este influențat de sexul de vârstă și de boală. PLoS ONE 8:e60726.

8. Lutz HU, Binder CJ, Kaveri S (2009) Autoanticorpi care apar în mod natural în homeostazie și boală. Trends Immunol 30:43–51.

9. Wanderley JL, Barcinski MA (2010) Apoptosis and apoptotic mimicry: the Leishmania connection. Cell Mol Life Sci 67:1653–1659.

10. Waisman A, Croxford AL, Demircik F (2008) Noi instrumente pentru a studia rolul celulelor B în infecțiile cu citomegalovirus. Med Microbiol Immunol 197:145–149

11. Von Stebut E, Ehrchen JM, Belkaid Y, Kostka SL, Molle K, Knop J, Sunderkotter C, Udey MC (2003) Interleukin 1alpha promovează diferențierea Th1 și inhibă progresia bolii la șoarecii BALB/c sensibili la Leishmania. J Exp Med 198:191–199

12. Levine JS, Subang R, Nasr SH, Fournier S, Lajoie G, Wither J, Rauch J (2006) Imunizarea cu o proteină de legare a celulelor apoptotice recapitulează nefrita și apariția secvențială a autoanticorpului lupus eritematos sistemic. J Immunol 177:6504–6516.

13. Wanderley JLM, DaMatta RA, Barcinski MA (2020) Mimetismul apoptotic ca strategie pentru stabilirea infecțiilor parazitare: fosfatidilserina derivată din parazit și gazdă ca moleculă cheie. Cell Commun Signal 18:10.

14.McDonnell T, Wincup C, Buchholz I, Pericleous C, Giles I, Ripoll V, Cohen H, Delcea M, Rahman A (2020) The role of beta-2-glycoprotein I in health and disease associationing structure with function : mai mult decât APS. Blood Rev 39:100610.

15. Dominguez M, Torano A (1999) Opsonofagocitoza mediată de aderență imună: mecanismul infecției cu Leishmania. J Exp Med 189:25–35.

16. Belkaid Y, Hofmann KF, Mendez S, Kamhawi S, Udey MC, Wynn TA, Sacks DL (2001) Rolul interleukinei (IL)-10 în persistența Leishmania major în piele după vindecare și potențialul terapeutic al anticorpului anti-receptor IL-10 pentru vindecarea sterilă. J Exp Med 194:1497–1506.

17. Waisman A, Kraus M, Seagal J, Ghosh S, Melamed D, Song J, Sasaki Y, Classen S, Lutz C, Brombacher F et al (2007) Semnalizarea receptorului celulei IgG1 B este inhibată de CD22 și promovează dezvoltarea Celule B a căror supraviețuire este mai puțin dependentă de Ig{alfa}/{beta}. J Exp Med 204:747–758

18. Panda S, Ding JL (2015) Anticorpii naturali unesc imunitatea înnăscută și adaptativă. J Immunol 194:13–20.

19. Puga I, Cerutti A (2013) Protecție prin IgG naturale: un parteneriat dulce cu lectine solubile face trucul! EMBO J 32:2897–2899.

20. Duncan AR, Winter G (1988) Locul de legare pentru C1q pe IgG. Nature 332:738–740.

21. Panda S, Zhang J, Tan NS, Ho B, Ding JL (2013) Anticorpii IgG naturali oferă protecție înnăscută împotriva bacteriilor opsonizate de colon. EMBO J 32:2905–2919.

22. El-Hani C, Borges V, Wanderley JL, Barcinski M (2012) Apoptosis and apoptotic mimicry in Leishmania: an evolutionary perspective. Front Cell Infect Microbiol 2:96.

Pentru mai multe informații, vă rugăm să ne contactați la:david.deng@wecistanche.com tel:0013632399501