Conjugatul dendrimer-tesaglitazar induce o schimbare a fenotipului microgliei și îmbunătățește fagocitoza amiloidㆠPartea 3

D-Tesa a crescut expresia enzimelor responsabile pentru îndepărtarea proteinelor patogene

Enzima de degradare a insulinei (Ide) și metaloproteaza matricială 9 (MMP9) sunt enzime secretate de microglia care degradează -amiloidul extracelular și -sinucleina.71,72 Tratamentul cu D-Tesa a crescut semnificativ expresia Ide de 3.1-ori (p < 0.001) cu o tendință de creștere a expresiei MMP9 (1.8-creștere de ori, p=0.057) în comparație cu controalele tratate numai cu LPS (Fig. 6A și B).

În ultimii ani, tot mai multe studii au arătat că există o legătură strânsă între enzimele care degradează insulină și memorie. Această descoperire ne oferă indicii valoroase pentru a explora în continuare mecanismul de formare și întreținere a memoriei.

Enzima de degradare a insulinei este o enzimă importantă, a cărei funcție principală este de a descompune insulina pentru a menține echilibrul zahărului din sânge. Cu toate acestea, studiile recente au arătat că enzima degradantă a insulinei nu numai că joacă un rol metabolic, dar afectează în mod direct creșterea și repararea neuronilor în creier și joacă un rol important în menținerea memoriei.

Multe studii au arătat că cu cât nivelul enzimei de degradare a insulinei este mai mare, cu atât memoria este mai bună. Acest lucru se datorează faptului că enzimele care degradează insulină pot promova creșterea și repararea neuronilor, îmbunătățind astfel capacitatea de învățare și memorie a creierului. În plus, enzimele care degradează insulină pot promova, de asemenea, conexiunea dintre neuroni, sporind astfel asocierea și păstrarea memoriei.

Rolul important al enzimelor de degradare a insulinei în memorie a fost utilizat pe scară largă în domeniul medicinei clinice. Cercetătorii au descoperit că prin inhalarea enzimelor care degradează insulină nu numai că poate fi îmbunătățită memoria, dar și capacitatea cognitivă și simptomele depresive pot fi îmbunătățite.

Pe scurt, legătura dintre enzimele care degradează insulină și memorie este un domeniu foarte important, care ne oferă indicii valoroase pentru a studia mecanismul biologic al memoriei. Cercetările viitoare vor explora în continuare funcția și rolul enzimelor de degradare a insulinei, ne vor ajuta să înțelegem mai bine mecanismul de formare și stocare a memoriei și să ofere o bază mai bună pentru îmbunătățirea capacității de învățare și memorie a creierului uman. Se poate observa că trebuie să îmbunătățim memoria, iar Cistanche poate îmbunătăți semnificativ memoria deoarece Cistanche poate regla și echilibrul neurotransmițătorilor, cum ar fi creșterea nivelurilor de acetilcolină și a factorilor de creștere, care sunt foarte importanți pentru memorie și învățare. În plus, Cistanche poate, de asemenea, să îmbunătățească fluxul sanguin și să promoveze livrarea de oxigen, ceea ce poate asigura că creierul obține suficientă nutriție și energie, îmbunătățind astfel vitalitatea și rezistența creierului.

Faceți clic pe cunoașteți modalități de a vă îmbunătăți memoria

Free Tesa a crescut semnificativ expresia lui Ide 2-fold (p=0,011) și a crescut nesemnificativ MMP92-fold (p=0.35) (Fig. 6A și B). Microglia M2 în bolile neurodegenerative poate elimina -amiloid, -sinucleina și alte proteine ​​patogene prin degradare enzimatică sau fagocitoză, iar D-Tesa reglează în creștere proteinele implicate în aceste procese (adică Ide și MMP9).71–73.

Ideexpresia este reglată în jos în patologia AD și PD și se știe că este reglată în sus de agoniștii PPAR, ceea ce este în concordanță cu rezultatele noastre.

71,72 Din punct de vedere funcțional, s-a demonstrat că doar o creștere de 2-ori a nivelurilor de Ide scade acumularea de amiloid și moartea neuronală in vivo.74,75 Prin urmare, creșterea de 3-ori a Ide observată de D-Tesa și Creșterea de 2-ori a Ide de către freeTesa ar putea fi eficientă din punct de vedere terapeutic in vivo.

D-Tesa crește fagocitoza amiloidului

CD36 este un receptor scavenger microglial care facilitează fagocitoza și degradarea -amiloidului.73 Reglarea sa în jos în AD are ca rezultat scăderea eliminării -amiloidului, dar este suprareglată de activarea PPAR.

Atât D-Tesa, cât și Tesa liberă au crescut semnificativ nivelurile de expresie CD36 în comparație cu celulele expuse numai la LPS (p < 0.0001 față de p < 0,005 pentru D-Tesa și Tesa liberă , respectiv), dar D-Tesa a fost mult mai eficient decât Tesa liber (creștere de 6-ori față de 2,8-creștere de ori pentru D-Tesa și, respectiv, Tesa liberă, p < 0,0005) (Fig. 6C) ).

Rezultatele noastre sunt în concordanță cu studiile anterioare cu pioglitazonă (alt Agonistpar) care au arătat că creșterea fagocitozei microgliale a -miloidului are loc printr -un PPAR și CD 36- mecanism dependent.73

Pentru a investiga dacă suprareglarea CD36 din tratamentul cu D-Tesa s-a corelat cu capacitatea fagocitară crescută a acestor celule, am efectuat un test de fagocitoză funcțională a amiloidului. 73

Pe scurt, după tratarea celulelor așa cum am făcut-o în testele in vitro anterioare, am aplicat celulelor marcate fluorescent -amyloid1-42 timp de două ore, am spălat celulele și apoi am efectuat citometrie în flux pentru a investiga gradul de absorbție celulară a -amiloidului. D-Tesa a crescut atât procentul de celule care au fagocitat -amiloid, cât și cantitatea medie de -amiloid internalizat per celulă (Fig. 7A și B).

În schimb, Tesa liber nu a adus nicio îmbunătățire a fagocitozei amiloidului. Efectele superioare ale D-Tesa în comparație cu Tesa sunt probabil atribuite unei internalizări celulare îmbunătățite, permisă de conjugarea dendrimerului.

Acest lucru este în concordanță cu lucrările anterioare care au demonstrat că peste 95% dintre celulele BV2 tratate cu G4-PAMAM-OH marcat fluorescent au interiorizat dendrimerul în treizeci de minute și au continuat să internalizeze dendrimerul timp de cel puțin 24 de ore.76

De asemenea, conjugarea moleculei mici de minociclină cu G4-PAMAM-OH marcat fluorescent a demonstrat că 99% dintre celulele BV2 au internalizat conjugatul dendrimer-medicament marcat fluorescent în decurs de 3 ore. la medicamentul gratuit după tratarea celulelor BV2 cu LPS, în concordanță cu rezultatele noastre.

Celulele tratate cu D-Tesafagocitoza au fost de 1,9-ori mai mult -amiloid decât celulele de control tratate cu LPS (p < 0,001), ceea ce este comparabil cu creșterea de 2,5-ori a -fagocitoza amiloidului de către celulele microgliale primare de șobolan tratate cu pioglitazonă raportată de Yamanaka și colab.73. Gradul ușor mai mare al fagocitozei amiloidului din studiul anterior ar putea fi fie pentru că nu și-au co-tratat celulele cu LPS așa cum am făcut noi, fie pentru că microglia primară exprimă PPAR. un nivel mai ridicat decât celulele BV2 utilizate în acest studiu.77

Ca atare, o doză de D-Tesa mai mică decât cea estimată din experimentele in vitro din studiul nostru poate fi probabil eficientă în studiile in vivo și la oameni, deoarece celulele BV2 sunt cunoscute că exprimă PPAR la niveluri mai mici decât microglia primară.77

Microglia a fost implicată în multe neurodegenerativatezease, iar BBB a împiedicat multe medicamente care potmodifica fenotipul microgliei de la un fenotip M1 neurotoxic pro-inflamator la un nivel antiinflamator, neuroprotectiv M2, de la atingerea nivelurilor terapeutice în creier.5,6 14,15

De exemplu, doi agoniști PPAR, pioglitazona și rosiglitazona, au fost investigați fiecare prin studii clinice de fază III pentru boala Alzheimer, datorită capacității lor de a modifica fenotipul microgliei, dar nu au reușit probabil din cauza transportului deficitar în BBB.13,14 Astfel, există un interes clinic care modifică fenotipul microgliei în bolile neurodegenerative.

O astfel de abordare necesită livrarea medicamentului către microglia la niveluri suficiente pentru a determina un răspuns. În acest scop, s-a demonstrat că dendrimerii G4-OH-PAMAM livrează medicamente la microglia în multe modele animale după injectare sistemică și, ca urmare, sunt în prezent evaluați în studii clinice pentru tratamentul ccTLD (NCT03500627) și COVID sever. -19 inflamație asociată (NCT04458298).18–28

Pentru a combina efectele benefice ale modificării fenotipului microglial cu capacitatea de a administra medicamente în microglia, am conjugat tesaglitazar (un PPAR / agonist dublu) la un G4-OH-PAMAMdendrimer (Fig. 1-3). Am demonstrat că D-Tesa este capabilă să modifice fenotipul microgliei M1 către un fenotip M2 (Fig. 4 și 5), ducând la o scădere a secreției de specii reactive de oxigen dăunătoare.

Mai mult, am demonstrat că microglia tratată cu D-Tesa își mărește expresia enzimelor care degradează proteinele patologice cum ar fi -sinucleina și -amiloid, precum și reglarea fagocitozei -amiloidului într-un test funcțional (Fig. 6 și 7).

Deși nu prezentăm date care să demonstreze capacitatea D-Tesa de a ocoli BBB și de a se acumula în microglia, am arătat anterior că conjugatele de medicamente G{4-OH-PAMAM cu încărcare, dimensiune și potențial zeta similare sunt capabile să treacă prin afectarea BBB și acumularea de inmicroglie după administrare intravenoasă.26,36,52

Aceste rezultate sprijină dezvoltarea în continuare a D-Tesa pentru tratamentul bolilor neurologice multiple. În timp ce ne concentrăm pe bolile Alzheimer și Parkinson în această lucrare, D-Tesa are potențialul de traducere clinică în multiple tulburări neurologice. Datorită rolului similar al microgliei în patologia bolilor neurodegenerative multiple, agonistul PPAR pioglitazona a fost, de asemenea, investigat și este în prezent investigat în studiile clinice de fază II pentru boala Parkinson, 78 SLA, 79 adrenomieloneuropatie (NCT03864523), scleroza multiplă (NCT03864523) și 092ma881. rezoluție în hemoragia intracerebrală (NCT00827892).

Dacă aceste studii clinice eșuează și din cauza eliberării slabe a pioglitazonei în BBB, D-Tesa ar putea depăși acest obstacol de livrare și ar putea trata pacienții cu aceste boli.

Alte grupuri au folosit nanoparticule pentru a îmbunătăți livrarea agoniştilor PPAR către macrofage, dar nu au încercat să livreze acești agonişti la microglia. Osinski și colab. au demonstrat că lipozomii încărcați cu Tesa au fost absorbiți în mare parte de macrofage în grăsimea albă viscerală într-un model de obezitate masculină cu deficit de leptină.80

În plus, ei au demonstrat că lipozomii încărcați cu Tesa nu au modificat expresia markerului M1 Mcp-1, dar au crescut expresia markerului M2 Arg1, în timp ce tratamentul cu Tesa liber a scăzut numărul total de macrofage M1 și expresia Mcp{{6} }}, și nu a crescut expresia lui Arg1.

Nakashiro și colab. au folosit nanoparticule de poli(acid lactic-co-glicolic) (PLGA) pentru a furniza pioglitazonă (un agonist PPAR) macrofagelor în contextul aterosclerozei.81

In vivo, ei au demonstrat că PLGA-pioglitazona a redus nivelul celulelor imune din sânge. În macrofagele derivate din măduva osoasă primare tratate cu LPS și interferon-, ei au descoperit că PLGA-pioglitazona a crescut IL-4 și IL{-10 (markeri M2) și nu a scăzut nivelul IL-6 sau TNF.

Descoperirile lor sunt similare cu ale noastre; Markerii M2 au fost măriți prin tratamentul cu nanoparticule-agonist PPAR, în timp ce nivelurile IL-6și TNF- nu au scăzut. Di Mascolo și colab. au folosit nanoparticule de alcool polivinilic-PLGA pentru a elibera rosiglitazonă (un alt agonist PPAR).82

In vitro au demonstrat că complecșii lor nanoparticule-medicament au scăzut expresia iNOS, TNF- și IL-1 în macrofagele derivate din măduva osoasă. Ei și-au pretratat celulele cu medicamentul din nanoparticule înainte de a stimula cu LPS, în timp ce noi am pretratat celulele cu LPS înainte de a trata cu D-Tesa, ceea ce ar putea fi un motiv pentru care nu am observat o scădere a TNF- și IL-1, deși am observat, de asemenea, adecrea în expresia iNOS.

Concluzie

În prezent, nu există o terapie de modificare a patologiei pentru multe boli neurodegenerative, iar pe măsură ce populația continuă să se facă, prevalența și costul tratării acestor boli vor continua să crească, subliniind nevoia urgentă a unei soluții pentru a se dezvălui. Recent, microglia M1 proinflamatoare este critică în patologia bolilor neurodegenerative multiple.

Ulterior, capacitatea de a elibera un medicament prin bariera hemato-encefalică care poate induce o schimbare a fenotipului „M1 la M2” în microglia are potențiale terapeutice multiple boli, în special boala Alzheimer și boala Parkinson.

D-Tesa a fost conceput pentru a furniza microgliei un medicament care induce „M1 la M2” după administrare sistemică, pentru a reduce secreția microglială a substanțelor neurotoxice, inducând în același timp o stare antiinflamatoare care crește degradarea și fagocitoza proteinelor patogene din creier. Am sintetizat cu succes D-Tesa folosind o abordare chimică prin clic extrem de eficientă.

Medicamentul este atașat de dendrimer printr-o legătură esterică care poate fi scindată intracelular în condiții lizozomale, aproximativ 60% din Tesa fiind eliberat în primele 48 de ore în condiții lizozomale.

S-a demonstrat că D-Tesa este superior Tesa in vitro în ceea ce privește inducerea unei schimbări fenotipului M1 la M2a/M2b/M2c, ceea ce a dus la o reducere a secreției de oxid nitric, o expresie crescută a enzimelor degradante -sinucleină și -amiloid și creșterea fagocitozei -amiloidului.

Astfel, D-Tesa combină proprietățile benefice de livrare ale dendrimerului, cu proprietățile de comutare M1 la M2 ale Tesa. Datorită rolului comun al microgliei și beneficiului terapeutic comun de a induce o schimbare a fenotipului M1 la M2, D-Tesa are potențialul de a trata multe tulburări neurologice atunci când este administrat în stadiul corect al progresiei bolii.

Contribuții ale autorului

LD, AS, KL, RS, SK și RMK au conceptualizat experimentele. LD, AS și RS au efectuat sinteza și caracterizarea conjugatului dendrimer-medicament. LD, KL și JJ au efectuat experimentele cu celule. LD și K. L. a efectuat statisticile. LD și AS au scris manuscrisul, iar toți autorii au editat manuscrisul.

Conflicte de interese

RMK și SK sunt co-inventatorii utilizării dendrimerului terminat cu hidroxil pentru livrarea direcționată către microglia în boli neurologice, precum și brevete legate de tehnologia dendrimerului descrisă în această lucrare.

Aceștia sunt co-fondatori ai TheAshvattha Therapeutics, Orpheris Inc. și Rinisight Inc., care sunt companii care conduc dezvoltarea clinică a platformei. SK și RMK sunt membri ai Consiliului de administrație al AshvatthaTherapeutics Inc. RS este în prezent angajat de AshvatthaTherapeutics și deține acțiuni în companie; lucrul. S. efectuat pentru această lucrare a fost făcut înainte de a intra în Ashvattha. Conflictul de interese este gestionat de Universitatea Johnshopkins.

Mulțumiri

Am dori să mulțumim lui Elizabeth Smith Khoury pentru discuțiile utile despre experimentele in vitro. Acest proiect a fost finanțat de Patz Distinguished Professorship Endowment de la JohnsHopkins și NICHD (număr de grant HD076901) (RMK). Mulțumim Grantului de bază Wilmer pentru cercetarea vederii, microscopul și modulul de bază (numărul de grant EY001865) pentru accesul la citometrul de flux Sony.

Mulțumim Artelor medicale Servier pentru utilizarea colecției lor de imagini (http://smart.servier.com/) care este pe care a fost orientat sub o atribuție comună creativă 3. 0 GenericLicense, care a fost modificată pentru a face rezumatul grafic.

Referințe

1 Cl Gooch, E. Pracht și Ar Borenstein, The Burden of Neurological Boxs in the United: A SummaryReport și Call to Action, Ann. Neurol., 2017, 81, 479–484.

2 JL Cummings, T. Morstorf și K. Zhong, conducta de dezvoltare a medicamentelor pentru boala Alzheimer: puțini candidați, eșecuri frecvente, Alzheimer Res. Ther., 2014, 6, 37.

3 P.-P. Liu, Y. Xie, X.-Y. Meng și J.-S. Kang, Istoria și progresul ipotezelor și studiilor clinice pentru boala Alzheimer, Signal Transduction Targeted Ther., 2019, 4, 1–22.

4 C. Soto și S. Pritzkow, Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases, Nat. Neurosci., 2018, 21, 1332–1340.

5 VH Perry și C. Holmes, Primul microglial în boala neurodegenerativă, Nat. Rev. Neurol., 2014, 10, 217–224.

6 Y. Tang și W. Le, Roluri diferențiate ale M1 și M2Microglia în bolile neurodegenerative, Mol. Neurobiol.,2016, 53, 1181–1194.

7 MW Salter și B. Stevens, Microglia apar ca actori centrali în bolile creierului, Nat. Med., 2017, 23, 1018–1027.

8 S. Krasemann, et al., The TREM2-APOE Pathway Drives thetranscriptional Phenotype of Dysfunctional Microglia in Neurodegenerative Diseases, Immunity, 2017, 47, 566–581.e9.

9 Q. Zhao, et al., Efectele de tip antidepresiv ale pioglitazonei într-un model de șoarece cu stres cronic ușor sunt asociate cu alterarea mediată de PPAR a fenotipurilor de activare microglială, J. Neuroinflammation, 2016, 13, 259.

10 L. Wen, și colab., Polarization of Microglia to the M2 Phenotype in a Peroxisome Proliferator-Activated ReceptorGamma-Dependent Manner Attenuates Axonal InjuryInduced by Traumatic Brain Injury la șoareci, J. Neurotrauma, 2018, 35, 23030–23030.

11 W. Cai, et al., Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR): A master gatekeeper in CNS injury and repair, Prog. Neurobiol., 2018, 163–164, 27–58.12 B. Brakedal, et al., Utilizarea glitazonei asociată cu risc redus de boala Parkinson, Mov. Disord., 2017, 32, 1594–1599.

For more information:1950477648nn@gmail.com