Cum reduce extractul de Cistanche hiperplazia inflamatorie

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Reducerea hiperplaziei inflamatorii la nivelul intestinului la șoarecii predispuși la cancer de colon prin extract de apă de Cistanche deserticola

Yamin Jia, 1,2 şi colab

Cistanchedeserticola a fost folosită în mod obișnuit în medicina tradițională chineză pentru a trata multe probleme de sănătate, inclusiv sindromul intestinului iritabil sau constipația. Acest studiu a fost conceput pentru a testa eficacitatea unui extract de apă de C. deserticola în prevenirea cancerului colorectal la un model de șoarece. Extractul apos bogat în polizaharide de C. deserticola a fost preparat prin fierberea pulberii sale de tulpină în apă distilată. Șoarecii Tgfb1Rag2 nul au fost utilizați ca model experimental. Aici am arătat că hrănirea cu extract de apă de C. deserticola a redus semnificativ numărul de mucoasehiperplazieși infecția intestinală cu Helicobacter la șoareci. Acest efect benefic s-a corelat cu stimularea semnificativă a sistemului imunitar, evidențiată de mărirea splinei cu un număr crescut de macrofage splenice și celule natural killer și cu citotoxicitate mai puternică a splenocitelor. Extractul apos in vitro de C. deserticola a sporit citotoxicitatea splenocitelor naive împotriva unei linii celulare de cancer de colon uman, iar în culturile de macrofage a reglat în sus expresia oxidului nitric sintaza II și a stimulat fagocitoza. În concluzie, datele noastre indică faptul că administrarea orală a extractului de C. deserticola reduceinflamatorhiperplazicpolipii și infecția cu helicobacter la șoareci prin activitatea sa imunostimulatoare, sugerând că extractul de C. deserticola poate avea potențialul de a preveni tulburările inflamatorii intestinale, inclusiv cancerul colorectal. Copyright © 2011 John Wiley & Sons, Ltd.

Cuvinte cheie: imunomodularea pe bază de plante;Cistancheextrage; polizaharide; helicobacter;inflamatorhiperplazie; cancer colorectal.

Cistancheextragepoate reduceInflamatorhiperplazie

INTRODUCERE

Cancerul colorectal este al treilea cel mai frecvent cancer la bărbați și al doilea la femei la nivel mondial și ocupă a patra cea mai frecventă cauză de deces prin cancer (8% din totalul deceselor cauzate de cancer; Ferlay și colab., 2010). Studiile epidemiologice sugerează că mulți factori de risc asociați cu această boală, inclusiv factori genetici (de exemplu, antecedente familiale de cancer de colon) (Strate și Syngal, 2005) și factori dietetici (de exemplu, carne roșie și conținut scăzut de fibre; Chao și colab., 2005; Park et al., 2005). al., 2005) șiinflamatorboli ale intestinului (IBD; Eaden et al., 2001; von Roon et al., 2007; Lukas, 2010). Până în prezent, în ciuda numeroaselor noi medicamente citotoxice și a tehnicilor chirurgicale și radioterapeutice îmbunătățite care sunt utilizate pentru tratamentul acestei boli (Cunningham și colab., 2010), o mare parte a pacienților cu cancer colorectal rămân încă incurabili; aproximativ 608000 de decese din cauza acestei boli sunt estimate la nivel mondial în 2008 (Ferlay et al., 2010). Prin urmare, sunt necesare terapii noi, iar un candidat este imunoterapia. Au fost evaluate diverse abordări imunoterapeutice pentru tratamentul cancerului colorectal, iar rezultatele de până acum sunt încurajatoare (Burgdorf et al., 2009). S-a demonstrat că polizaharidele din plante au activități imunoreglatoare specifice (Jiang et al., 2010), sugerând că aceste produse din plante ar putea fi utilizate ca adjuvant imunostimulator specific împotriva cancerului colorectal.

Cistanchedeserticola Ma, cunoscut sub numele de Rou Cong Rong în medicina chineză cu plante medicinale, a fost inclus în formulele pe bază de plante pentru multe probleme de sănătate, inclusiv impotență, leucoree morbidă și sindromul intestinului iritabil/constipație (Jiang și Tu, 2009). Studiile experimentale au relevat diferite activități biologice ale diferitelor extracte de C. deserticola; extractul de glicozide feniletanoide din această plantă are activitate antioboseală la șoareci (Cai și colab., 2010) și analgezic și anti-inflamatorefecte la rozătoare (Lin et al., 2002), în timp ce polizaharidele sale stimulează proliferarea limfocitelor T și B în culturile de limfocite (Wu și colab., 2005; Dong și colab., 2007). Cu toate acestea, eficacitatea extractului de polizaharide din C. deserticola în stimularea răspunsului imun in vivo nu a fost încă examinată.

cârpă2^-/-șoarecii nu au limfocite T și B mature, iar pe fundal mixt (~97% 129 S6 și ~3% CF-1) dezvoltă spontan inflamație asociatăhiperplazieîn intestin (Engle et al., 1999). Introducerea genetică a alelei nule Tgfb1 (gena factorului de creștere transformator b1 (TGF-b1)) la această tulpină de șoareci duce la progresia ulterioară ahiperplaziela adenom și carcinom (Engle et al., 2002), iar colita patogenă dependentă de microfloră este necesară pentru dezvoltarea cancerului de colon (Engle et al., 2002), sugerând că această tulpină de șoareci oferă un model ideal pentru examinarea unei terapii potențiale în tratamentul cancerului colorectal indus de inflamație/IBD. În acest studiu, demonstrăm pentru prima dată eficacitatea extractului apos bogat în polizaharide de C. deserticola în reducereainflamatorhiperplaziein acest model.

MATERIALE ȘI METODE

Extract apos bogat in polizaharide din preparat de C. deserticola.

Herbal C. deserticola a fost recoltat de Dr. Y. Guo (China Agricultural University) în regiunea autonomă Inner Mongolia, China. Pulberea de tulpini întregi uscate (300 g) a fost fiertă în apă dublu distilată de două ori: mai întâi timp de 1 oră în 500 ml apă, urmată de o colectare a supernatantului, apoi timp de 45 min în 400 ml apă. Supernatanții au fost filtrati printr-o hârtie de filtru Whatman (mediu rapidă) după fiecare timp de fierbere și s-au amestecat împreună. Soluţia de extract a fost uscată prin liofilizare şi a fost menţinută la 80°C. Produsul final a fost de aproximativ 10 g (randament: ~3 procente).

Șoareci și culturi celulare. Șoareci cu deficit de TGF-b1 (Tgfb1 plus/- Rag2^-/-) pe fundal mixt (~97% 129 S6 și ~3% CF-1) au fost primite dintr-o colonie de reproducție menținută în condiții libere de patogeni în unitatea de animale de la Centrul de Cercetare Jack Bell (Vancouver, BC). Acești șoareci provin din Repositoryul Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) (Institutul Național al Cancerului din Frederick, MD, SUA). Șoarecii C57BL/6 J (B6) (masculi, 8-10 săptămâni) au fost achiziționați de la Laboratorul Jackson (Bar Harbor, ME, SUA). Toate animalele pentru experimente au fost ținute în adăpostire și dietă convențională (5001 Rodent Diet, LabDiet) după înțărcare la vârsta de 4 săptămâni, iar tratamentul pe bază de plante și recoltarea de probe au fost efectuate în conformitate cu ghidurile Consiliului Canadien pentru Îngrijirea Animalelor, conform
protocoale aprobate de Subcomitetul pentru uzul animalelor de la Universitatea British Columbia.

Atât linia celulară de adenocarcinom de colon uman SW480, cât și linia celulară de macrofage leucemice de șoarece RAW 246.7 au fost crescute în mediu Eagle's modificat de Dulbecco (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) care conține 10 procente fetale bovine ser (FBS) (mediu DMEM complet) la 37-C într-un incubator umidificat cu 5% CO2/95% aer. Splenocitele au fost izolate prin spargerea ușoară a fragmentelor de splină în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS), urmată de îndepărtarea eritrocitelor folosind tampon de liză (0.15 M NH4Cl, 1.0 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA, pH 6.8). După spălare din nou cu PBS, splenocitele au fost suspendate în mediu RPMI 1640 suplimentat cu 10% FBS (mediu RPMI complet).

Cistancheextragepoate reduceInflamatorhiperplazie

Tratamentul cu extract.

Extractul din plante, numitCistancheextrageîn acest studiu, a fost în cele din urmă preparat prin reconstituirea pulberii uscate cu apă dublu distilată sterilizată și a conținut 2-3 procente (g/g) de feniletanoizi, 65–70 procente (g/g) de polizaharide și 0.6–1 procente (g/g) de proteine ​​pe baza următoarelor teste: numărul de feniletanoizi a fost determinat prin absorbanță la 332 nm utilizând o spectrofotometrie descrisă anterior (Ouyang și colab., 2005); conținutul de polizaharide a fost măsurat folosind o metodă standard de acid fenol sulfuric (Dubois și colab., 1956) după precipitarea cu etanol; iar proteina a fost determinată prin testul de proteine ​​Bio-Rad urmând protocolul producătorului (Bio-Rad Lab, Hercules, CA, SUA). Doza de extract de Cistanche a fost de 0,4 g/kg/zi pe baza studiului nostru pilot. Aportul mediu de apă per șoarece adult pe zi a fost de aproximativ 4 ml, iar dacă 1 ml de apă de băut conținea 3 mg deCistancheextrage, fiecare șoarece a primit administrare orală de 12 mg de extract pe zi. Pe baza faptului că greutatea corporală medie a unui șoarece adult a fost de 30 g, apa de băut conținea 3 mg/mL deCistancheextragea dat șoarecilor o doză de 0,4 g/kg/zi. Șoarecii au fost tratați dând apă de băut ad labium care conține 3 mg/mL deCistancheextragecare a fost completat cel puțin o dată la două zile, de la vârsta de două luni timp de trei luni într-o cameră convențională a unității de îngrijire a animalelor.

Evaluarea histologică a cancerului colorectal.

La sfârșitul tratamentului de trei luni, atât țesuturile intestinale subțiri, cât și cele mari au fost recoltate și deschise longitudinal, urmate de spălarea ușoară a conținutului cu PBS. Un total de șase bucăți (fiecare cu lungimea de 2 cm) de țesut intestinal de la fiecare șoarece au fost colectate: trei din intestinul subțire în locațiile proximale, mijlocii și distale; două din intestinul gros în locațiile proximale și distale și una din cecum. Toate țesuturile au fost fixate în formol 10% și încorporate în parafină. Fiecare secțiune a fost colorată cu hematoxilină și eozină (HE) pentru gradarea histologică a cancerului colorectal. Clasificarea bolii a fost efectuată în funcție de caracterele patologice alehiperplazie, adenom sau carcinom în fiecare probă, așa cum s-a descris anterior (Engle și colab., 1999) într-un mod de testare oarbă. Numărul total al fiecărei modificări patologice (hiperplazie, adenom și carcinom) au fost numărate în două secțiuni ale țesutului intestinal pentru fiecare șoarece.

Cistancheextragepoate reduceInflamatorhiperplazie

Detectarea Helicobacter hepaticus (H. hepaticus) în fecalele de șoarece.

Pentru a examina efectulCistancheextrageasupra creșterii microflorei patologice în intestin, H. hepaticus în materiile fecale a fost determinată prin reacția în lanț a polimerazei (PCR) cu primeri 16S rDNA specifici speciei, așa cum a fost descris anterior (Shames și colab., 1995). Aproximativ 200 mg de fecale proaspete au fost dizolvate în 1 μL de PBS și incubate la 50 grade timp de 30 de minute, urmate de centrifugare la 8000 rpm timp de 10 minute. Supernatantul (200 ml) a fost colectat și amestecat cu o cantitate egală de soluție de proteinază K care conține 5 procente (v/v) de 18,7 mg/ml soluție de proteinază K (Fermentas Canada, Burlington, ON, Canada) într-un tampon de digerare (50 ml). μM Tris–HCl, pH 8,0, 0,1 M EDTA, 0,5% dodecil sulfat de sodiu) și incubat la 70 °C timp de 30 de minute. ADN-ul din soluția rezultată a fost extras folosind kitul QIAprep Miniprep urmând protocolul producătorului (QIAGEN, Mississauga, ON, Canada).
Amplificarea prin reacție în lanț a polimerazei a ADN-ului bacterian a fost efectuată într-un amestec care conține {{0}},75 μL de 10 tampon PCR, 0,5μL de 50 mM MgCl2, 0,5 μL din fiecare primer (sens: 5'-GCA TTT GAA ACT GTT ACT CTG; anti-sens: 5'-GGG GAGCUUGAAAACAG, 100 mM fiecare), 0,5 μL polimerază Taq, 18,75 μL H2O fără nuclează 1μL de soluție de ADN fecal necuantificat. Amestecul PCR a fost încălzit la 94 de grade timp de 5 minute, urmat de 40 de cicluri de denaturare la 94 de grade timp de 1 min, recoacere la 55 de grade timp de 1,25 min și extensie la 72 de grade timp de 1,5 min. PCR a fost încheiată printr-o etapă de alungire de 10 minute la 72 de grade. Produsul PCR rezultat (25 μL) a fost supus electroforezei pe un gel de agaroză 1% în tampon Tris-acetat-EDTA (TAE) care conține 0,5 mg/mL de bromură de etidio și vizualizat sub lumină UV.

Determinarea macrofagelor și a celulelor natural killer (NK).

Procentele de macrofage și celule NK în suspensie de splenocite au fost determinate prin analiza de sortare a celulelor activate prin fluorescență (FACS). Un milion de splenocite în tampon FACS au fost incubate cu o combinație adecvată de anticorpi pentru diferite fenotipuri de celule în gheață: izotiocianat de fluoresceină anti-CD3-(FITC) și anti-CD49b-ficoeritrină (PE) (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canada) pentru CD3 CD49b plus celule NK și anti-șoarece F4/80 plus ca anticorp primar și IgG-FITC anti-șobolan ca anticorp secundar (eBioscience, San Diego, CA, SUA) pentru F4/80 plus macrofage. Intensitatea fluorescenței pentru fiecare tip de celulă a fost măsurată utilizând citometria în flux și analizată prin comparație cu controalele de fond folosind software-ul CELLQUEST (BD Biosciences).

Testul de citotoxicitate calcein-acetoximetil (calcein-AM).

Activitatea litică a splenocitelor efectoare împotriva celulelor țintă SW480 a fost evaluată prin testul de citotoxicitate cu calceină-AM utilizând un sistem de cocultură așa cum a fost descris anterior (Neri și colab., 2001). Pe scurt, celulele SW480 au fost marcate cu colorant fluorescent calcein-AM după cum urmează: 1 x10⁶celule/mL de celule SW480 în mediu DMEM complet au fost incubate cu 15 μM calceină-AM la 37 de grade cu agitare ocazională. După 30 de minute de incubare, celulele au fost spălate extensiv cu un mediu DMEM complet pentru a îndepărta colorantul extracelular. Celulele SW480 marcate cu colorant fluorescent în mediu DMEM complet (0,2 x 10⁶celule/{{0}}.25 mL/godeu) au fost însămânțate în 24-plăci de godeuri. Pe baza diferitelor rapoarte (12:1, 6:1, 3:1 și 1,5:1) de E (efector): T (țintă), splenocite în 0,25 mL de mediu RPMI complet per godeu au fost adăugate în godeuri cu celule țintă în trei exemplare. Co-culturile au fost incubate la 37 de grade în 5% CO2 timp de 24 de ore. Supernatanții au fost colectați după ce placa a fost rotită la 2000 rpm timp de 5 minute. Eliberarea de Calcein-AM în supernatant a fost determinată utilizând un spectrofluorimetru cu microplăci (Fluoroskan Ascent FL, Thermo Labsystems) la o emisie de 527 nm sub excitare la 485 nm. Celulele țintă, incubate cu un amestec de 0,25 ml de mediu DMEM complet și 0,25 ml de mediu RPMI complet, au fost utilizate ca controale de bază sau cu eliberare spontană și, în prezența a 2 procente, Triton X-100 a fost utilizat ca controale de eliberare maximă. Citotoxicitatea splenocitelor a fost calculată după cum urmează:

Măsurarea oxidului de azot (NO). Oxidul nitric secretat de celule a fost oxidat rapid la nitrit în mediul de cultură. Prin urmare, concentrațiile de nitrați în mediu au fost determinate folosind metoda Griess ca măsurătoare a producției de NO. RAW264.7 celule (0,25 x 10⁶

celule/godeu în 0,5 ml de mediu DMEM complet) în plăci de 24-godeuri au fost stimulate cuCistancheextrage(50–200 mg/mL) și lipopolizaharidă (LPS) (10 ng/mL) ca martor pozitiv. După 24 de ore de tratament, 50 ml de supernatant de cultură au fost mai întâi amestecați cu 50 ml de 1 la sută.
sulfanilamidă în acid fosforic 5% în plăci de godeuri în trei exemplare și au fost incubate timp de 10 min, apoi s-au adăugat 50 ml de diclorhidrat de naftil etilendiamină 0,1% în apă distilată per godeu. Absorbanța a fost citită la 550 nm după incubare timp de 10 minute și nivelul de NO/nitrit a fost calculat utilizând o curbă standard cu concentrații cunoscute de nitrit de sodiu.

Cistancheextragepoate reduceInflamatorhiperplazie

Western blot.

Nivelurile celulare de oxid nitric sintetaza II (NOS 2 sau iNOS) au fost examinate prin Western blot așa cum s-a descris anterior (Du și colab., 2006). Pe scurt, probele de proteine ​​(aproximativ 100 mg/probă) au fost fracţionate cu 7% SDS-PAGE şi au fost transferate pe membrana de nitroceluloză. Benzile proteice NOS II au fost identificate cu anticorp primar policlonal anti-NOS II de iepure (N-20) (diluție 1:500; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, SUA) și anticorp secundar IgG anti-iepure de capră ( diluție 1:10000; Vector Laboratory, Burlingame, CA, SUA). Complexul proteină-anticorp NOS II a fost vizualizat printr-un test de chemiluminiscență îmbunătățită (ECL, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Anglia). Petele au fost resondate folosind IgG anti-b-actină (Sigma-Aldrich Canada, Oakville, ON, Canada) pentru confirmarea proteinei încărcate în fiecare probă.

Testul de fagocitoză. Fagocitoza a fost măsurată prin cantitatea de margele de latex marcate cu fluorescență (SigmaAldrich Canada, L-3030, modificate cu carboxilat, dimensiune medie 2 mm) înghițite de celulele RAW264.7 așa cum a fost descris anterior (Wu și colab., 2{{ 9}}07). Pe scurt, celulele RAW264.7 (0,1 106 celule/0,5 mL/godeu) în mediu DMEM complet au fost însămânțate în plăci de 24-godeuri și stimulate cu 100 mg/mL deCistancheextragesau mediul complet DMEM numai ca control. După stimularea peste noapte, la culturile de macrofage s-au adăugat 2,5 ml de perle de latex fluorescent per godeu și s-au incubat timp de 2 ore. Pentru analiza citometriei în flux, celulele au fost detașate prin pipetare după spălare în PBS, iar intensitatea fluorescenței celulelor fagocitare a fost măsurată cu un citometru în flux și analizată prin comparație cu controalele de fond (fără margele) folosind software-ul CELLQUEST (BD Biosciences).

Analize statistice.

Datele au fost prezentate ca medie plus abaterea standard (SD). Analiza varianței (ANOVA) sau testul t Student a fost efectuată după caz ​​pentru compararea datelor între grupuri. O valoare p de < 0,05="" a="" fost="" considerată="">

REZULTATE

Tratament cuCistancheextragereduce frecventa dehiperplazieși H. hepaticus infecția intestinului În timpul perioadei de tratament (3 luni), greutatea corporală și aportul de apă potabilă au fost monitorizate o dată la 2 zile la șoarecii din grupul tratat cu extract față de grupul tratat cu vehicul, nu a fost nicio diferență semnificativă. notate (datele nu sunt afișate). Analiza histologică a arătat însă că administrarea orală aCistancheextractea redus semnificativ numărul deinflamatorhiperplazieîn intestin (Fig. 1), dovedit de faptul că șoarecii care au primit apă cu extract au avut mai puținehiperplazie(5.00 plus -2,83/mouse, n=15) decât cei care beau apă plată sau vehicul (7,53 plus -3,09/mouse, n {{9) }}) (extract vs. vehicul: p=0.0133, t-test). Diferența dintre numărul de adenom și carcinom între șoarecii tratați cu extract și vehicul nu a fost semnificativă din punct de vedere statistic, deoarece doar câțiva șoareci au avut aceste stadii de modificări patologice (datele nu sunt prezentate).

Figura 1. Reducerea incidenței hiperplaziei prin tratamentul cu extract apos de C. deserticola (Cistancheextrage). Soarecii Tgfb1 plus /-Rag2-/- au fost hrăniți cuCistancheextrageîn apă potabilă (grupul Extract) în comparație cu cei cu apă potabilă simplă (grupul Vehicule). Leziunile canceroase din intestin au fost examinate prin histologie cu o colorare H&E. (A) O imagine tipică a secțiunii de țesut sănătos. (B) O imagine tipică a hiperplaziei în secțiune, indicată de o săgeată. (C) Numărul de hiperplazie din intestinul fiecărui animal a fost numărat prin histologie (p=0.0133, extract versus vehicul, n=15). Această cifră este disponibilă color online la wileyonlinelibrary.com/journal/ptr

Conținutul microbian intestinal, în special infecția cu H. hepaticus, s-a demonstrat a fi necesar pentru dezvoltarea tuturor etapelor cancerului de colon, inclusiv hiperplazia în Rag2.^-/- șoareci (Engle și colab., 2002; Erdman și colab., 2003). Pentru a examina dacă tratamentul cuCistancheextractemicroflora patologică redusă în intestin, prezența H. hepaticus în fecalele de la șoarecii tratați cuCistancheextragea fost determinată prin PCR în comparație cu controalele vehiculului. În fiecare experiment, trei șoareci per cușcă au fost tratați cu extract de Cistanche sau vehicul. Probele de scaun au fost colectate la sfârșitul unei perioade de 14-h peste noapte după curățarea cuștii. După cum se arată în Fig. 2, ADNr-ul H. hepaticus 16S în fecale a fost detectat eficient prin tehnica PCR. În trei experimente separate (Tabelul 1), doar 20-40 la sută din probe dinCistanche-extrageȘoarecii tratați au fost detectați ca fiind pozitivi pentru PCR, în timp ce 60-80% din controalele vehiculului au fost pozitivi (extract vs. vehicul: p=0.0189, test t, n=3), sugerând că tratamentul cu Extractul de Cistanche a redus infecția intestinală cu H. hepaticus la șoareci.

Tratamentul cu extract de Cistanche crește numărul de macrofage splenice și de celule NK

Răspunsul imun joacă un rol cheie în eliminarea infecției cu Helicobacter. Pentru a examina dacăCistanche extragetratamentul a afectat sistemul imunitar la acești șoareci predispuși la cancer de colon, dimensiunea splinei (12 șoareci în fiecare grup) și numărul de splenocite (șase șoareci selectați aleatoriu din fiecare grup) a fost determinat la sfârșitul tratamentului. Au fost cântărite splinele a 12 șoareci din fiecare grup, ceilalți trei șoareci din experimentul inițial nu au fost incluși. După cum este ilustrat în tabelul 2,Cistanche-extrageȘoarecii tratați (0.{055 plus -0,022 g/splină) au fost mai grei decât în ​​grupul vehicul (0,038 plus -0,01 g/splină; extract față de vehicul: p=0.04, t-test). Aceste date au fost susținute în continuare de o creștere a numărului de splenocite la șoarecii tratați cuCistancheextrage, indicat prin 7,095 plus -1,353 (x10⁶ celule/splină) comparativ cu 2,941 plus -1,492 (x10⁶celule/splină) șoareci de control în vehicul (extract vs. vehicul: p=0.002, test t).

Pentru a evalua în continuare dacăCistancheextragetratamentul a afectat un anumit subtip de splenocite la șoareci, numărul de celule NK splenice (CD3^-CD49b^{la care se adauga}celule) și macrofage (FT/80^{la care se adauga}celule) a fost numărat prin analiza FACS. Procentul de CD3^-CD49b^{la care se adauga}celulele din splenocite aleCistanche-extrageșoarecii tratați cu vehicul (32,06 plus -2,13 la sută) nu a fost semnificativ diferit de cel de la șoarecii tratați cu vehicul (28,47 plus -2,74 la sută; extract față de vehicul: p=0). 3741, test t, n=6), dar numărul total de celule NK din splinaCistanche-extrageșoareci tratați (2,22 plus - 0,44x10⁶/splină) a fost mai mare decât acel grup de control în interiorul vehiculului (0,83 plus -0,17x10⁶/splină; extract vs vehicul: p=0.01, t-test, n=6; Fig. 3B). Rezultate similare au fost observate la examinarea celulelor splenice FT/80 plus; ca și în populația de celule NK splenice, diferența dintre procentul de celule splenice FT/80 plus dintre șoarecii tratați cu extract (35,25 plus -7,28 la sută) și șoarecii de control vehicul (31,74 plus -5. 07 la sută ) nu a fost semnificativ (extract vs. vehicul: p=0.407, n{=6), dar numărul total de macrofage splenice din grupul tratat cu extract (2,439 plus -0 .452x10⁶celule/splină) a fost mai mare decât cea din grupurile de control (1,114 plus -0,685x10⁶celule/splină; extract vs. vehicul: p=0.001, t-test, n=6; Fig. 3D). Luate împreună, aceste date sugerează că tratamentul cuCistancheextragepoate crește numărul total, dar nu procentul sau proporția, de subtipuri de splenocite efectoare, celule NK și macrofage din splină.

Figura 3. Creșterea numărului de celule NK splenice și macrofage prin tratamentul cuCistancheextrage. Celulele NK sau macrofagele din suspensie de splenocite au fost determinate prin analiza FACS cu o colorație combinată de anticorp FITC-anti-CD3e și marker de celule APC-anti-CD49b/Pan-NK (pentru celulele NK) sau cu o singură colorare de FITC-anti- FT/80 (pentru macrofage). (A) Un grafic reprezentativ al procentului de celule NK splenice (CD3^-CD49b^{la care se adauga}) în splenocitele șoarecilor tratați cuCistancheextragefață de vehicul. (B) Numărul total de celule NK pe splină. Datele sunt prezentate ca medie plus -SD în fiecare grup (p= 0.01, n= 6). (C) Un grafic reprezentativ al procentului de macrofage splenice (FT/80 plus) din splenocitele șoarecilor tratați cuCistancheextragefață de vehicul. (D) Numărul total de macrofage pe splină. Datele sunt prezentate ca medie plus -SD în fiecare grup (p= 0,001, n=6).

Tratamentul cu extract de Cistanche stimulează citotoxicitatea splenocitelor in vivo și in vitro

Răspunsul imun depindea nu numai de numărul de splenocite, ci și de funcția acestora, cum ar fi citotoxicitatea. EfectulCistancheextragetratamentul asupra funcției splenocitelor (adică citotoxicitatea) a fost examinat în co-culturi cu celule SW480. După cum se arată în Fig. 4A, citotoxicitatea splenocitelor de la șoareci tratați cuCistancheextragea fost mai mare decât cea a celulelor de la șoareci tratați cu vehicul, indicată de 39,38 plus -2,64% din eliberarea de calceină-AM în co-culturi de splenocite tratate cu extract cu celule SW480 la 6 :1 raport, 51,11 plus -2,6 la sută la un raport de 3:1 și 57,33 plus -2,53 la sută la un raport de 1,5:1, în comparație cu 27.75- 0,18 procente în co-culturi de splenocite tratate cu vehicul cu celule SW480 într-un raport de 6:1, 40,97 =-2,85 la sută într-un raport de 3:1 și 45,16 plus -0,18 la sută la un Raport 1,5:1 (extract vs vehicul: p < 0,0001,="" anova="" bidirecțional).="" pentru="" a="" confirma="" în="" continuare="" efectul="" stimulator="">Cistancheextrageasupra citotoxicităţii splenocitelor, citotoxicitatea aCistanche-extrageSplenocitele naive tratate de la șoareci B6, care conțin celule T și B funcționale, au fost examinate în co-culturi cu celule SW480. După cum se arată în Fig. 4B, adăugarea deCistancheextrage(100 mg/mL) a crescut semnificativ eliberarea de calceină-AM în co-culturi într-o manieră dependentă de splenocite: 57,64 plus -3,41 la sută la un raport de 12:1, 52,25 plus { {11}},77% la un raport de 6:1 și 45,72 plus -2,43% la un raport de 3:1, comparativ cu 14,36 plus -0,05% la un raport de 12:1 , 20,67 plus -2,03 la sută la un raport de 6:1 și 23,1 plus -3,73 la sută la un raport de 3:1 în co-culturi nestimulate (extract vs vehicul: p < 0,0001,="" două="" -mod="" anova).="" aceste="" rezultate="" indică="" faptul="">Cistancheextragestimulează activitatea litică a splenocitelor. Motivul pentru care s-a observat mai puțină citotoxicitate atunci când s-au adăugat mai multe splenocite efectoare este necunoscut. O posibilitate a fost ca nivelul de eliberare a calceinei-AM în acest sistem de cocultură ar putea să nu reflecte exact moartea celulei țintă, deoarece calceina-AM ar putea fi reabsorbită de splenocitele efectoare după o perioadă lungă de incubație.

Extractul de Cistanche activează macrofagele

Activarea macrofagelor este unul dintre răspunsurile imune critice împotriva infecției și dezvoltării tumorii (Mantovani și colab., 2002, 2008). Pentru a dezvălui în continuare o perspectivă asupra mecanismelor prin careCistancheextragetratamentul a redus hiperplazia intestinală și conținutul microbian, efectul deCistancheextrageprivind producția de NO și fagocitoza macrofagelor, au fost examinate celule RAW264.7. După cum se arată în Fig. 5A, expresia proteinei NOS II a fost reglată în sus în culturi după incubare cuCistancheextrage. Aceste rezultate au fost susținute în continuare de creșterea producției de NO înExtract de Cistanche stimulatculturi (Fig. 5B), evidențiate de 3,88 plus -0,13 mM de nitriți în 50 mg/mL deCistancheextrageculturi de celule RAW264.7 stimulate în comparație cu 0.11 plus -0.12 mM de nitriți în culturile martor nestimulate (ANOVA unidirecțională, p<>

Fagocitoza este un proces celular de înghițire a particulelor solide, cum ar fi bacteriile. După cum se arată în Fig. 5C și D, adăugarea deCistancheextractea stimulat fagocitoza macrofagelor, așa cum indică mai multe celule fagocitare (9,8 plus -0,1 la sută) care se găsesc înCistanche-extrage-culturi de macrofage stimulate în comparație cu cele (5,2 plus -0,4 la sută) din culturile stimulate de vehicul (extract vs. vehicul: p=0,0007, test t, n=3) după o incubare de 2 ore. Aceste date sugerează căCistancheextragepoate activa direct macrofagele prin reglarea în sus a producției locale de NO și stimularea fagocitozei macrofagelor în intestinul șoarecilor.

DISCUŢIE

Prezentul studiu demonstrează pentru prima dată că administrarea orală aCistancheextragereduce semnificativ frecvența hiperplaziei și infecției cu H. hepaticus în intestinul șoarecilor predispuși la cancer de colon. Efectul benefic alCistancheextragetratamentul este asociat cu o creștere a numărului și citotoxicității celulelor NK splenice și macrofagelor. Adăugarea in vitro deCistancheextragestimulează producția de NO și fagocitoza la macrofage. Rag2 deficit de TGF-b1^-/-S-a demonstrat că șoarecii dezvoltă cancer de colon (hiperplazie, adenom sau adenocarcinom) de la 3 până la 6 luni și s-a demonstrat căinflamatorfocarele sunt întotdeauna asociate cu aceste leziuni tumorogene (Engle et al., 1999). Studii ulterioare au demonstrat că la acești șoareci dezvoltarea cancerului de colon este necesară pentru prezența infecției florei microbiene patogene, deoarece cancerul de colon este complet eliminat prin adăpostirea șoarecilor în condiții lipsite de germeni (Engle et al., 2002) și H. hepaticus. infectia induce, de asemenea, colita si carcinomul intestinului gros in Rag2-/-şoareci (Erdman şi colab., 2003). În mod similar, la om, starea microbiană și imunitatea gazdei sunt factorii cheie pentru progresia IBD (Fiocchi, 1998), iar carcinomul gastric a fost raportat a fi asociat cu infecția sau inflamația cronică indusă de H. pylori (Parsonnet și colab., 1991; El-Omar și Malfertheiner, 2001). Descoperirile acestor studii sugerează că infecția gastrointestinală poate juca un rol esențial în dezvoltarea cancerului de colon. Astfel, țintirea infecției gastrointestinale poate deveni o strategie terapeutică pentru prevenirea sau tratarea cancerului de colon, precum și a IBD. Studiul nostru demonstrează pentru prima dată că administrarea orală aCistancheextragereduce frecventa deinflamatorhiperplazieîn intestin și numărul de H. hepaticus din fecale la șoarecii cu deficit de TGF-b1. Efectul benefic alCistanche extragese poate datora activării macrofagelor, așa cum se vede atât prin creșterea producției de NO, cât și a fagocitozei în urma tratamentului cuCistancheextrage(Fig. 5), care poate limita microflora patogenă intestinală, inclusiv helicobacter (Mantovani et al., 2002, 2008). Ca urmare, leziunea deinflamatorhiperplaziea fost redus.

O varietate de compuși bioactivi au fost identificați în extractele de C. deserticola, inclusiv glicozide feniletanoide și polizaharide (Jiang și Tu, 2009). Glicozidele feniletanoide sunt citoprotectoare, indicat de faptul că acești compuși previn moartea celulelor în hepatocitele cultivate și neuronii granulei cerebeloase (Xiong și colab., 1998; Pu și colab., 2003). În timp ce polizaharidele stimulează proliferarea limfocitelor T și B indusă de mitogeni (Wu și Tu, 2005; Wu și colab., 2005; Dong și colab., 2007). A fost bine documentat că polizaharidele din plante modulează răspunsul imun (Jiang et al., 2010).Cistancheextrageconține 2-3% feniletanoizi și 65-70% polizaharide, ceea ce sugerează că efectul de imunomodulare alCistancheextragetratamentul s-ar putea datora activității imunoreglatoare a polizaharidelor, majoritatea substanțelor bioactive din extractul de Cistanche. Cu toate acestea, celulele imune țintă (de exemplu, macrofage sau celule NK, sau ambele) și căile moleculare necesită investigații suplimentare. În plus, un studiu recent demonstrează că administrarea acetonidei de feniletanoid din plante, unul dintre feniletanoizii bioactivi din extractul de C. deserticola (Xiong et al., 1996; Jiang și Tu, 2009), are un efect benefic asupra reducerii dextranului. colita indusă de sulfat de sodiu la șoareci (Hausmann et al., 2007), demonstrând că feniletanoizii (2-3 la sută) dinCistancheextragepoate contribui cel puțin parțial la eficacitatea sa în scădereainflamatorhiperplazie, care necesită și evaluare în viitor.
În concluzie, cancerul colorectal este unul dintre cele mai răspândite tipuri de cancer la nivel mondial și poate fi prevenit în majoritatea cazurilor. Utilizarea extractelor de plante netoxice poate oferi o strategie eficientă pentru prevenirea dezvoltării cancerului colorectal și poate fi, de asemenea, aplicată ca chimio-adjuvant, care poate beneficia de îmbunătățirea eficacității chimioterapeutice anticancer și/sau de reducerea chimioterapicului. efecte secundare. Datele prezentate în acest studiu demonstrează clar că tratamentul cu extract apos de C. deserticola reduce hiperplazia și infecția cu H. hepaticus în intestinul șoarecilor predispuși la cancer de colon. Infecție cu Helicobacter sau intestininflamaţiehiperplazieeste un factor de risc pentru dezvoltarea cancerului colorectal. Studiul nostru actual indică faptul că utilizarea acestei plante poate avea potențialul de prevenire și tratare a cancerului colorectal, în special pentru acele persoane care au IBD.

Confirmare

YM a fost susținut de o bursă pentru studenți absolvenți de la China Scholarship Council.

Conflict de interese

Autorii nu au niciun conflict de interese.

Cistancheextragepoate reduceInflamatorhiperplazie

Din: „Reducerea deInflamatorHiperplazieîn intestin la șoareci predispuși la cancerul de colon prin extract de apă dinCistanchedeserticola' de Yamin Jia,1,2 et al

---Drepturi de autor © 2011 John Wiley & Sons, Ltd. Phytother. Res. 26: 812–819 (2012) DOI: 10.1002/ptr.3637

REFERINȚE

Burgdorf SK, Nielsen HJ, Rosenberg J. 2009. Imunoterapia în cancerul colorectal. Scand J Gastroenterol 44: 261–268.
Cai RL, Yang MH, Shi Y, Chen J, Li YC, Qi Y. 2010. Activitatea antioboseală a extractului bogat în feniletanoizi dinCistanchedeserticola. Phytother Res 24: 313–315.
Chao A, Thun MJ, Connell CJ și colab. 2005. Consumul de carne și riscul de cancer colorectal. JAMA 293: 172–182.
Cunningham D, Atkin W, Lenz HJ și colab. 2010. Cancer colorectal. Lancet 375: 1030–1047.
Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. 2007. Caracterizarea structurală și activitatea imunologică a două polizaharide extractibile cu apă rece dinCistanchedeserticola YC. Ma. Carbohydr Res 342: 1343–1349.
Du C, Guan Q, Diao H, Yin Z, Jevnikar AM. 2006. Oxidul nitric induce apoptoza în celulele epiteliale tubulare renale prin activarea caspazei-8. Am J Physiol Renal Physiol 290: F1044–1054.
Dubois M, Gilles KAJK, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. 1956. Metode colorimetrice pentru determinarea zaharurilor substanțelor înrudite. Anal Chem 28: 350–356.

Eaden JA, Abrams KR, Mayberry JF. 2001. Riscul de cancer colorectal în colita ulceroasă: o meta-analiză. Gut 48: 526–535.
El-Omar EM, Malfertheiner P. 2001. Helicobacter pylori și cancerul gastric. Curr Opin Gastroenterol 17(Suppl 1): S24-S27.
Engle SJ, Hoying JB, Boivin GP, ​​Ormsby I, Gartside PS, Doetschman T. 1999. Transformarea factorului de creștere beta1 suprimă cancerul de colon nemetastatic într-un stadiu incipient al tumorigenezei. Cancer Res 59: 3379–3386.
Engle SJ, Ormsby I, Pawlowski S, et al. 2002. Eliminarea cancerului de colon la șoarecii cu deficit de factor de creștere transformator fără germeni-beta 1-. Cancer Res 62: 6362–6366.
Erdman SE, Poutahidis T, Tomczak M, et al. 2003. CD4 plus CD25 plus limfocitele T reglatoare inhibă cancerul de colon indus de microbi la șoarecii cu deficit de cârpă. Am J Pathol 162: 691–702.
Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM. 2010. Estimări ale poverii mondiale a cancerului în 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer 127: 2893–2917.
Fiocchi C. 1998.Inflamatorboli intestinale: etiologie și patogeneză. Gastroenterologie 115: 182–205.
Hausmann M, Obermeier F, Paper DH, et al. 2007. Tratamentul in vivo cu actozid feniletanoid pe bază de plante ameliorează inflamația intestinală în colita indusă de sulfat de dextran sodiu. Clin Exp Immunol 148: 373–381.
Jiang MH, Zhu L, Jiang JG. 2010. Acțiuni imunoregulatoare ale polizaharidelor din medicina chineză pe bază de plante. Expert Opin Ther Targets 14: 1367–1402.
Jiang Y, Tu PF. 2009. Analiza constituenților chimici înCistanchespecii. J Chromatogr A 1216: 1970–1979.
Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CR. 2002. Anti-nociceptive și anti-inflamatoractivitate cauzată deCistanchedeserticola la rozătoare. J Ethnopharmacol 83: 177–182.
Lukas M. 2010.Inflamatorboala intestinală ca factor de risc pentru cancerul colorectal. Dig Dis 28: 619–624.
Mantovani A, Allavena P, Sica A, Balkwill F. 2008. Cancer-related inflammation. Natura 454: 436–444.
Mantovani A, Sozzani S, Locati M, Allavena P, Sica A. 2002. Macrophage polarization: tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends Immunol 23: 549–555.
Neri S, Mariani E, Meneghetti A, Cattini L, Facchini A. 2001. Calcein-acetoximethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analysis on recovered effector cells and supernatants. Clin Diagn Lab Immunol 8: 1131–1135.
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, Wang YC. 2005. Producția îmbunătățită de glicozide feniletanoide de cătreCistanchecelule deserticola cultivate într-un bioreactor de transport aerian cu buclă internă cu un sistem de ridicare. Enzyme Microb Technol 36: 982–988.
Park Y, Hunter DJ, Spiegelman D și colab. 2005. Aportul de fibre alimentare și riscul de cancer colorectal: o analiză comună a studiilor prospective de cohortă. JAMA 294: 2849–2857.
Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, et al. 1991. Infecția cu Helicobacter pylori și riscul de carcinom gastric. N Engl J Med 325: 1127–1131.
Pu X, Song Z, Li Y, Tu P, Li H. 2003. Acteoside fromCistanchesalsa inhibă apoptoza de către ionul de 1-metil-4-fenilpiridiniu în neuronii granulelor cerebeloase. Planta Med 69: 65–66.
Shames B, Fox JG, Dewhirst F, Yan L, Shen Z, Taylor NS. 1995. Identificarea infecției răspândite cu Helicobacter hepaticus în fecale în colonii comerciale de șoareci prin cultură și test PCR. J Clin Microbiol 33: 2968–2972.
Strate LL, Syngal S. 2005. Sindroame ereditare de cancer colorectal. Cancerul cauzează controlul 16: 201–213.
Von Roon AC, Reese G, Teare J, Constantinides V, Darzi AW, Tekkis PP. 2007. Riscul de cancer la pacientii cu boala Crohn. Dis Colon Rectum 50: 839–855.
Wu TF, Hsu CY, Huang HS, Chou SP, Wu H. 2007. Analiza proteomică a efectelor picnogenolului în macrofagele RAW 264.7 relevă inducerea expresiei catepsinei D și îmbunătățirea fagocitozei. J Agric Food Chem 55: 9784–9791.
Wu XM, Gao XM, Tsim KW, Tu PF. 2005. Un arabinogalactan izolat din tulpinile deCistanchedeserticola induce proliferarea limfocitelor de cultură. Int J Biol Macromol 37: 278–282.
Wu XM, Tu PF. 2005. Isolation and characterization of alpha-(1-->6)-glucani dinCistanchedeserticola. J Asian Nat Prod Res 7: 823–828.
Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. 1998. Hepatoprotective activity of phenylethanoids fromCistanchedeserticola. Planta Med 64: 120–125.
Xiong Q, Kadota S, Tani T, Namba T. 1996. Efectele antioxidante ale feniletanoizilor dinCistanchedeserticola. Biol Pharm Bull 19: 1580–1585.