Evaluarea in vitro a celor mai active tulpini de probiotice capabile să îmbunătățească funcțiile barierei intestinale și să prevină bolile inflamatorii ale sistemului gastrointestinalⅡ

2. Materiale și metode

2.1. Culturi celulare

Adenocarcinom de colon uman caucazian Celulele Caco{{{0}} (ATCC® HTB{-37™) și celulele HT29-MTX care secretă mucus epitelial de colon uman (Sigma Aldrich) au fost cultivate mai întâi separat, ambele folosind Mediu DMEM (Gibco) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (Gibco), 100 UI/mL penicilină, 100 mg/mL streptomicina (Gibco) și 2 mM glutamină (Gibco), la 37 ◦ C într-o atmosferă de 5% CO2. Apoi, co-culturile au fost instalate în plăci 12-wellTranswell® (cu inserție de policarbonat de 12 mm și pori de 0,4 µm) prin placarea celulelor în compartimentul bazolateral într-un raport de 75:25 Caco-2:HT 29-MTX și efectuat timp de 21 de zile, schimbând mediul la fiecare 2 zile.

Faceți clic pentru a ameliora rapid constipația

2.2. Tulpini bacteriene

Tulpinile de Lactobacillus, inclusiv Limosilactobacillus fermentum izolate din lapte de bivoliță [32], Levilactobacillus brevis SP-48, Lacticaseibacillus rhamnosus IMC501, Limosilactobacillus reuteri LR92 și Lacticaseibacillus paracaseder, au fost cultivate de către IMC5D0202, proiectul Italia, Inc. fermentarea bioreactorului procese și liofilizare pentru a obține pulberile folosite ca materie primă. Înainte de experiment, pulberile au fost resuspendate și crescute în bulion Man, Rogosa și Sharpe (MRS-Oxoid) la 37 ◦ C în condiții microaerofile timp de 24 de ore.

2.3. Tratamentul celular

Celulele co-cultivate au fost tratate cu diferite tulpini de Lactobacillus spp. (108 CFU/mL) la o multiplicitate de infecție (MOI) de 100, singur sau în combinație cu 20 µg/mL de lipopolizaharidă (LPS) de S. Typhimurium, timp de 24 ore la 37 ◦ C la 5% CO2 în DMEM fără antibiotice.

2.4. PCR în timp real

Pentru a evalua expresia citokinelor pro- și antiinflamatorii, HBD-2 și TJ, celulele la sfârșitul tratamentelor au fost spălate de trei ori cu PBS steril și ARN-ul total a fost extras folosind High Pure ARN Isolation Kit ( Roche Diagnostics). Un total de 2{{20}}0 ng de ARN celular au fost transcrise invers (Expand Reverse Transcriptase, Roche) în ADN complementar (cDNA) folosind primeri hexameri aleatori (randomhexamers, Roche) la 42 ◦C timp de 45 min, conform instructiunilor producatorului. PCR în timp real pentru IL-6, IL-8, TNF- , IL{-1 , TGF- , HBD-2, Occludin, Zonulin{-1 și Claudin{{ 14}}a fost efectuată cu kitul LC Fast Start DNA Master SYBR Green (Roche Diagnostics) utilizând 2 µL de cADN, corespunzând la 10 ng de ARN total într-un volum final de 20 µL, 3 mMMgCl2 și 0,5 µM primeri sens și antisens ( Tabelul 1). După amplificare, analiza curbei de topire a fost efectuată prin încălzire la 95 °C timp de 15 s la o rată de tranziție a temperaturii de 20 °C/s, răcire la 60 °C timp de 15 s cu o rată de tranziție a temperaturii de 20 °C/s și apoi încălzirea probei la 0,1 ◦C/s la 95 ◦C. Rezultatele au fost apoi analizate folosind software-ul LightCycler (Roche Diagnostics). Curba standard a fiecărei perechi de primeri a fost stabilită cu diluții în serie de ADNc. Toate PCR-urile au fost efectuate în trei exemplare. Specificula produselor de amplificare a fost verificată folosind electroforeză pe un gel de agaroză 2% și vizualizare prin colorare cu bromură de etidio [6].

2.5. Testul ELISA

Prezența IL-6, IL-8, IL-1 , TNF- , TGF- , HBD{-2, Zonulin-1, Occludin și Claudin{{7 }} din lizatele celulare ale co-culturii de Caco{-2/HT{29-MTX infectate cu diferite tulpini de lactobacili cu sau fără LPS a fost analizată utilizând testul imunosorbent legat de enzime (ELISA; Invitrogen, IL{{12) }}, IL-8, IL-1 alfa, TNF alfa și TGF beta-1 Kit HumanELISA; Phoenix Pharmaceuticals, Inc. Defensin 2, beta (uman) — Kit ELISA; Elabscience Biotechnology Inc. Zonulină umană, OCLN umană (Occludin) și Kit ELISA CLDN1 uman (Claudin 1).

2.6. Testul de aderență și invazivitate

Capacitatea L. brevis, L. reuteri și L. rhamnosus de a reduce capacitatea de adezivitate și invazive a S. Typhimurium și EIEC în coculturi intestinale a fost investigată în trei tipuri experimentale diferite: (i) test competitiv, în care celulele epiteliale intestinale au fost incubate simultan. cu lactobacili (108 CFU/mL) și S. Typhimuriumor EIEC (108 CFU/ml) timp de 2 ore. (ii) Test de inhibare, în care celulele au fost preincubate cu lactobacili (108 CFU/mL) timp de 2 ore, apoi s-au adăugat S. Typhimurium sau EIEC (108 CFU/mL) și au fost incubate pentru încă 2 ore. (iii) Test de deplasare în care celulele au fost pre-incubate cu S. Typhimurium sau EIEC (108 UFC/mL) timp de 2 ore și apoi au fost adăugați lactobacili (108 UFC/ml) și s-au incubat în continuare timp de 2 ore. La sfârșitul acestui timp, monostraturile infectate au fost spălate extensiv în PBS, apoi lizate cu o soluție de 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) în PBS timp de 10 minute în cameră. temperatura pentru a număra bacteriile internalizate. Alicotele de lizate celulare au fost diluate în serie și plasate pe agar Hektoen (OXOID) și incubate la 37 °C peste noapte pentru a cuantifica bacteriile totale viabile asociate celulelor (CFU/mL). Pentru testele de invazive, după incubarea cu bacterii, monostraturile infectate au fost spălate extensiv cu PBS steril și incubate în continuare timp de încă 2 ore în mediu DMEM, suplimentat cu gentamicinsulfat (250 µg ml–1) (Sigma-Aldrich) pentru a ucide bacteriile extracelulare, apoi celulele au fost lizate și placate așa cum s-a descris anterior pentru a cuantifica numărul total de bacterii internalizate (CFU/mL).

2.7. Analize statistice

Diferențele semnificative între grupuri au fost evaluate prin ANOVA în două căi utilizând GraphPad Prism 8.0, iar comparația dintre medii a fost calculată folosind un test t Student. Datele sunt exprimate ca medii ± abaterea standard (SD) a trei experimente independente.

Medicament natural din plante pentru ameliorarea constipatiei-Cistanche

Cistanche este un gen de plante parazite care aparține familiei Orobanchaceae. Aceste plante sunt cunoscute pentru proprietățile lor medicinale și au fost folosite în Medicina Tradițională Chineză (MTC) de secole. Speciile de Cistanche se găsesc predominant în regiunile aride și deșertice din China, Mongolia și alte părți ale Asiei Centrale. Plantele de Cistanche se caracterizează prin tulpinile lor cărnoase, gălbui și sunt foarte apreciate pentru potențialele lor beneficii pentru sănătate. În MTC, se crede că Cistanche are proprietăți tonice și este folosit în mod obișnuit pentru a hrăni rinichii, a spori vitalitatea și a susține funcția sexuală. De asemenea, este folosit pentru a aborda probleme legate de îmbătrânire, oboseală și bunăstare generală. În timp ce Cistanche are o istorie lungă de utilizare în medicina tradițională, cercetările științifice asupra eficacității și siguranței sale sunt în desfășurare și limitate. Cu toate acestea, se știe că conține diverși compuși bioactivi, cum ar fi glicozide feniletanoide, iridoide, lignani și polizaharide, care pot contribui la efectele sale medicinale.

ale lui Wecistanchepulbere cistanche, tablete cistanche, capsule cistanche, iar alte produse sunt dezvoltate folosinddeşertcistancheca materii prime, toate având un efect bun asupra ameliorării constipației. Mecanismul specific este următorul: se crede că Cistanche are beneficii potențiale pentru ameliorarea constipației pe baza utilizării sale tradiționale și a anumitor compuși pe care îi conține. În timp ce cercetarea științifică în special asupra efectului Cistanche asupra constipației este limitată, se crede că are multiple mecanisme care pot contribui la potențialul său de a ameliora constipația. Efect laxativ:Cistanchea fost folosit de mult în medicina tradițională chineză ca remediu pentru constipație. Se crede că are un efect laxativ ușor, care poate ajuta la promovarea mișcărilor intestinale și la inducerea constipației. Acest efect poate fi atribuit diverșilor compuși găsiți în Cistanche, cum ar fi glicozidele feniletanoide și polizaharidele. Umidificarea intestinelor: Pe baza utilizării tradiționale, Cistanche este considerată a avea proprietăți de hidratare, vizând în mod specific intestinele. Promovarea hidratării și lubrifierii intestinelor poate ajuta la înmuierea instrumentelor și facilitează trecerea mai ușoară, ameliorând astfel constipația. Efect antiinflamator: Constipația poate fi uneori asociată cu inflamația tractului digestiv. Cistanche conține anumiți compuși, inclusiv glicozide feniletanoide și lignani, despre care se crede că au proprietăți antiinflamatorii. Prin reducerea inflamației din intestine, poate ajuta la îmbunătățirea regularității mișcărilor intestinale și la ameliorarea constipației.