Variantele apolipoproteinei L1 asociate bolii renale arată un câștig de funcție în activitatea canalului cationic

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Jonathan Bruno și John C. Edwards

Variantele din apolipoproteina L1 (ApoL1) sunt cunoscute a fi responsabile pentru riscul crescut de apariție a unorrinichiboliprintre oamenii de ascendență africană. ApoL1 este o proteină amfitropică care poate fi introdusă în membranele fosfolipide și conferă permeabilitate selectivă pentru anioni sau cationi membranelor fosfolipide, în funcție de pH. Nu se știe dacă aceste activități diferă între variante sau dacă contribuie la patogenia bolii. Am folosit teste ale fluxului ionic determinat de tensiune din veziculele fosfolipide și ale asocierii cu membrană stabilă pentru a evalua diferențele dintre izoformele ApoL1. Există o creștere semnificativă (aproximativ de două ori) a activității permeazei ionice selective pentru cationi a celor două variante asociate bolii renale în comparație cu proteina de referință. În schimb, nu găsim nicio diferență în activitatea permeazei selective pentru anioni la pH scăzut între izoforme. În comparație cu secvența de referință, cele două variante asociate bolii prezintă o asociere stabilă crescută cu veziculele fosfolipide în condiții care susțin activitatea cationpermeazei, sugerând că activitate crescută se poate datora unei asocieri și inserții mai eficiente ale membranei. Nu există nicio diferență în asocierea membranei între izoforme în condiții optime pentru activitatea permeazei anionice. Aceste date susțin un model în care permeabilitatea îmbunătățită a cationilor poate contribui la bolile renale progresive asociate cu alelele ApoL1 cu risc ridicat.

Două variante distincte ale proteinei ApoL1 sunt cunoscute a fi responsabile pentru riscul crescut recunoscut de proteinurie progresivă.rinichiboalala persoanele de ascendență africană, în special datorită glomerulosclerozei segmentare focale, nefrosclerozei hipertensive și nefropatiei asociate HIV (1–3). Rolurile funcționale ale ApoL1 în celulele umane, impactul variantelor asociate bolii asupra acestor funcții și modul în care orice astfel de modificări inactivitate poate acceleraboală de rinichisunt neclare (4, 5).

Singura activitate biochimică pe care se știe că o posedă proteina ApoL1 este aceea de a funcționa ca un canal ionic. S-a observat că domeniul N terminal al ApoL1 are similaritate structurală cu colicina bacteriană A1 (6). Ca și colicina A1, ApoL1 este o proteină amfitropică care, în anumite circumstanțe, poate pătrunde într-o membrană lipidică dintr-o soluție apoasă și apoi funcționează ca o permează ionică (6-9). ApoL1 de tip sălbatic recombinant purificat este stabil în soluție de detergent la pH neutru (8, 9). La pH scăzut, ApoL1 poate pătrunde în membranele fosfolipide și crește permeabilitatea selectivă a membranelor (6, 7, 9). Când pH-ul cis este ridicat înapoi la neutru, permeabilitatea selectivă a anionilor este suprimată și este activat un canal selectiv al cationilor (8, 9). Aceste date susțin un model în care ApoL1, prezentată într-un compartiment acid de-a lungul căilor exocitare sau endocitare, ar putea fi introdusă în membrana limitatoare a organelor, ceea ce duce la creșterea permeabilității la anioni. Traficul ulterior al proteinei către alte compartimente ale membranei în care pH-ul cis ar fi neutru (cum ar fi membrana plasmatică sau membranele mitocondriale) ar suprima permeabilitatea anionică și ar activa cationpermeaza. Dacă aceste activități de permează ionică joacă un rol în patogeneza ApoL1-asociatărenalbolieste neclar.

Am folosit metode bazate pe vezicule pentru a analiza diferențele dintre activitățile permeazei ionice și legarea membranei dintre secvența de referință (tip sălbatic), desemnată G0, și cele două variante asociate bolii, denumite G1 și G2. Am descoperit că, în comparație cu G0, atât izoformele G1, cât și G2 prezintă o activitate specifică crescută a activității permeazei cationice la pH neutru, fără a modifica activitatea permeazei selective pentru anioni la pH scăzut. În plus, izoformele asociate bolii G1 și G2 prezintă o asociere stabilă crescută a membranei în comparație cu G0 în condiții care susțin activitatea cationpermeazei, dar nu în condiții care susțin activitatea permeazei anionice. Nu găsim niciun efect asupra modelului de sensibilitate la pH nici a etapei de legare, nici a etapei de eflux a activității canalului cationic și nu găsim niciun efect asupra sensibilității la pH a activității permeazei selective de anioni. Concludem că variantele asociate bolii ale ApoL1 îmbunătățesc selectiv activitatea canalului cationic al proteinei, probabil cel puțin parțial prin îmbunătățirea inserției membranei. Propunem ca această activitate îmbunătățită a canalului să contribuie la progresrinichiboalala persoanele purtătoare de genotipuri cu risc ridicat.

Cistanche poate trataboală de rinichi

Rezultate

Au fost exprimate și purificate izoforme recombinante ale ApoL1 cu secvența semnalului N-terminal îndepărtată și înlocuită cu o etichetă de epitop 6His/T7. Toate trei au prezentat proprietăți cromatografice identice prin purificare și nu au fost distinse prin electroforeză pe gel Figura 1.

Fracțiile de vârf au fost diluate la 100 ug/ml și au fost supuse testelor de eflux de vezicule pentru capacitatea de a conferi permeabilitate la clorură și potasiu. Testul constă din două etape separate. În stadiul de asociere, ApoL1 este amestecat cu vezicule de fosfolipide încărcate cu KCl și lăsat să se introducă în membrane. KCl extravehicular și tamponul sunt apoi îndepărtate prin trecerea printr-o coloană de desalinizare echilibrată în zaharoză izotonă, generând gradienți mari de la interior la exterior ale ambelor Kand. Ioni de Cl. În etapa de eflux, eluatul coloanei de centrifugare este diluat într-o soluție tampon izotonică de zaharoză care menține gradientul de KCI la pH-ul dorit. Concentrația extravehiculară de Cl este monitorizată cu un electrod selectiv pentru clorură. Chiar dacă este prezentă permeabilitatea selectivă K sau Cl, ionul nu va putea ieși din vezicule din cauza lipsei de mișcare a contraionului. Efluxul ionic determinat de tensiune este inițiat prin adăugarea unei concentrații saturante a unui ionofor contraion. Adăugarea ionoforului K-selectiv, valinomicină (Val), va induce un potențial mare de membrană negativ în interior care, dacă este prezentă permeabilitatea Cl, va conduce la efluxul KCl care va fi detectat de electrodul selectiv pentru clorură; astfel, după Val, rata efluxului Cl reflectă permeabilitatea Cl. Dimpotrivă, adăugarea ionoforului selectiv de Cl, Ionoforul de clorură 1 (CI1), va induce un potențial de membrană pozitiv în interior care va conduce la efluxul KCl dacă este prezentă o permeabilitate K. Prin urmare, după adăugarea CI1, rata efluxului CI reflectă permeabilitatea K. Acest test poate servi fie ca test de permeabilitate CI sau K, în funcție de ce ionofor este utilizat. Rata inițială a fluxului de ione după adăugarea de ionofor este considerată ca permeabilitatea specifică a veziculelor. Rețineți că efluxul de CI înainte de adăugarea ionoforului indică o anumită permeabilitate atât la K cât și la CI. Chiar și în această circumstanță, rata efluxului Cl după adăugarea unui exces de ionofor contraion reprezintă permeabilitatea la ionul de interes - Cl după adăugarea de Val și K după adăugarea de CI1.

Cistanche poate trataboală de rinichi

Activitatea permeazei clorului

Studiile noastre anterioare au arătat că permeabilitatea anionică este cea mai mare atunci când atât etapa de asociere a membranei, cât și etapa de eflux sunt efectuate la pH 5.0, iar aceste condiții au fost utilizate pentru a compara activitatea de permeabilitate a Cl a celor trei izoforme, folosind Val pentru a iniția eflux dependent de permeabilitatea Cl. Exemple de date brute sunt prezentate în Figura 2A, care arată ieșirea de la electrodul selectiv Cl în milivolti reprezentați în funcție de timp. Înregistrarea începe înainte de adăugarea eluatului spincoloană care conține vezicule și proteină, valoarea mV reflectând concentrația de 10 μM Cl. Eluatul coloanei de centrifugare fără Cl este adăugat la prima săgeată, diluând Cl, care se reflectă în deviația în sus a urmăririi mV. Val este adăugat la a doua săgeată, declanșând efluxul Cl dacă este prezentă permeabilitatea Cl, care este reflectată de scăderea progresivă a mV. Tritonul X-100 este adăugat la a treia săgeată, eliberând toată clorura intraveziculară rămasă. După conversia de la mV la concentrația de clorură utilizând o curbă standard generată pentru electrod în condițiile testului, se determină rata inițială fracțională a eliberării CI după adăugarea de Val și se ia ca permeabilitate la clor. În comparație cu controlul fără proteine ​​(urmă albastră), rata mare de eliberare a Cl după adăugarea de Val indică faptul că ApoL1 conferă o permeabilitate substanțială a Cl care pare comparabilă între cele trei izoforme (urme roșii, verzi și galbene). Rata foarte scăzută de eflux înainte de Val indică faptul că permeabilitatea la potasiu este mult mai mică decât permeabilitatea Cl. O gamă de concentrații ale izoformelor ApoL1 a fost testată pentru activitatea permeazei Cl (Fig. 2B). După cum s-a raportat anterior pentru G0, constatăm că activitatea Clpermeazei este legată liniar de masa proteinei din test pentru toate cele trei izoforme. Activitatea permeazei la fiecare concentrație nu este diferită între cele trei izoforme. Curba de concentrație a fost efectuată de două ori folosind două seturi diferite de preparate proteice, dând același rezultat.

Șase preparate independente ale celor trei proteine ​​au fost testate pentru activitatea permeazei Cl la pH 5.0 așa cum este rezumat în Figura 2C. În niciunul dintre seturile de preparate nu am găsit diferențe semnificative în activitatea permeazei Cl între izoforme (p > 0.05 pentru compararea G{0 cu G1 sau G2 în fiecare set) . Ratele medii de eflux ale tuturor celor șase preparate (marcate ALL în Fig. 2C) au fost de 1,21 ± 0,32 procente /s pentru secvența de referință G0, 1,36 ± 0,41 procente /s pentru G1 și 1,18 ± 0,34 pentru G2 (media ± SD, n=6 pentru fiecare; p=0,47 și 0,94 pentru compararea G0 cu G1 și, respectiv, G2). Pentru a determina dacă mutațiile asociate bolii modifică sensibilitatea la pH a permeazei anionice, permeabilitatea Cl conferită de fiecare izoformă a fost testată printr-un interval de valori pH, utilizând pH-ul indicat atât pentru etapele de asociere, cât și pentru efluxul testului (Fig. 2D). diferențe semnificative între izoforme. Acest experiment a fost efectuat de două ori folosind două seturi diferite de preparate proteice, dând același rezultat. Astfel, activitatea Clpermeazei nu este semnificativ diferită între cele două variante asociate bolii și secvența de referință.

Activitatea permeazei de potasiu

Studiile noastre anterioare au indicat că permeabilitatea cationilor este cea mai mare atunci când etapa de asociere a membranei este efectuată la pH 6.0 și etapa de eflux este efectuată la pH 7,5 și am folosit aceste condiții dacă nu este specificat altfel. Exemple de date brute dintr-un test de permează K sunt prezentate în Figura 3. Ca și în cazul testelor de permeabilitate Cl, eluatul coloanei de spin este adăugat la prima săgeată, ionoforul (în acest caz, Clorură Ionofor1, CI1) este adăugat la a doua săgeată și detergentul este adăugat la a treia săgeată. Ratele inițiale de eflux după adăugarea ionoforului, reprezentând permeabilitatea K, sunt indicate prin linii întrerupte gri. Urmărirea albastră este de la controlul fără proteine, arătând doar permeabilitatea de fond endogenă a veziculelor. Trasarea roșie arată activitatea variantei G0(tip sălbatic), demonstrând în mod clar prezența Kpermeabilității mai mare decât veziculele de control conferite de proteină așa cum a fost raportat anterior (9). Urmele galbene și verzi arată activitatea variantelor G1 și, respectiv, G2. Pantele inițiale după adăugarea ionoforului sunt în mod clar mai mari pentru G1 și G2 decât pentru G0, ceea ce indică faptul că variantele asociate bolii suportă o activitate mai mare a permeazei K decât G0.

Spre deosebire de testul de permeabilitate Cl și așa cum s-a raportat anterior pentru izoforma G0 (9), în condițiile de testare a permeazei K, există un anumit eflux înainte de ionofor în veziculele care conțin oricare dintre cele trei izoforme, reprezentate de panta descendentă. a înregistrărilor după adăugarea probei și înainte de adăugarea ionoforului. În timp ce rata mare de eflux după adăugarea ionoforului indică prezența unei permeabilitati substanțiale K, efluxul înainte de ionofor indică și prezența unei anumite permeabilitati Cl, permițând ambilor ioni să se scurgă din vezicule în absența ionoforului. Acest lucru este probabil atât pentru creșterea tocită a ieșirii electrodului imediat după adăugarea eluatului coloanei de spin, cât și pentru panta descendentă ulterioară înainte de CI1, care este văzută cu toate înregistrările care conțin ApoL1. Presupunând că această scurgere începe pe măsură ce proba trece prin coloana de centrifugare, ar explica și diferențele în concentrația finală de Cl după adăugarea de detergent, deoarece orice pierdere de KCl pe coloana de centrifugare ar însemna mai puțin KCl total adăugat la test. Interpretarea cantitativă a ratei ionoforului nu este simplă, altfel decât trebuie să fie o funcție a permeabilităților atât la K cât și la Cl. Ca și înainte (9), atribuim această activitate activității permeazei de Cl rezidual pe care o vedem la pH 7,5 ca în Figura 2D (a se vedea, de asemenea, Bruno și colab. (9), Fig. 4D).

Testele permeazei de potasiu au fost efectuate într-un interval de concentrații de proteine ​​(Fig. 4A). Activitatea a fost liniar legată de masa proteinei din test pentru fiecare izoformă, dar cele două izoforme asociate bolii au prezentat o activitate de eflux substanțial crescută în comparație cu G0. Această curbă de concentrație a fost reprodusă cu trei seturi separate de preparate proteice, dând rezultate foarte similare.

Șase preparate independente ale celor trei izoforme au fost testate pentru activitatea de eflux K utilizând 2 ug de proteină în fiecare test. În fiecare dintre cele șase seturi, activitatea pentru izoformele G1 și G2 a fost semnificativ mai mare decât cea a lui G0 (Fig. 4B). Media tuturor celor șase seturi de date a generat rate de eflux de 0,349 ± 0.063 la sută/s pentru G{{10}}, {{15} },709 ± 0,176 procente /s pentru G1 și 0,673 ± 0,142 procente /s pentru G2 (media ± SD, n=6 pentru fiecare; p < 0,00001="" pentru="" compararea="" lui="" g0="" cu="" g1="" sau="" g2).="" activitățile="" specifice="" ale="" permeazei="" k="" a="" g1="" și="" g2="" sunt="" de="" 2,03-="" și,="" respectiv,="" de="" 1,93-ori="" mai="" mari="" decât="" g0="" prin="" acest="">

Dependența activității permeazei K de pH-ul etapei de asociere a membranei și etapa de eflux ionic a fost analizată separat. Deși am confirmat că activitatea totală a efluxului G1 și G2 este mai mare decât cea a lui G0 în condiții „standard” (legare la pH 6, eflux la pH 7,5), nu am găsit nicio diferență semnificativă în forma curbei de activitate în raport cu pH-ul extern (cis) fie al etapei de asociere cu membrană (Fig. 4C), fie al etapei de eflux ionic (Fig. 4D). De asemenea, nu am găsit diferențe între izoforme în dependența activității de pH-ul intravezicular (trans) ridicat sau necesitatea prezenței cationului divalent (Fig. 4E) și, în continuare, remarcăm că fie calciul, fie magneziul sunt la fel de eficiente în furnizarea cationului divalent necesar pentru întreaga durată. activitate. Fiecare dintre aceste experimente a fost efectuat de două ori folosind seturi diferite de proteine ​​purificate, dând rezultate identice.

Asociere membranară stabilă

Am demonstrat anterior că ApoL1 recombinant purificat se leagă spontan de membranele fosfolipide, arătând o dependență similară de pH și compoziția fosfolipidelor ca cea a activităților permeazei ionice (9). Folosind metode similare, am comparat proprietățile de legare a veziculelor lipidice ale versiunii de referință a ApoL1 cu variantele asociate bolii renale în condiții care susțin activitățile optime ale permeazei Cl sau K (Fig. 5). Pentru condițiile Clpermeazei, proteina a fost incubată cu vezicule lipidice la pH 5.0 înainte de extracția haotropă pentru a îndepărta proteinele care nu au fost asociate stabil cu veziculele. Proteina legată de membrană a fost izolată prin flotare printr-o pernă de sucrose și evaluată prin Western blot cantitativ. Rezultatele sunt prezentate în Figura 5A. Nu a existat nicio diferență semnificativă în cantitatea de proteină legată de vezicule între izoformele G{{10}} și fie G1, fie G2. Dintre cele 500 ng de proteine ​​din fiecare reacție, cantitatea legată de vezicule a fost de 223 ± 33 ng pentru G0, 239 ± 38 ng pentru G1 și 191 ± 28 ng pentru G2 (media ± SD ; n=8 pentru fiecare grup, p=0.35 și 0,076 pentru compararea G0 cu G1 și, respectiv, G2). Aproximativ 40-50 la sută din proteina din test este legată de membrane în aceste condiții. Acest experiment a fost făcut de două ori, dând rezultate foarte similare.

Pentru a evalua legarea în condiții optime pentru activitatea Kpermeazei, proteina a fost incubată cu vezicule la pH 6.0, apoi mutată la pH 7,5 înainte de extracția haotropică pentru a elimina proteina inserată nestabili. Proteina legată de membrană a fost izolată prin flotarea veziculelor membranei prin pernă de zaharoză și evaluată prin Western blot cantitativ. Rezultatele sunt prezentate în Figura 5B. Variantele asociate bolii prezintă o legare semnificativ mai eficientă în comparație cu G0. Din cei 500 ng de proteină adăugate la fiecare reacție, cantitatea legată de vezicule a fost de 43,5 ± 14,5 ng (n=8) pentru G{{30}} ,73.0 ± 17,7 ng (n=7) pentru G1 și 69,3 ± 10,3 ng (n=8) pentru G2 (media ± SD; p=0,00076 și 0,0018 pentru compararea lui G0 cu G1 și, respectiv, G2). Aproximativ 9% din proteina G0 din reacție a fost asociată stabil cu veziculele, comparativ cu aproximativ 14% din G1 și G2 în aceste condiții. Acest experiment a fost făcut de două ori folosind preparate independente care au dat rezultate similare.

Discuţie

Prezentăm aici rezultatele studiilor activităților permeazei ionice ale ApoL1 și ale acesteiarinichi-boala-variante asociate care au dat mai multe rezultate semnificative. În primul rând, constatăm că variantele asociate bolii ale ApoL1 au crescut substanțial activitatea Kpermeazei, care este aproximativ dublu față de izoformei G0 din testele noastre. În al doilea rând, spre deosebire de Kpermeaza, nu există diferențe semnificative în activitatea specifică a activității permeazei Cl la pH 5.0 între izoforme. În al treilea rând, nu există diferențe în sensibilitatea la pH a activităților permeazei K sau Cl, sau cerințele pentru un pH trans ridicat și necesitatea cationului divalent pentru activitatea Kpermeazei dintre izoforme. În al patrulea rând, în condiții optime care susțin permeaza K, variantele asociate bolii prezintă o asociere stabilă îmbunătățită a membranei în comparație cu G0, dar nicio diferență în asocierea membranei în condiții optime pentru activitatea permeazei Cl.

Descoperirile noastre care demonstrează creșterea permeazei K fără efect asupra permeazei Cl sunt foarte robuste. Folosind condiții optime pentru fiecare activitate de permează, am găsit rezultate în esență identice între șase seturi independente de preparate, cu activitatea Kpermeazei a variantelor asociate bolii semnificativ mai mare decât G0 în fiecare. Fiecare set a fost preparat și testat în același timp folosind reactivi comuni. Valabilitatea concentrațiilor de proteine ​​determinate prin testul BCA a fost confirmată de intensitatea comparabilă a colorării Coomassie pe SDS-PAGE. Aceste date includ toate încercările reușite de purificare simultană - nu am generat niciodată cu succes un set din toate cele trei variante în care aceste activități relative nu au fost observate.

De asemenea, absența diferențelor în activitatea specifică anion-permeazei la pH 5 a fost consecventă între toate seturile de preparate. Astfel, concluzia noastră principală este că variantele asociate bolii ale ApoL1 conferă un câștig selectiv al funcției activității permeazei K fără a afecta activitatea permeazei Cl, așa cum a fost testat în condiții optime pentru fiecare dintre aceste activități. Prezența unor diferențe substanțiale în activitatea canalului cationic a variantelor ApoL1 care se corelează cu capacitatea de a conduce boala are implicații pentru posibilele mecanisme patogene. Natura selectivă a permeabilității crescute la ioni indică faptul că activitatea crescută a permeazei cationice a variantelor asociate bolii ar putea contribui la boală, dar că activitatea permeazei anionice la pH scăzut, care nu este diferită între izoforme, este puțin probabil să joace un rol critic.

Investigațiile efectelor variantelor asupra sensibilităților la pH ale activităților și asupra gradului de legare a membranei stabile de către proteină aruncă lumină asupra mecanismului prin care activitatea K permeazei poate fi îmbunătățită. În primul rând, în afară de confirmarea activității îmbunătățite a permeazei K în condiții optime, nu am găsit diferențe în formele curbelor care să arate efectele pH-ului asupra asocierii membranei și etapelor de eflux ale activității permeazei K sau ale efectului pH-ului asupra activității totale a permeazei Cl. Mai mult, nu au existat diferențe în cerința pentru pH ridicat al interiorului veziculelor sau în cerința pentru prezența cationului divalent în reacția pentru activitatea K permeazei printre toate izoformele. Astfel, nu am găsit nicio dovadă pentru o diferență în proprietățile intrinseci ale canalului în sine. În schimb, variantele au arătat o asociere stabilă semnificativ crescută cu veziculele fosfolipide în condiții care susțin activitatea Kpermeazei, cu amploarea acestui efect fiind aproximativ același interval ca și inactivitatea modificării. Luate împreună, datele sugerează că baza pentru creșterea activității permeazei K este pur și simplu o inserție mai eficientă a membranei în condițiile care susțin activitatea, fără a fi nevoie să invoce o schimbare fundamentală a proprietăților proteinei inserate.

Au fost identificate trei domenii în structura ApoL1 (6). Se crede că activitatea canalului ionic se află în domeniul „formator de pori” omolog al colicinei, care ocupă aproximativ 60% din proteină la capătul său N-terminal. Variațiile secvenței asociate bolii nu sunt în domeniul de formare a porilor, ci se află la o distanță de acesta într-un domeniu spiralat, care cuprinde aproximativ 16% din proteină la capătul C-terminal. Ștergerea acestui domeniu nu are niciun efect asupra activității tripanolitice, dar este foarte conservată printre izoformele Apol atât în ​​interiorul speciilor, cât și între specii (10). S-a sugerat că această regiune funcționează ca un domeniu controlat (10), iar datele noastre indică faptul că mutanții care cauzează boli din acest domeniu au într-adevăr o legare de membrană crescută în condiții care susțin activitatea canalului cationic și activitatea canalului cationic crescut. O interpretare este că domeniul C-terminal servește la suprimarea asocierii/inserției membranei necesare activității permeazei cationice, iar mutația acestui domeniu relaxează această suprimare.

Cistanche poate tratarinichiboala

Observațiile privind legarea membranei au implicații suplimentare și luminează unele aspecte ale relației dintre activitățile anionice și cationice. Aici constatăm că substanțial mai multă proteină este legată de membrane în condiții optime de activitate a permeazei anionice (pH 5.0) decât în ​​condițiile optime de legare care susțin activitatea permeazei cationice (pH 6.0), iar acest lucru este valabil pentru toți izoforme (fig. 5). Rețineți diferența dintre sensibilitățile de pH ale activității permeazei anionice (Fig. 2D) și etapa de legare a membranei a activității cationpermeazei (Fig. 4C): permeaza anioană crește dramatic sub pH 6, în timp ce capacitatea proteinei introduse în membrană de a susține cationii activitatea de permează scade semnificativ. Datele noastre raportate anterior au arătat că asocierea cu membrană stabilă a G0 crește substanțial pe măsură ce pH-ul scade în același interval de pH și acesta este intervalul în care fluorescența proteinei intrinseci este cel mai dramatic suprimată (9), indicând o tranziție semnificativă în structura proteinei. . Luate împreună, datele sugerează că inserția membranei la pH 6.0 este fundamental diferită de inserția membranei la pH 5.0. La pH 6.0, o fracțiune mai mică a proteinei se asociază cu membrane, însoțită doar de o schimbare minoră a fluorescenței intrinseci și a activității limitate a permeazei anionice, dar cu capacitatea de a trece la o formă permeabilă la cationi atunci când compartimentul cis este titrat la pH7. .5. Mai mult, eficiența acestei legături este mai mare pentru variantele asociate bolii, paralel cu activitatea crescută a cationpermeazei după schimbarea pH-ului. În schimb, la pH 5.0 o fracțiune mult mai mare a proteinei este asociată cu membranele; această legare este însoțită de o schimbare mare a fluorescenței intrinseci și de apariția unei activități mult mai mari a permeazei anionice. Nici legarea la membrană, nici activitatea anionpermeazei nu este diferită între izoforme. Capacitatea acestei proteine ​​inserate de a trece la confirmarea permezei cationilor este mult redusă. Emitem ipoteza că schimbarea raportată anterior în fluorescența intrinsecă, pe măsură ce pH-ul scade de la 6 la 5, reflectă o transformare structurală într-o formă care este incapabilă de a trece la conformația de permează a cationilor, iar diferențele dintre izoforme nu au niciun efect asupra proprietăților de permează ionică ale acestei conformații.

O observație nouă suplimentară este că ionii de calciu și magneziu sunt la fel de eficienți în susținerea activității canalului de cationi al ApoL1. Acest lucru sugerează cu tărie că rolul cationului divalent nu se datorează unei legături cu afinitate ridicată de către proteină, ci, mai probabil, printr-un efect de pontare a sarcinii mai puțin specific, permițând proteinei încărcate negativ să interacționeze cu suprafața încărcată negativ a membranelor fosfolipide.

Au fost publicate și alte investigații care evaluează diferențele în activitatea canalului ionic al izoformelor ApoL1. Thompson și Finkelstein (8) au folosit metode electrofiziologice cu tehnici planare cu două straturi lipidice pentru a evalua activitatea canalului ApoL1 recombinant purificat, raportând nicio diferență în caracteristicile canalului între izoforme. Este important de reținut că metodele planare cu două straturi lipidice și testele de eflux pe bază de vezicule, deși ambele sunt teste de canal, produc diferite tipuri de informații și pot fi considerate sisteme experimentale complementare. Metodele cu două straturi lipidice sunt o abordare de neegalat pentru definirea proprietăților cu un singur canal ale proteinei purificate, dar sunt instrumente mai puțin puternice pentru a cuantifica activitatea specifică, în timp ce testele de eflux al veziculelor pot furniza date cantitative despre activitatea unei populații, dar puține informații despre proprietățile cu un singur canal. Astfel, observațiile lui Thomp fiul și Finkelstein nu sunt în contradicție cu ale noastre, care, de asemenea, nu arată diferențe aparente în proprietățile intrinseci ale canalului, ci doar o diferență în activitatea specifică de aproximativ două ori, o scară de diferență care ar fi destul de greu de detectează în sistemele cu două straturi lipidice.

Investigațiile care utilizează proteine ​​și lipide purificate au virtutea de a dezvălui proprietăți care se datorează în mod clar proteinei în sine și nu sunt modificate de niciun alt componente, cinetica de expresie sau traficul membranelor care compromit sisteme mai complexe. Cu toate acestea, ei sunt neapărat tăcuți asupra efectului final pe care aceste activități îl au asupra celulelor vii. Au fost raportate studii care utilizează sisteme de expresie pe bază de celule pentru a depista activitățile canalelor ionice ale ApoL1 (revizuite în Friedman și Pollak, 2019 (3)). Olabisi și colab. (11) au exprimat izoformele ApoL1 în celulele HEK și au evaluat concentrația de potasiu intracelular la starea de echilibru. Au găsit potasiu intracelular mai scăzut în celulele care exprimă G1 și G2 în comparație cu celulele care exprimă G0. În timp ce această observație ar putea fi în concordanță cu creșterea permeabilității K a membranei plasmatice, K intracelular mai scăzut ar putea fi, de asemenea, o consecință nespecifică a efectului citotoxic mai mare al variantei prin orice mecanism, conducând la activitate NaK ATPazei mai puțin activă și/sau la distrugerea integrității membranei plasmatice. O'Toole şi colab. (12) au calibrat cu atenție nivelurile de expresie în celulele HEK și au evaluat aspectul activității canalului cationic al membranei plasmatice, constatând diferențe între izoforme. Shah și colab. (13) au raportat direcționarea ApoL1 către mitocondrii în care variantele asociate bolii au indus deschiderea porului de tranziție a permeabilității mitocondriale, în concordanță cu dovezile recente pentru citotoxicitatea tripanozomilor. Nu este clar dacă acest efect necesită activitatea canalului ionic al ApoL1. Cu fiecare dintre aceste studii, din cauza complexității sistemelor de expresie bazate pe celule, nu poate fi sigur dacă diferențele observate se datorează proprietăților intrinseci ale proteinei sau altor componente care interacționează prezente în celule.

Mutațiile patogene de creștere a funcției arată de obicei un model de moștenire dominantă, în timp cefenotipul bolii renaleasociat cu variantele ApoL1 este recesiv. Un mecanism prin care o mutație de câștig-de-funcție poate avea recesivă este dacă proteina funcționează ca un homomultimer, iar WT poate exercita un efect dominant-negativ asupra variantei activate. În prezent, nu se știe dacă ApoL1 funcționează ca un canal ca un monomer sau un multimer.

Datele noastre sugerează că creșterea permeabilității cationilor la niveluri similare de exprimare a proteinei ar putea contribui la tocitotoxicitatea în podocite sau alte celule. Cu toate acestea, poate părea puțin probabil ca o simplă creștere de două ori a activității să poată transforma o moleculă aparent benignă într-o boală care conduce. Cu toate acestea, bolile asociate cu variantele ApoL1 tind să fie ușor progresive, iar diferențele subtile pe o perioadă prelungită de timp (de luni până la ani) ar putea avea un efect cumulativ mare. Alte mecanisme potențiale ale acțiunii ApoL1 responsabile pentrurinichirănireau fost propuse și susținute de dovezi (3–5, 11–16), inclusiv efectele onapoptozei, autofagiei, funcției mitocondriale, traficul intracelular al membranei și efectele mediatoare ale moleculelor de semnalizare extracelulară, printre altele. Rămâne de determinată importanța relativă a diferențelor în activitatea canalului ApoL1 descrisă aici față de alte mecanisme potențiale de acțiune în declanșarea bolii.

Cistanche poate tratarinichiboala

Proceduri experimentale

Construcții de expresie

pET-ApoWT care codifică N-terminalul 6His și ApoL1 marcat cu epitop T7 (versiunea G0) au fost descrise anterior (9). Proteina codificată este identică cu cea a accesării Genbank #BC143038 (haplotip 150K, 228I, 255K) de la aminoacidul 28 la 398, eliminând secvența semnal din aminoacizii 1–27 și cu adăugarea de N-terminal {{ 17}}Etichetele epitopului lui și T7 codificate de plasmida pET28a. Plasmidele care codifică variantele G1 și G2 au fost generate din pET-ApoWT prin substituirea fragmentului de restricție AleI la Xhol cu ​​fragmente care conțin secvențele variante, sintetizate de Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, iar identitatea plasmidelor rezultate a fost confirmată prin secvențiere directă. Toate cele trei construcții au fost identice, cu excepția substituțiilor de aminoacizi S342G și I384M în izoforma G1 și deleția N388-Y389 în izoforma G2. Izoformele ApoL1 recombinate au fost exprimate în bacterii și purificate așa cum este descris(8), cu excepția faptului că tamponul de coloană S200 conținea 0,03% n dodecil- -D-maltozidă (DDM) (Millipore-Sigma). Pentru toate seturile de experimente care compară izoforme, materialele au fost pregătite în același timp în condiții identice folosind aceiași reactivi. Concentrația de proteine ​​a fost determinată cu kit-ul de testare a proteinelor BCA (Thermo Fisher Scientific) utilizând standardul de albumină de ser bovin. Pentru proteina totală ca în Figura 1, gelurile au fost colorate cu Instant Blue (Expedeon Inc). Proteina din tampon S200 a fost congelată rapid în azot lichid și depozitată la -80 C. Alicotele au fost dezghețate pe gheață și diluate în tampon S200 înainte de analize.

Ionofori

Valinomicina (Millipore Sigma) a fost dizolvată la 50 mM etanol inabsolut și diluată la 1 mM în etanol absolut imediat înainte de utilizare. Clorura Ionofor 1 (MilliporeSigma) a fost dizolvată la 100 mM în 1-hexanol și diluată la 0,2 mM în etanol absolut imediat înainte de utilizare.

Vezicule membranare

Asolectina (fosfatidilcolină din soia tip II, Sigma) a fost extrasă cu acetonă așa cum este descris (30), uscată, apoi dizolvată în cloroform și depozitată la -20 C. O parte alicotă de fosfolipide în cloroform a fost uscată sub un curent de azot și suspendată. la 20 mg/ml în 200 mM KCI, 5 mM HEPES pH 8,0 prin cinci cicluri de îngheț-dezgheț și agitare puternică. Această suspensie a fost depozitată la –20 de grade. Pentru a genera vezicule unilamelare încărcate cu KCl cu un diametru de aproximativ 200 nm, suspensia de lipide a fost trecută de 15 ori printr-un filtru cu membrană de poropolicarbonat de 200 nm folosind o cameră de extruder (Avanti Polar Lipids) și protocolul furnizat de producător (17, 18). Veziculele extrudate au fost păstrate pe gheață și utilizate în 24 de ore.

Teste de activitate

Testele activității permeazei ionice utilizând efluxul de KCl determinat de potențialul membranei detectat cu un electrodecisor selectiv de clorură au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (9). Se adaugă douăzeci de microlitri de ApoL1 în tampon S200 (15{{20}} mM NaCl, 10 mM Tris pH8,3, 0,3 procente DDM) până la 380 ul amestec de reacție constând din KCI 82 mM, zaharoză 127 mM, tampon 42,1 mM la pH-ul indicat (MES pentru pH 5–6,5, HEPES pentru pH 7,0–8,0), 2,63 mMCa (gluconat)2 și 1,84 mg/ml izolectină extrudată vezicule. Amestecul este incubat la temperatura camerei timp de 4 minute înainte de trecerea printr-o coloană de spin de 3 ml Bio-Gel P-6DG (Bio-Rad) echilibrată în zaharoză 330 mM. Eluatul se adaugă imediat la 2 ml de zaharoză 330 mM, 10-5 M KCl, 2,5 mM Ca(gluconat)2 și tampon 10 mM (MES pentru pH 5–6,5; HEPES pentru pH 7–8), așa cum este indicat, cu monitorizare continuă cu un electrod selectiv de clorură și înregistrat așa cum este descris. După 20 s, efluxul condus de tensiune a fost inițiat prin adăugarea unui ionofor (2,5 ul de valinomicină 1 mM sau 0,2 mMClorură Ionofor 1 în etanol) și lăsat să continue timp de 30 s. urmată de adăugarea Triton X-100 la 0,1% pentru a elibera clorura intraveziculară rămasă. Datele brute în mV au fost convertite la concentrația CI utilizând o curbă standard generată pentru electrod în condițiile testului. Ratele inițiale fracționate de eliberare de clorură au fost derivate de la 3 s în timpul răspunsului imediat maxim la adăugarea de ionofor.

Toate comparațiile de activitate au fost efectuate folosind materiale din preparate simultane ale celor trei izoforme care au fost diluate la 100 ug/ml proteină în tampon S200 înainte de analiză. Toate testele utilizate pentru compararea directă între variante au fost efectuate în aceeași zi folosind aceiași agenți proaspăt pregătiți.

Testul de asociere a membranei

Testele de asociere a membranei au fost efectuate separat în condiții optime pentru activitatea permeazei Cl și pentru activitatea permeazei K. Pentru condițiile care susțin activitatea Clpermeazei, 5 ul de 100 ug/ml proteină în 1{{3{0}} mM Tris pH8,2, 15{0 mM NaCl , 0,03% DDM a fost adăugat la 95 ul de amestec de reacție (3,4 mg/ml vezicule de izolectină (încărcate cu 200 mM KCI, 5 mM HEPES pH 8), 20 mM MES pH 5,0, 2,5 mM Ca (gluconat) 2, 100 mM KCI, 100 mM zaharoză) și incubat la temperatura camerei timp de 1 min. Raportul proteină-lipidă din test este de 1:680 masă/masă. Proba a fost diluată fără schimbare a pH-ului prin adăugarea a 200 ul de 60 mM MES pH 5,0, 2,5 mMCa(gluconat)2, 100 mM KCI, 100 mM zaharoză și incubată timp de 20 s. S-au adăugat o sută de microlitri de uree 8 M, s-au amestecat și apoi s-au incubat la temperatura camerei timp de 15 min. Concentrația de zaharoză a fost adusă la 40% prin adăugarea a 1,6 ml de zaharoză 50%. Proba de 2 ml a fost stratificată sub 1 ml de 30% zaharoză în 8 mM MES pH 5,0, care a fost la rândul său sub 1,7 ml de 8 mM MES pH 5,0 fără zaharoză. Gradienții abrupti au fost centrifugați la 200,000g într-un rotor TLA-110 Beckman Coulter timp de 90 de minute la 4 C. Veziculele au fost colectate de la interfața de 0 până la 30% zaharoză. Fracțiuni egale de probe au fost diluate de 4 ori și centrifugate la 100,000g timp de 1 oră. Peletele de membrană au fost uscate, separate prin SDS-PAGE, membrană de fluorură de topoliviniliden tamponată și testate prin westernblotting cu anticorpi la epitopul T7 (produs MilliporeSigma nr. 69522-3) cu detecție prin chemiluminiscență utilizând un sistem de imagistică digitală. Pe gel au fost incluse diluții în serie de proteine ​​purificate pentru a genera un izotip și o curbă standard specifică pentru fiecare proteină.

Pentru condițiile care susțin activitatea permeazei K, 5 ul de proteină 100ug/ml în 10 mM Tris pH 8,2, 150 mM NaCl, 0,03% DDM au fost adăugate la 95 ul de amestec de reacție (3,4 ug/ml izolectinvezicule (încărcate cu 200 mM KCI, 5 mM HEPES pH 8), 20 mM MES pH 6,0, 2,5 mM Ca(gluconat)2, 100 mM KCl, 100 mM zaharoză) și incubat la temperatura camerei timp de1 min. Proba a fost diluată cu schimbarea pH-ului la 7,5 prin adăugarea a 200 ul de HEPES 60 mM pH 8,0, 2,5 mM Ca(gluconat) 2.100 mM KCI, 100 mM zaharoză și incubată timp de 20 s. S-au adăugat o sută de microlitri de 500 mM de Na2CO3 şi s-au incubat la temperatura camerei timp de 15 min. Concentrația de zaharoză a fost adusă la 40% prin adăugarea a 1,6 ml de zaharoză 50%. Proba de 2 ml a fost stratificată sub 1 ml de 30% zaharoză în 8 mM Tris pH 8,3, care a fost la rândul său sub 1,7 ml de 8 mM Tris pH 8,3 fără zaharoză. Pernele de zaharoză au fost centrifugate și o probă a fost colectată și procesată ca mai sus.

Statistici

Semnificația diferențelor dintre perechile de medii din seturile de date a fost determinată utilizând analiza varianței (ANOVA) (19). Parametrii statistici au fost determinați folosind o funcție încorporată în Excel. Valorile p au fost calculate folosind socscistatistics.com. Toate punctele de date sunt prezentate ca medie ± abatere standard (SD), determinată cu funcția STDEV.S a Excel pentru fiecare grup individual de replici.

Disponibilitatea datelorToate datele care sprijină această lucrare vor fi partajate la cerere Dr. John C. Edwards, john.edwards@health.slu.edu.

Cistanche poate tratarinichiboala

Mulțumiri— Mulțumim Diviziei de Nefrologie și Departamentului de Medicină Internă al Universității Saint Louis pentru sprijinul esențial pentru realizarea acestei lucrări.

Contribuții ale autorului—JCE a conceput și supravegheat studiul, a asigurat finanțare, a efectuat testele de eflux, a interpretat datele și a scris lucrarea; JB a purificat proteinele, a efectuat testele de asociere cu membrane, a interpretat datele, a pregătit cifrele și a editat lucrarea.

Finanțare și informații suplimentare— Lucrarea a fost finanțată de resursele instituționale ale Universității Saint Louis și de către National Institutes of Health grant R01 DK120651 către JCE. Conținutul acestei lucrări este responsabilitatea exclusivă a autorilor și nu reprezintă în mod necesar opiniile oficiale ale National Institutes of Health.

Conflict de interese—Autorii declară că nu au niciun conflict de interese cu conținutul acestui articol.

Abrevieri—Abrevierile folosite sunt: ​​ApoL1, apolipoproteinL1; CI1, clorură ionofor 1; DDM, n-dodecil- -D-maltozidă;PVDF, fluorură de poliviniliden; SD, abatere standard; Val, valinomicina.

De la: 'Rinichi-boala-variantele asociate ale Apolipoproteinei L1 prezintă câştig de funcţie în activitatea canalului cationic' deJonathan Bruno și John C. Edwards

---J. Biol. Chim. (2021) 296 100238

Referințe

1. Genovese, G., Friedman, DJ, Ross, MD, Lecordier, L., Uzureau, P., Freedman, BI, Bowden, DW, Langefeld, CD, Oleksyk, TK, Uscinski Knob, AL, Bernhardy, AJ, Hicks, PJ, Nelson, GW, Vanhollebeke, B., Winkler, CA și colab. (2010) Asocierea variantelor ApoL1 tripanolitice curinichiboalala afro-americani. Știința 329, 841–845
2. Parsa, A., Kao, WH, Xie, D., Astor, BC, Li, M., Hsu, CY, Feldman, HI, Parekh, RS, Kusek, JW, Greene, TH, Fink, JC, Anderson , AH, Choi, MJ, Wright, JT, Jr., Lash, JP și colab. (2013) Variante de risc APOL1, rasă și progresia cronicărinichiboala. N. Engl. J. Med. 369, 2183–2196
3. Friedman, DJ și Pollak, MR (2020) APOL1 șirinichiboala: De la genetică la biologie. Annu. Rev. Physiol. 82, 323–342
4. Bruggeman, LA, O'Toole, JF și Sedor, JR (2017) Identificarea funcției intracelulare a APOL1. J. Am. Soc. Nefrol. 28, 1008–1011
5. Kopp, JB, Roshanravan, H. și Okamoto, K. (2018) Apolipoprotein L1 nephropathies: 2017 in review. Curr. Opinează. Nefrol. Hipertens. 27, 153–158
6. Perez-Morga, D., Vanhollebeke, B., Paturiaux-Hanocq, F., Nolan, DP, Lins, L., Homble, F., Vanhamme, L., Tebabi, P., Pays, A., Poelvoorde, P., Jacquet, A., Brasseur, R. și Pays, E. (2005) Apolipoprotein LI promovează liza tripanozomilor prin formarea de pori în membranele lizozomale. Știința 309, 469–472
7. Harrington, JM, Howell, S. și Hajduk, SL (2009) Permeabilizarea membranei prin factor litic tripanozom, o lipoproteină umană citolitică de înaltă densitate. J. Biol. Chim. 284, 13505–13512
8. Thomson, R. și Finkelstein, A. (2015) Factorul tripanolitic uman APOL1 formează canale selective de cationi dependente de pH în straturile lipidice planare: relevanță pentru liza tripanozomului. Proc. Natl. Acad. Sci. SUA 112, 2894–2899
9. Bruno, J., Pozzi, N., Oliva, J. și Edwards, JC (2017) Apolipoprotein L1 conferă permeabilitate ionică comutabilă la pH veziculelor fosfolipide. J. Biol. Chim. 292, 18344–18353
10. Vanhollebeke, B. și Pays, E. (2006) Funcția apolipoproteinelor L. Cell Mol. Life Sci. 63, 1937–1944
11. Olabisi, OA, Zhang, JY, Verplank, L., Zahler, N., DiBartolo, S., 3rd, Heneghan, JF, Schlondorff, JS, Suh, JH, Yan, P., Alper, SL, Friedman, DJ și Pollak, MR (2016) APOL1rinichiboalavariantele de risc provoacă citotoxicitate prin epuizarea potasiului celular și inducerea
protein kinaze activate de stres. Proc. Natl. Acad. Sci. SUA 113, 830–837
12. O'Toole, JF, Schilling, W., Kunze, D., Madhavan, SM, Konieczkowski, M., Gu, Y., Luo, L., Wu, Z., Bruggeman, LA și Sedor, JR. (2018) Supraexpresia ApoL1 conduce la citotoxicitatea independentă de variantă. J. Am. Soc. Nefrol. 29, 869–879
13. Shah, SS, Lannon, H., Dias, L., Zhang, JY, Alper, SL, Pollak, MR și Friedman, DJ (2019) APOL1rinichivariantele de risc induc moartea celulară prin translocarea mitocondrială și deschiderea porului de tranziție a permeabilității mitocondriale. J. Am. Soc. Nefrol. 30, 2355–2368
14. Hayek, SS, Koh, KH, Grams, ME, Wei, C., Ko, YA, Li, J., Samelko, B., Lee, H., Dande, RR, Lee, HW, Hahm, E. , Peev, V., Tracy, M., Tardi, NJ, Gupta, V., şi colab. (2017) Un complex tripartit de suPAR, variante de risc APOL1 și integrină alfavbeta3 pe podocite mediază cronicarinichi boala. Nat. Med. 23, 945–953
15. Ma, L., Chou, JW, Snipes, JA, Bharadwaj, MS, Craddock, AL, Cheng, D., Weckerle, A., Petrovic, S., Hicks, PJ, Hemal, AK, Hawkins, GA, Miller, LD, Molina, AJ, Langefeld, CD, Murea, M., et al. (2017) Variantele cu risc renal APOL1 induc disfuncție mitocondrială. J. Am. Soc. Nefrol. 28, 1093–1105
16. Wan, G., Zhaorigetu, S., Liu, Z., Kaini, R., Jiang, Z. și Hu, CA (2008) Apolipoprotein L1, a roman Bcl-2 omology domain {{4 }}numai proteina de legare a lipidelor, induce moartea celulelor autofagice. J. Biol. Chim. 283, 21540–21549
17. Hope, MJ, Bally, MB, Webb, G. și Cullis, PR (1985) Producția de vezicule unilamelare mari printr-o procedură de extrudare rapidă: Caracterizarea distribuției mărimii, a volumului prins și a capacității de a menține un potențial de membrană. Biochim. Biophys. Acta 812, 55–65
18. Olson, F., Hunt, CA, Szoka, FC, Vail, WJ, și Papahadjopoulos, D. (1979) Prepararea lipozomilor cu distribuție de dimensiune definită prin extrudare prin membrane de policarbonat. Biochim. Biophys. Acta 557, 9–23
19. Armitage, P. (1971) Statistical Methods in Medical Research, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Regatul Unit