Deficiența factorului A de transcripție mitocondrială țintită epitelială renală are ca rezultat epuizarea mitocondrială progresivă asociată cu boala chistică severă
Mar 23, 2022
A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Ken Ishii, Hanako Kobayashi, Kensei Taguchi și colab.
INTRODUCERE
Disfuncția mitocondrială (mt) este o caracteristică patologică bine-cunoscută a bolilor renale comune și poate declanșa leziuni celulare, inflamații și fibroză. În rinichi, celulele epiteliale tubulare sunt foarte dependente de adenozin trifosfat (ATP) generat din fosforilarea oxidativă (OXPHOS), deoarece îndeplinesc multiple funcții de transport epitelial consumatoare de energie. Prin urmare, susținerea producției eficiente de mt ATP este esențială pentru funcționarea normală a rinichilor și homeostazia electrolitică sistemică. În plus, dovezile recente indică faptul că mitocondriile au un rol major în reglarea genelor, semnalizarea celulară și diferențierea celulară prin generarea de metaboliți intermediari și specii reactive de oxigen (ROS).2 În ciuda acestor progrese, rolul semnalizării mt în patogeneza bolile de rinichi comune nu sunt bine înțelese.
Pentru a investiga funcția mt în homeostazia și patogeneza renală, noifactorul de transcripție mitocondrial țintit A(TFAM). TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)este un factor codificat nuclear esențial pentru funcția mt, menținerea numărului de copii mt și stabilitatea structurală a ADN-ului mt, deoarece reglează replicarea și transcripția genomului mt prin îndoirea ADN-ului promotor3. ADN-ul mt de mamifer conține 37 de gene, dintre care 13 codifică subunități proteice ale complexului lanțului respirator, 22 codifică ARN de transfer și 2 ARN ribozomal. Prin urmare,TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)este direct implicat în reglarea transportului de electroni mt și a sintezei ATP prin transcripția genelor, cum ar fi citocromul b(MT-CYB) codificat mitocondrial, subunitatea 1 a citocromului c oxidază codificat mitocondrial (MT-CO1) și subunitatea membranară ATP sintetază codificată mitocondrial. 6 (MT-ATP6).3FărăTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A), celulele își pierd capacitatea de a produce ATP prin OXPHOS, nu pot genera cantități semnificative de mt ROS și se epuizează progresiv de mitocondrii. - Studiile genetice au arătat căTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)este esenţială pentru embriogeneza normală deoarece globală homozigotăTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)inactivarea a dus la letalitate intrauterină în ziua 10,5 embrionară, în timp ce deficiența heterozigotă, deși a redus numărul de copii mt cu -40 procente și a dus la deficiența lanțului respirator, nu a condus la letalitate embrionară. Astfel, țintirea genetică aTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A) este o strategie experimentală utilă pentru examinarea rolului disfuncției mt progresive în diferențierea celulară și homeostazia tisulară. Inactivarea condiționată specifică tipului de celule aTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)a sugerat că generarea OXPHOS și/sau mt ROS este esențială pentru diferențierea celulară, funcționarea și fiziologia normală.-1o
Tulburările primare mt datorate mutațiilor nucleare sau ale genei mt se pot prezenta cu o boală de rinichi cel mai frecvent manifestată ca leziune tubulointerstițială sau disfuncție tubulară izolată.1,12 Deși sunt implicate în patogeneza anumitor boli umane, cum ar fi tulburările neurodegenerative, mutații specifice în TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)care cauzează boli renale nu au fost raportate. Mai recent, redusTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)expresia a fost legată de boala cronică de rinichi. Pierderea integrității mt din cauzaTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)inactivarea a cauzat boală tubulointerstițială și insuficiență renală la șoareci, care s-a datorat parțial activării răspunsurilor inflamatorii dependente de genele interferonului (STING) induse de stres ciclic GMP-AMP sintază (cGAS) indusă de stres.
Aici raportăm că șoarecii cu condiționalTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A) inactivarea în celulele progenitoare de nefron care exprimă sinus oculis homeobox 2(SIX2) dezvoltă boală chistică severă și mor prematur din cauza insuficienței renale ca șoareci tineri.TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-/-șoarecii au fost caracterizați prin defecte în maturarea nefronului, care a fost asociată cu epuizarea mt, o reducere a OXPHOS și o schimbare metabolică către glicoliză înTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-7-epiteliul renal. Având în vedere severitatea bolii chistice înTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-7-șoareci, am analizat 2 modele de șoarece de boală polichistică a rinichilor (PKD), care rezultă din mutații fie ale policistinei-1 (Pkd1) fie ale cistinei-1 (Cys1), precum și ale omului țesuturi de la pacienții cu boală polichistică renală autosomal dominantă (ADPKD). Stabilim astaTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)este dereglată în chisturile atât din țesuturile PKD murine cât și umane. Luate împreună, studiile noastre sugerează că TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)dereglarea și epuizarea mt sunt trăsături caracteristice bolilor chistice renale și pot avea un rol contributiv în patogeneza lor.
REZULTATE
TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)inactivarea în celulele liniei SIX2 determină boală chistică severă care are ca rezultat insuficiență renală
Pentru a investiga funcția mt în epiteliul renal, am inactivatTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)în șase2-celule progenitoare care exprimă, care dau naștere la toate segmentele de nefron, cu excepția ductului colector (CD).15 Pentru aceasta, am traversatTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)alela floxed cu șoareci transgenici cu cromozomi artificiali bacterieni care exprimă o proteină verde fluorescentă îmbunătățită/proteina de fuziune a recombinazei Cre (eGFP/Cre) sub controlul transcripțional al promotorului Six2 (Figura la). „Șoareci homozigoți pentruTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)alela floxată și heterozigotă pentru gena trans eGFP/Cre (Șase2-eGFP/Cre plus; T fam) sunt denumite de aici încolo șase2-Tfam-/- mutanți. Șase2-șoareci Tfam-/- s-au născut în raporturi mendeliane așteptate și nu au fost distinși de martorii Cre-littermate prin inspecție vizuală la naștere. Cu toate acestea, diferențele de greutate corporală între șase2-TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A){{{0}}mutanții și martorii Cre-littermate au devenit evidente în ziua postnatală(P)14(5,7±0,3g pentru mutanți vs.7,5±0,3g pentru martori,n{{11} } fiecare, P=0.004; Tabel suplimentar S1). Șase2-TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A) Șoarecii mutanți au fost caracterizați prin rinichi măriți în comparație cu martorii (raportul rinichi/greutate corporală de 1,45% ± 0,19% pentru mutanți vs.0,60% ±0,02% pentru control , n=4 fiecare, P<0.001; figure="" lb,="" supplementary="" table="" s1)and="" died="" between="" age="" p20="" and="" p30(figure="" lb).="" juvenile="" lethality="" in="" the="" mutant="" cohort="" was="" associated="" with="" renal="" failure="" from="" severe="" cystic="" disease="" with="" blood="" urea="" nitrogen="" levels="" of="" 68.40±5.32="" mg/dl="" for="" mutant="" mice="" versus="" 16.8±2.0mg="" dl="" for="" controls(n="6" and="" 7,="" respectively;=""><0.0001; figure="" lb="" and="" c).="" furthermore,="">TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-7- mutanții au dezvoltat albuminurie semnificativă (raportul albumină/creatinină în urină=362,4 ± 75,18 mg/g în șase2-TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)--mutanți față de 43,58±3,39 mg/g la martori la P14, n=6 și respectiv 10;P<0.0001). this="" is="" consistent="" with="" the="" expression="" pattern="" of="" cre="" recombinase="" in="" six2="" nephron="" progenitor="" cells,="" which="" give="" rise="" to="" cap="" mesenchyme-derived="" renal="" tubules="" and="" podocytes.="" in="" contrast="" to="">TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-'mutanți, șoareci cu heterozigoțiTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)deficiența în celulele progenitoare SIX2 dezvoltate în mod normal au fost fertile și nu au dezvoltat boală renală evidentă (Figura suplimentară S1).
Figura 1|Inactivarea Tfam în celulele liniei SIX2 are ca rezultat boală chistică severă și insuficiență renală.(a) O schemă care ilustrează abordarea experimentală și locația secvențelor vizate în alela Tfam floxed. Analiza reacției în lanț a polimerazei a ADN-ului total de rinichi genomic izolat din controlul littermate (Cre) și Six{{0}}Tfammice la vârsta de ziua postnatală (P) 7; alela Tfam floxată nerecombinantă este notată cu 2-lox (2); alela recombinată prin 1-lox, alela de tip sălbatic prin wt; þ sau - indică prezența sau absența transgenei Six2-eGFP/Cre. (b) Panouri din stânga, fotografii cu rinichi de la control Cre și șoareci Six2-Tfam la vârsta de 20 de ani. Greutățile rinichilor (KW) sunt exprimate ca procent din greutatea corporală (BW) (n ¼ 4–14). Panouri din dreapta, nivelurile de azot ureic din sânge (BUN) la șoarecii de control Cre littermate (co) și Six2-Tfam la vârsta P7 (n ¼ 7 și, respectiv, 6) și curbele de supraviețuire Kaplan-Meier pentru controlul Cre și Six{ {16}}Șoarecii Tfam în comparație cu testul log-rank (n ¼ 10–13). (c) Imagini reprezentative ale secțiunilor de rinichi fixate în formol, încorporate în parafină de la șoareci de control Cre și Six2-Tfam la vârsta P7 și P29 colorate cu hematoxilină și eozină (H&E) și analizate prin imunohistochimie pentru actina musculară netedă (ACTA2) și antigenul de diferențiere în cluster (CD) 31. Semnele numerice descriu structurile chistice, iar asteriscurile descriu glomeruli. Bare ¼ de 1 mm pentru secțiuni transversale întregi ale rinichilor, 100 mm pentru imagini H&E de mare putere și 50 mm pentru imagini IHC. Datele sunt exprimate ca SEM mediu și au fost analizate prin 2-testul t Student cu coadă. ***P < 0,001.="" pentru="" a="" optimiza="" vizualizarea="" acestei="" imagini,="" vă="" rugăm="" să="" vedeți="" versiunea="" online="" a="" acestui="" articol="">www.kidney-international.org.
cistanche beneficii masculine
Analiza celor șase2-TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-/-șoarecii, care au exprimat, de asemenea, alela reporter ROSA26-ACTB-tdTomato,-eGFP Cre, denumită aici șase2-mT/mG;TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-7 șoareci, ceea ce indică faptul că marea majoritate a structurilor chistice înTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-/- rinichi (Figura suplimentară S3). Aceste constatări sunt în concordanță cu nivelurile crescute ale kinazei reglate de semnal extracelular fosforilat (p-ERK) și -cateninei în șase2-TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-/- țesut renal (Figura suplimentară S3). Luate împreună, datele noastre indică faptul că șase2-TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-/ rinichii prezintă caracteristici moleculare care sunt frecvent asociate cu bolile chistice renale.
Maturarea nefronului este defectuoasă în Six2-TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-/șoareci Deoarece poate dura până la câteva săptămâni înainte de șoareci cu țesut specificTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)inactivarea dezvoltării patologiei, apoi am examinat evoluția în timp a dezvoltării bolii renale în șase2-TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A){{0}}șoareci. Am colectat rinichi de la șoareci martor și mutanți la vârstele P0, P7 și P14 și am folosit metode histologice, colorare prin imunofluorescență (IF) și analiza expresiei genelor în extracte de rinichi întregi pentru evaluare. Colorația IF pentru SIX2 și E-cadherină la vârsta P0 a demonstrat că rinichii de control și Sic2-TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-/-au fost similare histologic. Formarea structurilor de zone nefrogene corticale, cum ar fi mezenchimul SIX2 plus capac, vârfurile ureterelor care exprimă E-caderina și structurile nefronice în curs de dezvoltare, cum ar fi veziculele renale și corpurile în formă de virgulă și în formă de S, nu a fost blocată în Six{{7} }TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-7- rinichi (Figura 2a). Aceste constatări histologice au fost în concordanță cu nivelurile de expresie ale genelor care codifică markerii nefrogenici. Six2, cutia împerecheată 2 (Pax2), proteina LIM homeobox 1 (Lhx1) și nivelurile de factor de transcripție 1(Sall)mRNA de tip spalt nu au fost semnificativ diferite între control și Six2-TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-/șoareci în omogenate renale totale din rinichi P0 (Figura 2b). Aceasta a sugerat căTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)inactivarea în progenitorii de nefroni SIX2 nu a afectat semnificativ formarea structurilor nefrogene.
Figura 2|Maturarea nefronului este defectuoasă la șoarecii Six2-Tfam-7.(a) Imagini reprezentative ale secțiunilor fixate în formol, încorporate în parafină de la controlul Cre~ și Six2-Tfam-/rinichi la vârsta după ziua (P) 0. Secțiunile de rinichi au fost colorate cu albastru de toluidină și analizate prin imunofluorescență pentru expresia homeobox 2 (SIX2) legată de sine oculis și E-cadherin (ECAD). Arborii ureterelor sunt conturați de linii albe întrerupte. Mezenchimul capacului (CM), corp în formă de virgulă (CSB), corp în formă de S (SSB) și vârful ureteral (UT) sunt adnotate. (b) Panoul din stânga, nivelurile relative de exprimare a ARNm ale markerilor de dezvoltare printr-o reacție cantitativă a polimerazei în lanț în omogenații totale de rinichi de la șase2-Tfam-/mutanți la vârsta PO în comparație cu martorii Cre littermate (n =6 fiecare ). Panoul din dreapta, expresia genei glomerulară (glom) și segmentul nefronului specific în totalul omogenaților de rinichi de la șase2-Tfam7mutanți la vârsta P7 în comparație cu martorii Cre-littermate (n =4 fiecare). PT, tubul proximal; mTAL, membru gros ascendent al lui Henle; DT, tubul distal; CD, canal colector. (c) Secțiuni de rinichi colorate cu albastru alcian/acid periodic Schiff (AB-PAS) la vârsta P0, P7 și P14. Săgețile indică tubulii PAS pozitivi cu marginea pensulei, asteriscurile reprezintă glomerulii, iar semnele numerice reprezintă tubulii chistici, Barele=100 um pentru imaginile AB-PAS și 50 um pentru imaginile colorate cu albastru toluidină și imaginile IF. Datele sunt exprimate ca medie± SEM;2-testul t Student cu coadă;*P<><><0.001.agp1,aquaporin 1;agp2,aquaporin="" 2;lhx1,lim="" homeobox1;napi2a,="" sodium-phosphate="" cotransporter="" 2a;="" ncc,="" thiazide-sensitive="" sodium-chloride="" cotransporter;="" nkcc2,="" sodium-potassium-chloride="" cotransporter="" 2;pax2,="" paired="" box="" 2;="" sall1,="" spalt="" like="" transcription="" factor="" 1;="" scnn1a,="" epithelial="" sodium="" channel="" 1="" alpha="" subunit;="" trpv5,="" transient="" receptor="" potential="" cation="" channel="" subfamily="" v="" member="" 5;="" umod,="" uromodulin.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">www.kidney-international.org.
recenzii cistanche
Deși formarea nașterii structurii nefronului nu a fost inhibată, colorarea cu albastru alcian/acid periodic-Schiff și lectină de lotus tetragonolobus a indicat o maturare terminală defectuoasă a nefronului la șase2-TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A){{0}}șoareci la vârsta P0. Alcian albastru/acid periodic-Schiff, care colorează membranele bazale tubulare și marginea periei, și lectina de lotus tetragonolobus, care identifică oligozaharide specifice în marginea periei a celulelor tubulare proximale, au fost ambele scăzute în rinichii mutanți. Figura 2c prezintă colorarea cu albastru alcian/acid periodic-Schiff la punctele de timp P0, P7 și P14. Histochimia lectinei Lotus tetragonolobus și colorarea IF pentru proteina Wilms tumora 1 la momentele de timp P{0, P7 și P14 sunt prezentate în Figura suplimentară S4. La vârsta PO, aria relativă care s-a colorat pozitiv cu lectina de lotus tetragonolobus a fost de 2,10 procente ±0,51 la sută și 0,39 la sută ± 0,1 la sută la vârsta P7 față de 6,25 la sută ± 0,28 la sută și, respectiv, 6,2 la sută ± 1,1 la sută pentru martori (n=3-4, P=0, 0004 și 0,0007, respectiv; Figura suplimentară S4). În concordanță cu aceste constatări histologice este scăderea semnificativă a expresiei genelor care codifică markerii specifici pentru segmentul glomerular și nefron podocină, nefrină, acvaporină 1 (Agp1), cotransportor fosfat de sodiu 2a (NaPi2a), uromodulină, cotransportator sodiu-potasiu-clorură 22 (Nkcc2) și cotransportator clorură de sodiu sensibil la tiazidă (Ncc) în șase2-TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-/ șoareci (Figura 2b). Luate împreună, aceste date sugerează că șase2-TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-/- rinichii prezintă o reducere progresivă a numărului de segmente nefronice proximale mature și glomeruli.
Deoarece activitatea Six2-eGFP/Cre are ca rezultatTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-segmentele de nefron derivate din mezenchimul capac deficitar, am prezis că maturarea celulelor epiteliale CD, care sunt derivate din muguri ureterali, nu va fi afectată în șase2-TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-/ rinichi. În concordanță cu această noțiune este că colorarea cu aglutinină Dolichos biflorus, care reacționează cu N-acetil-D-galactoză în tubul distal și CD, a indicat o relativă suprareprezentare a structurilor Dolichos biflorus pozitive pentru aglutinină în șase2-TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-/- rinichi. La vârsta de 7 ani, zonele colorate pozitiv pentru Dolichos biflorus aglutinina cuprindeau 13,91% ±0,9% din suprafața totală pentru mutanți față de 1,93% ± 0,1% pentru martor (n {{11} }, P=0.0002; Figura suplimentară S4).Expresia ARNm a subunității alfa 1 epitelială a canalului de sodiu (Scnnla) sau a acvaporinei 2 (Agp2), care sunt ambele exprimate în celulele epiteliale CD, nu a fost semnificativ scăzută în comparație cu controlul (Figura 2b). Spre deosebire de șase2-TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-/-rinichi,TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)inactivarea în celulele progenitoare homeobox B7 (HOXB7), care dau naștere la celule epiteliale CD, ducând la pierderea expresiei markerului de nefron CD și o dilatare tubulară ușoară, dar nu și cistogeneze (Figura suplimentară S5). Luate împreună, datele noastre indică faptul că pierdereaTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)funcția în celulele progenitoare SIX2 nu blochează dezvoltarea structurilor nefronice în curs de dezvoltare, dar inhibă maturarea nefronului terminal.
TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-/-chisturile sunt deficitare în markerii comuni ai segmentului nefron
Pentru a caracteriza originea histogenetică aTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-7chisturile renale, am efectuat analize IFTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-/kidneys at age P14 and examined the expression of nephron segment markers megalin (proximal tubule), uromodulin (medullary thick ascending limb of Henle), thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter(distal tubule), and aquaporin 2(CD). The majority of cysts with a maximal diameter of>50 um did not express these segment-specific markers, indicating a lack of cellular differentiation(Figure 3a, Supplementary Figure S6). Furthermore, approximately 50% of cysts with a maximal diameter of >50 um s-au caracterizat prin depozite intraluminale de uromodulină, care sugerează originea din segmentele de nefron distal de tubul proximal și bucla descendentă a lui Henle (Figura 3b).
Figura 3ITfam-/chisturile nu exprimă markeri comuni specifici segmentului de nefron.(a)Representative images of formalin-fixed, paraffin-embedded kidney sections from Six2-mT/mG; Tfam-mice at age postnatal day (P) 14 stained for enhanced green fluorescent protein (eGFP), megalin, uromodulin, thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter (NCC), and aquaporin 2(AQP2)by immunofluorescence (IF). 4'6-diamidino-2-phenylindole was used for nuclear staining (blue fluorescence). Arrows depict tubular structures expressing respective nephron segment-specific markers. Nephron segment marker expression was assessed in cysts with a maximal diameter of >50 um. (b) Imagini reprezentative ale secțiunilor de rinichi fixate în formol, încorporate în parafină de la șase 2-mT/mG; Șoarecii Tfam-7la vârsta P14 colorați pentru eGFP și uromodulină prin IF. Asteriscurile reprezintă chisturi cu uromodulină intraluminală. Prezența uromodulinei intraluminale a fost examinată în chisturile cu un diametru maxim fie de 50-100 um, fie în chisturile cu diametrul maxim mai mare de 100 um. Bare =(a,b)100 um. Pentru a optimiza vizualizarea acestei imagini, vă rugăm să vedeți versiunea online a acestui articol la www kidney-international.org.
Anomalii progresive ale funcției și morfologiei mt înTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-7-celule epiteliale
Pentru a caracteriza cursul în timp al consecințelor metabolice aleTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)ștergerea, am examinat mai întâi nivelurile de ARNm deTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)șiTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-mt-Col, mt-Cyb și mt-Atp6 reglațiTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-/- rinichi la vârsta PO, P7 și P14. Cum era de așteptat,TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)Nivelurile de ARNm , mt-Col, mt-Cyb și nt-Atp6 au fost reduse semnificativ (Figura 4a). Celulele epiteliale T fam-7- etichetate cu eGFP (Șase 2-mT/mG; șoareci Tfam{-7) au prezentat o reducere semnificativă a expresiei proteinei MT-CO1 (Figura suplimentară S7). Numărul de copii ADN mt a fost redus cu 63 la sută, ceea ce este în concordanță cu epuizarea mt, un semn distinctiv alTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)deficiență (Figura 4a). În schimb, expresia genelor nucleare care codifică nicotinamidă adenin dinucleotidă: subunitatea centrală 3 (Ndufs3) ubichinonă oxidoreductază și subunitatea flavoproteină A complexului succinat dehidrogenază (Sdha) nu a fost afectată la vârsta P{3}, dar a fost redusă la vârsta P7 și P14. (Figura 4a). Aceste constatări din analiza genei și proteinei mt sunt în concordanță cu pierderea progresivă a numărului de copii mt în Tfam-/-epiteliu.
Apoi am investigat efectele metabolice aleTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)inactivare în celulele epiteliale tubulare proximale primare (PTEC) izolate la vârsta P7.TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-7 PTEC-urile au prezentat reduceri semnificative ale ratelor de consum bazal de oxigen (40,77 ± 4,10 pentru mutanți față de 61,75± 5,18 pmol/min/10 celule pentru martori, n=3 fiecare, P= 0,034 ), respirație legată de ATP (33,11 ± 3,91 pentru mutanți față de 46,92 ± 4,91 pmol/min/10* celule pentru martori, n=3 fiecare, P=0 0,093), respirație maximă (116,8 ± 14,19 pentru mutanți față de 225,5 ± 13,55 pmol/min/10* celule pentru martori, n= 3 fiecare, P{=0,005) și capacitate respiratorie de rezervă (76,05 ± 10,18 pentru mutanți față de 163,7 ± 163,7 ± 8,61 pmol/min/10* celule pentru controale, n=3 fiecare, P{= 0,003; Figura 4b).
cistanche reddit
Pentru a caracteriza în continuare gradul de epuizare și deteriorare a mt, am examinatTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-/- rinichi prin microscopie electronică cu transmisie și 3-microscopie cu iluminare structurată dimensională (3D SIM). La vârsta de 7 ani, mitocondriile prezentau forme neregulate și balonare, care sunt în concordanță cu descoperirile anterioare înTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)soareci knockout. Analiza microscopică electronică cu transmisie a indicat că anomaliile structurale ale mitocondriilor, cum ar fi mărimea crescută și cristae anormale, au progresat postnatal, deoarece diferențele morfologice dintre mutanți și control au fost mai puțin evidente la vârsta P0 și au devenit mai severe odată cu vârsta (Figura 4c). ).3D SIM a fost folosit pentru a examina volumul mt și dimensiunea rețelei în șase2-mT/mG;TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-/ mutanți în comparație cu șoareci martor de șase2-mT/mG la vârsta de 7 ani; Volumul mt a fost măsurat în secțiuni transversale de 5 până la 8 tubuli pe secțiune, examinând 25 până la 40 celule epiteliale corticale eGFP-pozitive colorate pentru canalul 1 selectiv anion-dependent de tensiune prin colorare IF. Am descoperit că volumul total de mt per celulă eGFP-pozitivă a scăzut semnificativ (62,66 ± 16,46 um/celulă pentru mutanți față de 177,4±30,17 μm'/celulă pentru martori, n=3 fiecare , P= 0.{0289) și a fost asociat cu o modificare a raportului volumului total de mt pe volumul total al celulei de la 0,230 ±0,01 în controale la 0,089 ± 0,016 în șase 2-TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-7 mutanți (n= 3 fiecare, P=0.0017; Figura 4c). Dimensiunea maximă a rețelei mt, care măsoară cea mai mare rețea mt întâlnită în toate celulele eGFP pozitive examinate, a fost scăzută în șase2-TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-/ rinichi (143,2 ± 23,2 μm² pentru mutanți față de 318,3 ± 49,45 um² pentru controale, n= 3 fiecare, P= 0,0327). Luate împreună, constatările ultrastructurale și SIM și constatările din analiza genei și proteinei mt sunt în concordanță cu pierderea progresivă a numărului de copii mt înTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-7-epiteliu.
Figura 4| Epiteliul Tfam-/renal se caracterizează prin epuizare mitocondrială progresivă.(a) Expresia genei mitocondriale (mt) prin reacția cantitativă a polimerazei în lanț la vârsta zilei postnatale (P) {{0}}, P7 și P14 (schimbare de ori peste control, n =6 fiecare) și Conținutul mt ADN (P7) în omogenații totale de rinichi de la Cre~ littermate control (co) și Six2-Tfam-/șoareci. (b) Rata de consum de oxigen (OCR) în celulele epiteliale tubulare proximale primare (PTEC) izolate din controlul Cre littermate și Six2-7fam-kidney la vârsta P7 pe o platformă Seahorse XFe24. Măsurători reprezentative OCR în control și Tfam-7PTEC tratate cu oligomicină A (oligo A, inhibarea adenozin trifosfat [ATP] sintaza), cianură de carbonil-p-trifluor metoxifenil hidrazonă (FCCP, decuplator) și inhibitori ai fosforilării oxidative rotenonei și antimicină A(AA). Sunt prezentate, de asemenea, respirația bazală și maximă calculată, respirația legată de ATP și capacitatea respiratorie de rezervă (n =3 fiecare). (c) Analiza ultrastructurală a mitocondriilor prin microscopie electronică cu transmisie. Imagini microscopice electronice cu transmisie reprezentative ale secțiunilor de rinichi de la șoareci Cre control și șase2-Tfam-7 la vârsta P0 și P7, săgețile roșii descriu mitocondriile. Bară=500 nm. (d) Imagini de microscopie cu iluminare structurată tridimensională ale secțiunilor de rinichi de la șase2-mT/mG (co) și șase2-mT/mG; Tfam-/-şoarecii la vârsta P7. Proteina verde fluorescentă îmbunătățită (eGFP), subunitatea 4 a citocromului c oxidază (COXⅣ) și canalul 1 selectiv anion-dependent de tensiune (VDAC a fost detectat prin imunofluorescență.4',6-diamidino{-2-fenilindol (DAP) ) a fost folosit pentru colorarea nucleară (fluorescență albastră). Liniile albe întrerupte conturează tubul renal în control și lumenul chistului în rinichiul mutant, iar semnele numerice descriu lumenul tubular în control sau lumenul chistului în rinichiul mutant. Aria mt a fost cuantificată cu Imaris software (Oxford Instruments, Abingdon, Marea Britanie; n =3 fiecare). Volumul total (tot) mt (vol) per celulă eGFP-pozitivă (25-40 celule/probă analizată), raportul dintre volumul total mt pe volumul total al celulei și dimensiunea maximă (max.) a rețelei mt per celulă. Mărimea rețelei mt a fost determinată într-o secțiune transversală tubulară cu 5 celule pe secțiune transversală. Bare =4 um. Datele sunt reprezentate ca medie± SEM și au fost analizate prin testul t Student.*P<><><0.001, mt-atp6,="" mitochondrially="" encoded="" atp="" synthase="" membrane="" subunit="" 6;="" mt-co1,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" c="" oxidase="" 1;="" mt-cytb,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" b;="" ndufs3,="" nadh:="" ubiquinone="" oxidoreductase="" core="" subunit="" s3;="" sdha,="" succinate="" dehydrogenase="" complex="" flavoprotein="" subunit="" a;="" tfam,="" mitochondrial="" transcription="" factor="" a.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)deficiența determină metabolismul epitelial renal către glicoliză
PTEC-urile din rinichi folosesc oxidarea acizilor grași și OXPHOS pentru generarea de ATP și sunt gluconeogenetice. grad Pentru a obține informații suplimentare asupra modificărilor metabolice asociate cu inactivarea Tam, am efectuat o analiză de secvențiere a ARN a rinichilor din Six2-TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-/-și Cre~ șoareci de control al littermate la vârsta P7. Am descoperit că genele de reglare cheie implicate în glicoliză, cum ar fi hexokinaza 2 (Hk2) și enolaza 2 (Eno2), au fost reglate. În schimb, expresia majorității genelor implicate în ciclul acidului tricarboxilic a fost scăzută (de exemplu, izocitrat dehidrogenaza 1[Idh1), la fel ca și expresia genelor implicate în oxidarea acizilor grași, cum ar fi acetil coenzima A aciltransferaza 1B(Acaalb), acil-coenzima A dehidrogenază cu lanț mediu (Acadm) (Figura 5a și b, Figura suplimentară S8). În concordanță cu scăderea expresiei genelor implicate în controlul ciclului acidului tricarboxilic și a rinichilor mutanți la vârsta P7 folosind o platformă Seahorse XFe24 (Agilent, Santa Clara, CA). PTEC-urile mutante au fost caracterizate printr-o creștere semnificativă a glicolizei bazale (rata de eflux de protoni=117,4 ± 12.07 pmol/min pentru mutanți și 73,34 ± 6,33 pmol/min pentru control, n{{25). }}, P=0.{{30}}032) și o scădere a raportului dintre rata consumului de oxigen mt față de rata de eflux de protoni glicolitici de la 0,73 ± 0,08 la control la 0,34 ± 0,02 în PTEC-uri mutante (n=3, P=0.0074). Luate împreună, aceste date indică faptul căTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-/- celulele epiteliale au suferit o schimbare metabolică de la OXPHOS și oxidarea acizilor grași către glicoliză (Figura 5d).
Figura 5] Deficiența factorului de transcripție mitocondrial A (TFAM) epitelial renal este asociat cu glicoliză crescută și metabolism anormal al acizilor grași.(a) Analiza exprimării genelor metabolice prin secvențierea ARN a cortexului întregului rinichi izolat de la șoareci de control (co) șase2-Tfam-/- și Cre-littermate la vârsta postnatală (P) 7 (n {{6 }} fiecare). Sunt prezentate gene metabolice reglate diferențiat implicate în glicoliză și ciclul acidului tricarboxilic. Genele cu o creștere semnificativă statistic a expresiei ARNm sunt afișate în roșu, iar genele cu expresie scăzută sunt afișate în verde. (b) Nivelurile de expresie ARNm ale genelor selectate reglate diferențial prin reacția cantitativă în lanț a polimerazei (n=4-6). (c) Metabolismul acizilor grași modificat la șoarecii mutanți Six2-7Tfam-7. Imagini reprezentative ale secțiunilor de rinichi colorate cu roșu ulei O de la șoareci de control Six{2-Tfam-7 și Cre-littermate la vârsta de 14 ani. Săgețile indică celulele O-pozitive roșii ulei, iar numărul sian reprezintă costul. Bar=10 um.(d) Analiza fluxului glicolitic al celulelor epiteliale tubulare proximale primare (PTEC) izolate din controlul Cre littermate și șase2-Tfam-/rinichi la vârsta P7 (n=4 fiecare ) pe o platformă Seahorse XFe24. Sunt prezentate măsurători reprezentative ale ratei de eflux de protoni glicolitici (glicoPER) în controlul și Tfam-7PTEC tratate cu 2-deoxiglucoză ({2-DG) și inhibitori de fosforilare oxidativă rotenonă și antimicină A(AA) . De asemenea, sunt prezentate glicoPER mediu la momentul inițial și raportul dintre rata consumului de oxigen mitocondrial (mt) (OCR) față de glico PER. Datele sunt reprezentate ca medie ± SEM și au fost analizate folosind testul t Student. (Continuare)
RedusTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)expresia în țesuturile PKD murine și umane este asociată cu epuizarea mt
Pentru că șase2-TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-/ rinichii au o asemănare puternică cu rinichii PKD, apoi am evaluat dacăTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)a fost dereglată în țesuturile PKD. Am examinat mai întâiTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)și expresia genelor reglate de TFAM în 2 modele de șoarece PKD genetice bine stabilite.TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)Nivelurile de ARNm au fost reduse semnificativ în omogenații întregi de rinichi de la șoarecii Pkd1-/- și Cyspk/pk, care poartă mutații fie în Pkd1, fie în Cys1. Acest lucru a fost asociat cu o scădere a expresiei genelor mt codificate mitocondrial și nuclear, precum și cu expresia dereglată a genei glicolitice. Similar cu Six2-TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)-/ rinichii, rinichii Pkd1-7 și CysPkpk au fost caracterizați prin niveluri crescute de Eno2 și Hk2 și o scădere semnificativă a fosfoglicerat kinazei (Pkg)1, piruvat dehidrogenază kinazei (Pdk)1 și Pdk4 (Figura 6a).TFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)expresia proteinei, așa cum a fost evaluată prin colorarea IF, a fost redusă în celulele epiteliale care căptușesc chistul în comparație cu celulele epiteliale din tubulii non-chistici adiacenți (Figura 6b). Acest lucru a fost asociat cu expresia redusă de mt-Co1 și mt-Atp6 prin hibridizarea in situ cu fluorescență ARN (Figura 6b, Figura suplimentară S9); Volumul mt, determinat de SIM 3D, a fost redus cu 55 la sută în comparație fie cu celulele epiteliale din tubii adiacenți, non-chistici, fie cu PTEC-urile de la rinichi normali de control. Nu s-au găsit diferențe în volumul mt între PTEC-urile de control normale și PTEC-urile de la tubii non-chistici (Figura 6c).
Figura 6| Expresia factorului de transcripție mitocondrial A (TFAM) este redusă în chisturile renale Pkd1-7-și CysPkepk.(a) Nivelurile relative de expresie a ARNm (schimbarea orificiilor față de controlul Cre littermate) ale genelor mitocondriale și glicolitice codificate mitocondrial și nuclear în Pkd1-7și Cyskidneys (n=3-5). (b) Imagini reprezentative ale rinichilor secțiuni de la șoareci de control Pkd1-7și littermate analizați la vârsta postnatală (P)22. Sunt prezentate colorarea prin imunofluorescență (IF) pentru hibridizarea in situ fluorescentă cu TFAM și ARN (ARN-FISH) pentru transcrierile citocrom c oxidaza 1 (mt-Co1) codificate mitocondrial și subunitatea 6 (mt-Atp6) de membrană ATP sintaza codificată mitocondrial. Săgețile albe identifică celulele epiteliale care căptușesc chistul cu expresie TFAM, mt-Co1 sau mt-Atp6 puternic redusă. Glomerulii sunt marcați prin gl. Structurile tubulare care exprimă TFAM sunt identificate prin fluorescență roșie. Asteriscurile prezintă celule epiteliale tubulare cu transcrieri detectabile mt-Co1 și mt-Atp6. 4',6-diamidino-2-fenindolul (DAPI) a fost utilizat pentru colorarea nucleară (fluorescență albastră). Bare=25 um pentru imaginile IF și 10 μm pentru imaginile ARN-FISH. （c） Microscopia cu iluminare structurată tridimensională. Sunt prezentate imagini ale secțiunilor de rinichi din rinichii Pkd1-7-analizați prin histochimie cu lectină de lotus tetragonolobus (LTL) și IF pentru subunitatea 4 a citocromului c oxidazei (COXIV) și expresia canalului selectiv anion-anion 1 (VDAC) dependent de tensiune. Volumul mitocondrial (mt) a fost cuantificat cu software-ul Imaris pe baza colorării COXIV. Săgețile reprezintă celulele epiteliale ale chistului, semnele numerice reprezintă lumina chistului, iar asteriscurile reprezintă tubuli non-chistici. Celulele epiteliale ale chistului sunt conturate prin linii întrerupte. Bare=10 μm pentru panoul din stânga și 3 μum pentru panoul din dreapta. Datele sunt reprezentate ca medie ± SEM și au fost analizate folosind testul t Student *P<><0.01, and=""><0.001.eno2, enolase="" 2;="" hk2,="" hexokinase="" 2;="" mt-cytb,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" b:="" ndufs3.="" nadhubiguinone="" oxidoreductase="" core="" subunit="" s3;="" pdk1,="" pyruvate="" dehydrogenase="" kinase="" 1;="" pdk4.pyruvate="" dehydrogenase="" kinase="" 4;="" ppargc1a,="" peroxisome="" proliferator-activated="" receptor="" gamma="" coactivator="" 1-alpha:="" pgk1,="" phosphoglycerate="" kinase="" 1:="" ptec,="" proximal="" tubule="" epithelial="" cell;="" sudha,="" succinate="" dehydrogenase="" complex="" flavoprotein="" subunit="" a.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
Pentru a examina dacă pierderea deTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)expresia este o caracteristică moleculară comună a PKD umană, am analizat specimene de nefrectomie de la 5 pacienți ADPKD prin imunohistochimie, colorare IF, hibridizare in situ cu fluorescență ARN și SIM 3D. RedusTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)expresia a fost observată în 75,2% ± 7,5% din chisturile renale analizate prin imunohistochimie. Acest lucru a fost asociat cu o expresie scăzută a MT-CO1 și MT-ATP6 prin hibridizarea in situ cu fluorescență ARN (Figura 7a, Figura suplimentară S10); Volumul mt în celulele epiteliale care căptușește chistul a fost diminuat cu aproximativ 70 la sută, după cum a fost evaluat prin SIM 3D (Figura 7b). Luate împreună, analiza a 2 modele de șoarece PKD și țesuturi umane ADPKD a sugerat acest lucruTFAM(factorul de transcripție mitocondrial țintit A)deficiența și epuizarea mt sunt constatări comune în țesuturile PKD și sunt susceptibile de a afecta patogeneza bolii chistice renale.
Figura 7| Expresia factorului de transcripție mitocondrial A (TFAM) în chisturile renale de la pacienții cu boală renală polichistică este redusă.(a) Imagini reprezentative ale secțiunilor încorporate în parafină fixate în formalină de la rinichi umani normali și rinichi de la pacienți cu boală renală polichistică (PKD) analizați prin imunohistochimie pentru exprimarea TFAM, prin imunofluorescență (IF) pentru canalul selectiv anion-dependent de tensiune 1 (VDAC) ) și prin hibridizare in situ fluorescentă de ARN pentru citocrom c oxidaza 1(MT-CO1) codificată mitocondrial și subunitatea 6 (MT-ATP6) de membrană ATP sintetază codificată mitocondrial expresia ARNm, săgețile identifică celulele epiteliale care căptușesc chistul, semnele numerice descriu chistul , iar asteriscurile descriu glomeruli. Bară=100 μm pentru imagini cu mărire redusă și 10 um pentru imagini cu mărire mare (b)Imagini microscopice cu iluminare structurată dimensional 3-reprezentative ale secțiunilor de rinichi PKD uman analizate cu IF pentru expresia VDAC.4',{ {17}}diamidino-2-fenilindolul (DAPl) a fost utilizat pentru colorarea nucleară (fluorescență albastră). Liniile întrerupte marchează tubii, iar semnele numerice descriu lumina tubulară sau chistică. Volumul mitocondrial (mt) a fost cuantificat folosind software-ul Imaris (n=5). Bara =4 μm. Datele sunt reprezentate ca medie ± SEM și au fost analizate folosind testul t Student.*P<0.05. to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
