Boala de rinichi cu chisturi multiple

ali.ma@wecistanche.com

Partea Ⅱ: Organoizi renali generați din celulele progenitoare eritroide ale pacienților cu boală polichistică renală autosomal dominantă

Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice & et al.

Fundal:Rinichiorganoizii au fost obținuți pe scară largă din celule stem pluripotente induse disponibile comercial (iPSC); cu toate acestea, a fost o mare provocare să se producă eficient modele organoide renale de la pacienți cu polichistic autosomal dominantrinichi(ADPKD) care recapitulează atât embriogeneza, cât și mecanismele cistogenezei.

Faceți clic pentru a cistanche efecte secundare și beneficii pentru rinichi

Metode: Progenitori eritroizi din sânge (EP) de la două ADPKD (polichistice autosomal dominanterinichiboala) și un donator sănătos (HC) a fost folosit ca control comparativ pentru a normaliza mulți pași tehnici pentru reprogramarea PE și pentru generarea organoizilor. PE au fost reprogramate de un vector epizomal în iPSC (celule stem pluripotente induse), care au fost diferențiați în organoizi tubulari renali și apoi stimulați de forskolin pentru a induce formarea chisturilor.

Rezultate: iPSC-urile (celule stem pluripotente induse) derivate din EP au prezentat toate caracteristicile pluripotentei și au fost capabile să se diferențieze în toate cele trei straturi germinale. Organoizii tubulari 3D au fost generați din celule individuale după 28 de zile în Matrigel. HC și ADPKD (polichistic autozomal dominantrinichiboala) organoizii nu au format spontan chisturi, dar la stimularea forskolinei, s-au observat structuri asemănătoare chisturii în ADPKD (polichistic autosomal dominant).rinichiboala) organoizi dar nu și în organoizii derivati ​​din HC.

Concluzie: Constatările acestui studiu au arătat cărinichiorganoizii au fost generați cu succes din celulele EP din sânge ale ADPKD (polichistice autosomal dominanterinichiboala) pacienti si un donator de control sanatos. Această abordare ar trebui să contribuie ca un instrument puternic pentru embrionrinichimodel de dezvoltare, care este capabil să recapituleze mecanismele fiziopatologice foarte timpurii implicate în citogeneză.

CLICK AICI PENTRU PARTEAⅠ

Discuţie

În studiul de față, am descris în detaliu o procedură de generare a organoizilor renali din iPSC-uri umane (celule stem pluripotente induse) obținute din celulele progenitoare eritroide sanguine ale pacienților cu ADPKD (boală polichistică renală autosomal dominantă). Multe tipuri de celule somatice au fost reprogramate cu succes în iPSC (celule stem pluripotente induse), inclusiv celule sanguine [Z]. Aici, am optat pentru a folosi progenitorii eritroizi din sânge ca tip de celulă de pornire din mai multe motive, cum ar fi integritatea lor genomică, memoria epigenetică și reprogramarea eficientă [11,17,18]. Eficiența prin care progenitorii eritroizi au fost convertiți în iPSC-uri a fost cu două ordine de mărime mai bună (7 la sută -28 la sută ) decât eficiența tipurilor de celule sanguine diferențiate (0.0). 2 la sută -0,60 la sută )sau fibroblaste (0,74 la sută )[Z]. În ciuda abundenței scăzute a acestor celule în sângele periferic, ele pot fi ușor izolate și extinse in vitro pentru a produce un număr suficient pentru reprogramare. Una dintre cele mai importante provocări în stabilirea iPSC-urilor adecvate este genotipul și variabilitatea fenotipică a acestora [6], dar există câteva strategii tehnice propuse pentru a evita sau reduce o astfel de variabilitate. În experimentele prezente, am folosit un sistem epizomal neintegrator pentru reprogramare care nu necesită integrarea genomului pentru ca genele de reprogramare să fie exprimate [10], permițând mai puțină imunogenitate și făcând celule mai stabile genetic [19,20]. Mai mult, toate probele au fost derivate din aceeași sursă, ceea ce ajută la minimizarea variabilității epigenetice [12] presupunând că diferențierea celulei inițiale ar putea influența eficiența rezultatelor finale. Analiza markerilor de pluripotență și capacitatea iPSC-urilor (celule stem pluripotente induse) de a se diferenția în toate cele trei straturi germinale au fost comparate unul lângă altul și, de asemenea, au fost comparate cu linia celulară embrionară H9, care a fost folosită ca control pozitiv. . Toate aceste comparații nu au arătat diferențe semnificative între pacienții cu ADPKD (boală polichistică renală autosomal dominantă), HC și celulele H9.

Au fost dezvoltate mai multe protocoale pentru inducerea diferențierii iPSC-urilor (celule stem pluripotente induse) în organoizi renali [13,21]. Pe baza protocoalelor descrise de Cruz et al. [6], am obținut structuri cu caracteristicile tubilor proximali, inclusiv expresia NHE3 și AOP1. În plus, organoizii au exprimat NPHS2, indicând prezența celulelor asemănătoare podocitelor.

În schimb, AQP2 nu a fost exprimat în acești organoizi tubulari. Această constatare este în acord cu studiile anterioare care indică câteva limitări în dezvoltarea structurilor derivate din mugure ureter (UB) in vitro, dezvoltarea UB necesitând protocoale specifice, deoarece fereastra de sincronizare pentru adăugarea inductorului specific este foarte limitată. 6,22,23].

În procesul de generare a organoizilor renali din iPSC (celule stem pluripotente induse), toată embriogeneza renală este recapitulată in vitro, implicând inițial formarea de sferoizi cavitați din celule unice [14]. Într-adevăr, am constatat că iPSCss (celule stem pluripotente induse) nediferențiate atât de la pacienții cu ADPKD (boală polichistică renală autosomal dominantă), cât și de la controlul sănătos, au format structuri sferoide asemănătoare epiblastului care erau similare morfologic. Deși secvențierea ADN a genelor PKD1 și PKD2 nu a fost efectuată în studiul de față, descoperirile actuale indică faptul că tipul de mutație purtat de pacienți nu a avut nicio influență asupra morfogenezei epiblastice tipice. Sunt încă necesare studii suplimentare pentru a evalua mai corect expresia moleculelor pivot implicate în această fază a dezvoltării embrionare.

Conform protocolului elaborat de Freedman et al. [14], am observat că sferoizii s-au diferențiat în organoizi tubulari la 26 de zile după inducerea diferențierii, iar momentul a fost similar atât pentru pacienții cu ADPKD (boală polichistică renală autosomal dominantă), cât și pentru HC (Fig ③). Cu toate acestea, am observat o oarecare variabilitate în ceea ce privește orarul de exprimare și nivelurile markerilor de diferențiere. Pe de altă parte, morfologia structurilor tubulare a fost similară și comparabilă între probele de la pacienții cu ADPKD și HC. În schimb, folosind iPSC (celule stem pluripotente induse) care provin din biopsiile renale ale pacienților cu ADPKD (boală polichistică renală autozomal dominantă), grupul Cruz și colab. a găsit o variabilitate mai mare în capacitatea acestor celule de a forma organoizi[6]. pe lângă marea diversitate de mutații inerente acestei boli, aceste diferențe în eficiența obținerii organoizilor pot fi explicate și prin tipurile de celule eterogene prezente în probele de biopsie, spre deosebire de progenitorii eritroizi, care constituie o populație celulară mai omogenă. Luate împreună, aceste rezultate indică faptul că, în ciuda variabilității și diferențelor în eficiența diferitelor clone iPSC de a forma organoizi renali, obținerea acestora din urmă de la pacienții cu ADPKD (boală polichistică renală autosomal dominantă) poate constitui un model unic pentru studierea formelor multiple de manifestări fenotipice. a acestei boli. Mai mult, este important de menționat că, dacă există o variabilitate considerabilă a mutațiilor în populația afectată de ADPKD, iPSC-urile specifice pacientului (celule stem pluripotente induse), fiind total compatibile cu imunitatea, ar putea fi utilizate pentru terapii regenerative individuale în viitor. , pe lângă faptul că permite dezvoltarea unui model in vitro pentru a verifica dacă manifestările fenotipice foarte timpurii sunt, de asemenea, la fel de diverse ca și prezentarea clinică.

Pacienții cu organoizi nestimulați derivați de la HCor ADPKD (boală polichistică renală autosomal dominantă) nu au format spontan chisturi. Morfologia tipică a chisturilor și expresia markerilor de cistogeneză nu au fost detectabile în nicio probă, chiar extinzând diferențierea organoide în cultură până la sfârșitul a 35 de zile. S-a demonstrat că numai proliferarea celulară nu produce chisturi[24]. Mai mult, este necesar un al treilea eveniment independent (cunoscut sub numele de a treia lovitură) pentru a accelera formarea și creșterea chisturilor in vivo [23]. În schimb, formarea de chisturi indusă de forskolin a avut loc la organoizii de la pacienții cu ADPKD, dar nu și la cei de la HC. De notat, deși prezente, chisturile au fost observate într-un procent mic în probele de ADPKD chiar și în prezența forskolinei, așa cum a fost observat și de Freedman și colab. [14] în organoizi formați din modelul CRISPR/Cas9 al bolii ADPKD. Unele ipoteze pot fi ridicate pentru a explica frecvența scăzută a chisturilor găsite în modelul de față. 1) Organoizii cultivați într-un mediu de suspensie 3D au prezentat o eficiență a cistogenezei mult mai mare în comparație cu organoizii aderenți [6], ceea ce indică faptul că micromediul este direct implicat în cistogeneză. porțiunile distale ale nefronului [23]. Deși toate segmentele de nefron pot origina chisturi, inclusiv tubulii proximali [25], se pare că cele derivate din canalele colectoare par a fi mai mari și în număr mai mare decât cele din alte segmente [26], 3) În cele din urmă, sa demonstrat recent că originea chisturilor. poate fi legată de prezența mai multor mutații PKD1 care determină severitatea bolii și că formarea de chisturi în canalele colectoare a fost asociată cu severitatea bolii [27, 28].

În concluzie, prezentele descoperiri au arătat că este fezabilă generarea de organoizi cu structuri tridimensionale similare cu arhitectura progenitoarelor renale folosind iPSC (celule stem pluripotente induse) reprogramate de la progenitori eritroizi care au fost ușor izolați din ADPKD (boala polichistică renală autosomal dominantă) pacienți și că acești organoizi sunt capabili să formeze chisturi sub stimularea forskolinei. Această metodologie promițătoare dezvăluie o metodă pentru creșterea înțelegerii etapelor genetice, fenotipice și fiziologice foarte timpurii în formarea chisturilor în cadrul ADPKD (boala polichistică renală autosomal dominantă).

Referințe

1. Chebib FT, Torres VE: Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease: Core Curriculum 2016.AmJ Kidney Dis, 67:792-810, 2016 https://doi.org/10.1053/j.aikd.2015.07.037PMID:862653PMID:

2. WatnickTJ, Torres VE, Gandolph MA, Qian F, Onuchic LF, Klinger KW și colab.: Mutația somatică în chisturile individuale ale ficatului susține un model cu două lovituri de cystogenesis în boala polichistică renală autosomal dominantă.Mol Cell,2:{{ 3}}, 1998 https://doi.orq/10.1016/s1097-2765(00)80135-5 PMID:9734362

3. Pei Y, WatnickT, He N, WangK, Liang Y, Parfrey P, și colab.: Mutațiile somatice PKD2 în chisturile individuale ale rinichilor și ficatului susțin un model de cistogenie „cu două lovituri” în boala polichistică renală autozomal dominantă de tip 2.JAm Soc Nephrol, 10;1524-1529.1999 https://doi.or/10.1681/ASN.V1071524 PMID:10405208

4. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, Huso DL, Germino GG: A critical developmental switch defines the kinetics of kidney chyst form after loss of Pkd1.Nat Med, 13: 1490-1495,2007 https:/ l doi.org/10.1038/nm1675 PMID: 17965720

5. TakakuraA, Contrino L, Zhou X, Bonventre JV, Sun Y, Humphreys BD și colab.: Leziunea renală este un al treilea hit care promovează dezvoltarea rapidă a bolii renale polichistice la adulți. Hum Mol Genet, 18:2523-2531,2009 https://doi.org/10.1093/hmg/ddp147 PMID: 19342421

6. Cruz NM. Song X, Czerniecki SM, Gulieva RE, Churchill AJ, Kim YK și colab.: Cistogenia organoidă dezvăluie un rol critic al micromediului în boala polichistică renală umană. Nat Mater, 16:1112-1119, 2017 https://doi.org/10.1038/nmat4994 PMID:28967916

7. Takahashi K, Okita K, Nakagawa M, Yamanaka S: Inducerea celulelor stem pluripotente din culturi de fibroblast. Nat Protoc,2:3081-3089,2007 https://doi.org/10.1038/nprot.2007.418 PMID:18079707

8. Freedman BS, Lam AQ, SundsbakJL, Latino R, Su X, Koon SJ și colab.: Policistină ciliară redusă-2 în celule stem pluripotente induse de la pacienții cu boală polichistică renală cu mutații PKD1. J Am Soc Nephrol,24:1571-1586,2013 https://doi.org/10.1681/ASN.2012111089 PMID:24009235

9. Chen HY, Tan HK, Loh YH: Derivation of Transgene-Free Induced Pluripotent Stem Cells from a Single Drop of Blood.Curr Protoc Stem Cell Biol, 38:4A.9.1-4A.9.10,2016https: //doi.or/10.1002/CPSC.12 PMID:27532818

10. YuJ, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, Stewart R, Slukvin Il, et al.: Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.Science, 324:797-801,2009 https: //doi.org/10.1126/science. 1172482 PMID:19325077

11. EminliS, Foudi A, Stadtfeld M, Maherali N, Ahfeldt T, Mostoslavsky G și colab.: Etapa de diferențiere determină potențialul celulelor hematopoietice pentru reprogramarea în celule stem pluripotente induse. Nat Genet, 41: 968-976, 2009 https://doi.orq/10.1038/ng.428 PMID: 19668214

12. Chou BK, Mali P, Huang X, Ye Z, Dowey SN, Resar LM și colab.: Derivarea eficientă a celulelor iPS umane printr-o plasmidă neintegratoare din celule sanguine cu semnături epigenetice și expresii genice unice. Cel/Res,21:518-529, 2011 https://doi.orq/10.1038/cr.2011.12 PMID:21243013

13. Schutgens F, Verhaar MC, Rookmaaker MB: Organoizi renali derivati ​​din celule stem pluripotente: O tehnologie in vitro asemănătoare in vivo. Eur J Pharmacol,790:12-20, 2016 https:/ldoi.org/10.1016/j.eiphar.2016. 06.059 PMID: 27375081

14. Freedman BS, Brooks CR, Lam AQ, Fu H, Morizane R, Agrawal V și colab: Modeling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast sferoids. Nat Commun, 6:8715, 2015 https://doi.orq/10.1038/ncomms9715 PMID: 26493500

15. Pei Y. ObaiiJ. Dupuis A. Paterson AD. Magistroni R. Dicks E, et al; Criterii unificate pentru diagnosticul ultrasonografic al ADPKD (boala polichistică renală autosomal dominantă). JAm Soc Nephrol, 20:205-212,2009 https://doi.org/10.1681/ASN.2008050507 PMID:18945943

16. Watanabe K, Ueno M, Kamiya D, Nishiyama A, Matsumura M, Wataya T și colab.: Un inhibitor ROCK permite supraviețuirea celulelor stem embrionare umane disociate. Nat Biotechnol, 25:681-686,2007 https://doi.org/10.1038/nbt1310 PMID: 17529971

17. Hochedlinger K, Jaenisch R: Nuclear reprogramming and pluripotency.Nature,441:1061-1067,2006 https://doi.org/10.1038/nature04955 PMID: 16810240

18. Maherali N, Ahfeldt T, Rigamonti A, UtikalJ, Cowan C, Hochedlinger K: Un sistem de înaltă eficiență pentru generarea și studiul celulelor stem pluripotente induse de om. Cel/ Celula stem. 3:340-345. 2008 https://doi.org/10.1016/.stem.2008.08.003 PMID: 18786420