Studiu asupra enzimelor microbiene produse în timpul fermentației bacteriene combinate și a activităților lor biologice ⅲ

Capitolul 3 Studiu asupra activității antioxidante a enzimelor

 

Multe boli umane s -au dovedit a fi legate deoxigen activ și radicali liberi, cainflamaţie, arterioscleroză,îmbătrânire, diabet, cancer, etc.Radicali liberi excesiviîn organism poate provoca denaturarea proteinelor, deteriorarea celulelor și moartea și chiar modificări patologice în organism. Prin urmare, multe studii la domiciliu și în străinătate caută alimente bogate în ingrediente antioxidante naturale pentru a preveni și regla bolile cauzate de radicalii liberi prin dietă. Astăzi, odată cu creșterea nivelului de viață, oamenii își transformă treptat atenția către propriile corpuri, astfel încât tot mai multe produse de sănătate apar într -un flux nesfârșit. Cu toate acestea, nu este ușor să fii cu adevărat util. Enzimele sunt un fel de mâncare care poate fi făcută de tine în viața oamenilor. Costul nu este foarte mare și există multe avantaje.
Enzimele microbiene au o varietate de funcții de sănătate, cum ar fi antibacterian și antiinflamator, promovând metabolismul, îmbunătățind imunitatea, albirea și anti-îmbătrânirea, detoxifierea și anti-cancer. În prezent, există relativ puține studii asupra proprietăților antioxidante ale enzimelor microbiene la domiciliu și în străinătate, așa că intenționăm să efectuăm cercetări aprofundate asupra acestora. Această lucrare ia enzima Apple ca obiect de cercetare și folosește conținutul total de fenol, reducând puterea, DPPH · radical liber, radical liber, radical liber, superoxid liber și capacitate de epurare a radicalilor liberi, ca indexuri de determinare pentru a efectua o investigație cuprinzătoare și sistematică a enzimei Apple după fermentare timp de 3 luni. Au fost studiate compoziția și conținutul ingredientelor active antioxidante, iar activitatea sa antioxidantă a fost înțeleasă.

Noile ierburi Cistanche cu mult mai multă putere anti-oxidare decât fermentarea bacteriilor

Serviciul de susținere al WeCistanche-cel mai mare exportator de Cistanche din China:
Email: wallence.suen@wecistanche.com
WhatsApp/Tel: +86 15292862950

 

 

 

 

3.1 Materiale și metode

3.1.1 Materiale

(1) Materiale experimentale
Spălați merele proaspete cu apă sterilă în condiții sterile, uscați -le în mod natural într -o masă de funcționare sterilă, decojiți -le și feliați -le pentru utilizare ulterioară. Adăugați zahăr alb și mere într -un borcan de sticlă sterilizat la un raport în masă de 1: 1. Activați bacteriile necesare pentru experiment și inoculați -le în enzimă în funcție de schema optimă (această etapă de operare este omisă în grupul de control), sigilați -o și așezați -o într -un loc rece și uscat. După 3 luni de fermentare a temperaturii camerei, luați o probă pentru a obține întregul lichid de enzimă care conține pulpa și filtrați -l. Luați supernatantul ca eșantion experimental și centrifugeți eșantionul la 10000rpm timp de 15 minute într-o centrifugă de mare viteză înainte de a determina datele relevante. Este demn de remarcat faptul că, în procesul de a face enzime, pentru a evita contaminarea inutilă, toate operațiunile noastre sunt efectuate în condiții sterile.

(2) Instrumente principale
Spectrofotometru: v -1100, fabrică de instrumente științifice Shanghai Anting;
Băi de apă cu temperatură constantă: HH -2, Wuhan Litian Technology Instrument Co., Ltd. Alte instrumente sunt aceleași ca 2.1.3.

3.1.2 Metode

(1) Determinarea conținutului total de fenol [53]
① Pregătirea curbei standard:
Cântați cu exactitate {{0}}. 123 g de acid galic, dizolvați -l într -o cantitate mică de apă distilată și transferați -l într -un balon volumetric de 5 0 0 ml pentru a compensa volumul. Luați 8 curat 1 {{1 0}} ml flacoane volumetrice, adăugați 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2 și 1,4 ml de soluție standard de acid galic, respectiv, diluate la marcajul cu apă distilată, adăugați 1 ml de reacție folină și 2 ml de 20% naco3 pentru fiecare Min, se răcește și se diluează la 20 ml și se așează la temperatura camerei timp de 30 min. Utilizați un spectrofotometru pentru a măsura absorbția A la o lungime de undă de 650 nm și trageți o curbă standard cu absorbția A ca axa orizontală și concentrația de probă ca axa verticală. ② Detectarea
Add distilled water to 100μL, 200μL, 300μL, 400μL, and 500μL sample solutions to 46mL, then add 1mL of Folin-phenol reagent, mix evenly, react for 3min, then add 3mL of 20% NaCO3, shake in a 25 degree constant temperature water bath for 2h, use distilled water as blank control, and measure its absorbance A at a wavelength of 760nm cu un spectrofotometru. Conținutul total de fenol este exprimat ca echivalenți de acid galic, iar conținutul total de fenol este calculat în funcție de ecuația curbei standard.

(2) Testul de reducere [54]
Adăugați 1 0 0 µl, 2 0 0 µl, 300 µl, 400 µl și 500 µl de probă la 2,5 ml de tampon fosfat cu o concentrație de 0,2mol/L și o valoare de PH de 6,6, apoi adăugați 2,5 ml de ferindă de potasiu (W/V) cu o concentrație de masă de 1%, și READ FERCT AT (W/V) cu o concentrație de masă de 1%, și Reac. 50 de grade pentru 30 de minute. Apoi adăugați 2,5 ml de acid tricloroacetic (greutate/greutate) cu o concentrație în masă de 10%și centrifugă la 3000 rpm timp de 10 minute într-o centrifugă de mare viteză. Imediat după scoaterea, luați 2,5 ml de supernatant într -un balon volumetric, adăugați 2,5 ml de apă distilată și 0,5 ml de clorură ferică (greutate/greutate) cu o concentrație de masă de 0,1%. Folosiți apă distilată ca un control gol și măsurați absorbția A la o lungime de undă de 700 nm folosind un spectrofotometru. Puterea reducerii puterii poate fi evaluată prin valoarea de absorbție. Cu cât valoarea de absorbție este mai mare, cu atât este mai puternică puterea de reducere.

 

(3) Determinarea efectului de eliminare a radicalilor liberi de anion superoxid [55]

Luați 4.5 ml de 0. 0 5 mol/l pH 8.2 tampon Tris-HCl și preîncălziți-l într-o baie de apă de 25 de grade pentru 2 0 min. Adăugați 1 ml soluție de probă de enzime cu concentrații de 10%, 20%, 30%, 40%și 50%și 0,4 ml de 25 mmol/L soluție de pirogallol. Se amestecă bine și reacționează într -o baie de apă de 25 de grade timp de 5 minute. Adăugați 1,0 ml de 8 mol/L HCl pentru a încheia reacția. Utilizați tampon Tris-HCl ca referință și utilizați un spectrofotometru pentru a măsura absorbția A la o lungime de undă de 299 nm pentru a calcula rata de epurare. Pentru grupul de control gol, a fost utilizat 1 ml de solvent în loc de probă. Rata de epurare O 2- a fost calculată în conformitate cu Formula 3.1: O 2- Rata de epurare (%)=(a 1- a2)/a1 × 100 (3.1) unde: a1 este absorbția tubului alb; A2 este absorbția eșantionului.

(4) Determinarea efectului de epurare asupra radicalilor hidroxil [56]

100μL, 200μL, 300μL, 400μL, 500μL sample solution was added with water to 2mL, then added to 1.4mL of hydrogen peroxide with a molar mass concentration of 6mmol/L, then added with 0.6mL of sodium salicylate with a molar mass concentration of 20mmol/L and 2mL of ferrous sulfate with a molar mass concentration of 1,5 mmol/L și încălzit într -o baie de apă cu temperatură constantă la 37 de grade pentru 1 ore. Reglați -vă la zero cu apă distilată și măsurați absorbția A la o lungime de undă de 562Nm folosind un spectrofotometru. Efectuați 3 replici pentru fiecare tratament. Calculați rata de epurare a radicalilor hidroxil în conformitate cu formula 3.2: rata de epurare a radicalilor hidroxil (%)=[(a 1- a2)/a1] × 100 (3.2) unde: A1 este absorbția medie a blank; A2 este absorbția medie a soluției de probă. (5) Determinarea efectului de epurare a radicalilor liberi DPPH [57]

Noile ierburi Cistanche cu mult mai multă putere anti-oxidare decât fermentarea bacteriilor

 

Pipeta cu exactitate 2 ml soluție de probă de enzime cu concentrații de 1 0%, 20%, 30%, 40%și 50%într -un balon volumetric de 10 ml, apoi adăugați 2 ml de 80%soluție apoasă de etanol DPPH la balonul volumetric. Concentrația de masă molară este 2 × 10-4 mol/l. După amestecare, lăsați -l să stea la temperatura camerei timp de 30 min. Folosind soluție de etanol 80% ca referință, măsurați absorbția eșantionului la o lungime de undă de 517 nm, care este înregistrată ca A1. Se amestecă 2 ml soluție DPPH și 2 ml soluție de etanol cu ​​o concentrație de masă de 80% și măsoară absorbția acestora la aceeași lungime de undă, care este înregistrată ca A0. Se amestecă 2 ml soluție de enzimă și 2 ml soluție de etanol cu ​​o concentrație de masă de 80% și măsoară absorbția acestora la aceeași lungime de undă, care este înregistrată ca A2. Calculați rata de epurare a radicalilor liberi DPPH în conformitate cu Formula 3.3:
DPPH Free RADICAL SCAVENGING Rata (%) {{0}} [1-} (a 1- a2)/a 0] × 100 (3.3) unde: A1 este absorbția de 2 ml Soluție dpph 80% Ethanol Solution Aqueous Solution și 2 ml Enzime Solution; A2 este absorbția unei soluții mixte de soluție enzimatică de 2 ml și 2 ml 80% etanol prin concentrație de masă; A0 este absorbția unei soluții mixte de soluție DPPH de 2 ml și 2 ml 80% etanol prin concentrație de masă.

(6) ABTS Abilitatea de epurare a radicalilor liberi [58]
Adăugați o anumită cantitate de sulfat de potasiu la soluție ABTS de 7 mmol/L până când concentrația finală a soluției mixte este de 2,45 mmol/L. Puneți soluția mixtă într -un loc rece și uscat la temperatura camerei timp de 12 până la 16 ore. 1µL, 3μL, 5 µl, 7 µl și 9 µl de soluție de probă au fost completate la 10 µl cu 5mmol/L Ph7,4 tampon fosfat, apoi amestecat uniform cu 10 ml de sulfat de potasiu de mai sus și soluție mixtă ABTS și a permis să reacționeze la o temperatură de reacție de 30 grade și o reacție de 5min. Zero cu apă distilată și măsurați absorbția A la o lungime de undă de 734nm folosind un spectrofotometru. Calculați rata de epurare a radicalilor liberi ABTS conform Formulei 3.4:
ABTS Free radical radical rata (%)=[(a 1- a2)/a1] × 100 (3.4) unde: a1 este absorbanța grupului de control gol; A2 este absorbția grupului experimental

 

3.2 Rezultate și analiză

3.2.1 Conținut total de fenol

(1) Curba standard
Curba standard a conținutului total de fenol a fost trasă cu concentrația de acid galic ca axă orizontală și valoarea de absorbție A ca axă verticală, așa cum se arată în figura 3.1.

 

Fig.3.1 Curba standard a conținutului total de fenol

Din Fig.3.1, putem observa că ecuația curbă standard este y =11. 375x +0. 2593 (X este concentrația de eșantion, y este absorbanța), r 2=0. 9981.

(2) Determinarea eșantioanelor

Rezultatele determinării totale a conținutului de fenol a enzimelor Apple din grupul de control și grupul experimental la diferite concentrații sunt prezentate în Fig.3.2.

 

 

 

Fig.3.2 Curba conținutului fenolic total

Așa cum se arată în Fig.3.2, enzimele Apple atât din grupul de control, cât și din grupul experimental au un conținut fenolic total ridicat și ambele cresc odată cu creșterea cantității de soluție de probă adăugată. În același gradient de concentrare, conținutul fenolic total al enzimei Apple din grupul de control a crescut de la 0. 673mg la 2,8 0 7mg, iar conținutul fenolic total al grupului experimental a crescut de la 0,961mg la 4,185mg. Conținutul fenolic total al grupului experimental este mult mai mare decât cel al grupului de control, iar tendința ascendentă este mai evidentă. Conform conținutului fenolic total, activitatea generală antioxidantă a grupului experimental este mai mare decât cea a grupului de control.

 

3.2.2 Reducerea puterii

Rezultatele reducerii determinării puterii enzimelor Apple din grupul de control și grupului experimental la diferite concentrații sunt prezentate în figura 3.3.

 

Așa cum se arată în figura 3.3, tendința de schimbare a puterii de reducere a enzimelor Apple este similară cu tendința de schimbare a conținutului total de fenol. Puterea de reducere a grupului experimental este mai mare decât cea a grupului de control și, dacă este grupul experimental sau grupul de control, în intervalul de concentrație prezentat în experiment, puterea de reducere arată o tendință în creștere cu creșterea cantității de soluție de probă adăugată. Datele experimentale au confirmat, de asemenea, că, în ceea ce privește reducerea puterii, activitatea antioxidantă a grupului experimental este mai mare decât cea a grupului de control.

 

 

3.2.3 Abilitatea de epurare a radicalilor liberi de anion superoxid

Rezultatele abilității de epurare a radicalilor liberi de anion superoxid a enzimelor Apple din grupul de control și grupul experimental la diferite concentrații sunt prezentate în figura 3.4.

Așa cum se arată în figura 3.4, există o mare diferență în capacitatea de epurare a radicalilor libere a anionului superoxid între grupul experimental și grupul de control. În intervalul de concentrație prezentat în experiment, capacitatea de scădere a radicalilor liberi a anionului superoxid al grupului experimental se modifică cel mai semnificativ atunci când concentrația de eșantion este de 10%până la 20%, iar modificarea nu este evidentă după ce concentrația este mai mare de 20%; Atunci când concentrația este de 50%, capacitatea de epurare a radicalilor libere a anionului superoxid este de până la 85,4%. Capacitatea de epurare a radicalilor libere Superoxid, prezentată de grupul de control, poate fi văzută în mod clar din graficul de tendințe. Pe măsură ce concentrația enzimatică crește, această abilitate de epurare a radicalilor liberi crește, de asemenea, se schimbă lent și tinde treptat la o stare stabilă. Abilitatea de epurare atinge maximum 42,6%. Grupul experimental este aproape de două ori mai mare decât grupul de control.

 

 

3.2.4 Capacitate de epurare a radicalilor libere de hidroxil

Modificările capacității de epurare a radicalilor libere de hidroxil a enzimelor Apple din grupul de control și a grupului experimental la diferite concentrații sunt prezentate în Fig. 3.5.

 

 

Fig.3.5 Curba radicalului liber hidroxil de epurare

 

Se poate observa din Fig. 3.5 că în intervalul de concentrație prezentat în experiment, capacitatea de epurare a radicalilor libere de hidroxil a enzimelor din grupul experimental și grupul de control a crescut odată cu creșterea cantității adăugate. Capacitatea de epurare a radicalilor libere de hidroxil a grupului experimental a fost mai mică decât cea a grupului de control și a efectuat foarte slab la concentrații mici. La concentrații mari, capacitatea de epurare a radicalilor libere de hidroxil a crescut semnificativ. Motivul poate fi acela că, în timpul procesului de fermentare, tipurile și conținutul microorganismelor din enzimele Apple din grupul experimental și grupul de control au fost diferite, iar conținutul metaboliților secundari și componentele fiecărui produs produs de fermentație a fost diferit, astfel încât capacitatea antioxidantă prezentată a fost diferită.

 

3.2.5 DPPH · Abilitatea de epurare a radicalilor liberi

În comparație cu alte metode de detectare, DPPH · Abilitatea de epurare a radicalilor liberi este utilizată pe scară largă pentru a evalua activitatea antioxidantă într -o perioadă scurtă de timp [59]. Abilitatea de epurare a radicalilor liberi DPPH la diferite concentrații a fost reprezentată în funcție de rezultatele grupului de control și ale grupului experimental Enzimele Apple, așa cum se arată în figura 3.6.

Așa cum se arată în figura 3.6, când concentrația enzimei de mere a grupului de control a fost mai mică de 30%, capacitatea de epurare a radicalilor DPPH · liberă a fost mai mică de 50%, dar enzima de mere experimentală de grup a arătat, de asemenea, o capacitate mai mare de scădere a radicalilor liberi la concentrații scăzute. Rezultatele experimentale arată că adăugarea de Aspergillus oryzae, drojdie, streptococ termofil și lactobacillus bulgar este benefică pentru capacitatea de epurare a radicalului liber DPPH. Când concentrația enzimatică este de 50%, această capacitate este de până la 91,4%, ceea ce este mult mai mare decât 69,8%din grupul de control la aceeași concentrație.

 

3.2.6 ABTS Capacitate radicală de epurare

Rezultatele capacității de epurare radicală ABTS a enzimelor Apple din grupul de control și grupul experimental la diferite concentrații sunt prezentate în Fig. 3.7.

Fig.3.7 Curba capacității de epurare radicală ABTS
Din Fig. 3.7 se poate observa că rata de epurare a enzimelor Apple din grupul experimental este mai mare atunci când cantitatea de adăugare a enzimei este mai mare de 5μL. Studiul lui Erel și colab. a arătat că capacitatea de epurare a radicalilor ABTS depinde în mare măsură de concentrația mai mare de substanțe fenolice [60]. Rezultatele determinării conținutului total de fenol au arătat că conținutul total de fenol al grupului experimental a fost mai mare decât cel al grupului de control. Rezultatele experimentale din Fig. 3.7 au verificat doar că capacitatea de epurare a radicalilor ABTS este mai mare decât cea a grupului de control.

 

3.3 Rezumatul acestui capitol

Acest capitol studiază relația dintre activitatea antioxidantă a enzimelor Apple produse prin fermentare cu patru tulpini selectate de mere, concentrația de probe de enzime și compararea componentelor active antioxidante și capacitatea de epurare a radicalilor liberi între grupul experimental și grupul de control. Rezultatele experimentale arată că conținutul total de fenol al enzimei Apple din grupul de control este mai mic decât cel din grupul experimental, precum și puterea sa de reducere, capacitatea de scădere a radicalilor libere de anion superoxid, radicalul liber DPPH și capacitatea de epurare a radicalilor liberi ABTS sunt mai bune decât cele din grupul de control; Enzima din grupul de control are o capacitate de epurare deosebit de bună pentru radicalii liberi de hidroxil.
În general, grupul experimental a arătat o activitate antioxidantă mai mare, ceea ce a confirmat în continuare fezabilitatea adăugării artificiale a tulpinilor pentru a face enzime microbiene. În acest fel, alimentele enzimatice microbiene au mai multe substanțe benefice pentru sănătatea umană pe baza fermentației naturale originale și se pot dezvolta mai bine în direcția așteptată de oameni.