Șoarecii Knockout Nlrc3 au prezentat modificări patologice renale după infecția cu HTNV

A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Virusul Hantaan (HTNV) infectează oamenii și provoacă febră hemoragică curenalsindrom(HFRS). Dezvoltarea de modele animale bine caracterizate de HFRS ar putea accelera testarea candidaților de vaccin și a agenților terapeutici și ar putea oferi un instrument util pentru studierea patogenezei HFRS. Deoarece NLRC3 are multiple roluri imunoreglatoare, am investigat susceptibilitatea șoarecilor Nlrc3-/- la infecția cu HTNV pentru a stabili un nou model de HFRS. Șoarecii Nlrc3−/− au dezvoltat pierderea în greutate,hemoragie renală,și dilatarea tubului după infecția cu HTNV, recapitulând multe simptome clinice ale HFRS umane. Mai mult, șoarecii infectați Nlrc3-/- au prezentat încărcături virale mai mari în ser, splină și rinichi decât șoarecii de tip sălbatic C57BL/6 (WT), iar unii dintre ei au manifestat mai multe tulburări hematologice și modificări patologice semnificative în mai multe organe decât șoarecii WT. Rezultatele noastre identifică că șoarecii Nlrc3-/- infectați cu HTNV pot dezvolta simptome clinice și modificări patologice asemănătoare pacienților cu HFRS, sugerând un nou model pentru studierea patogenezei și testarea vaccinurilor și terapiilor candidate.

Cuvinte cheie:HFRS, HTNV, NLRC3, hemoragie renală, dilatarea tubului renal

INTRODUCERE

Febra hemoragica curenalsindromul (HFRS) prezintă nefropatie interstițială acută după transmiterea zoonotică a hantavirusurilor de la rozătoare la om. Boala apare în principal în Asia și Europa (1, 2). Cei mai răspândiți agenți patogeni care cauzează HFRS sunt virusul Dobrava (DOBV), virusul Puumala (PUUV), virusul Seoul (SEOV) și virusul Hantaan (HTNV), fiecare dintre acestea provocând o severitate diferită a HFRS. Caracteristicile bolii sunt diferite în America de Nord și de Sud, unde infecția cu Hantavirus provoacă sindromul pulmonar cu hantavirus (HPS), în principal prin virusul Andes (ANDV) și virusul Sin Nombre (SNV) (3).

HFRS apare cu caracteristici de febră mare, hipotensiune arterială,insuficiență renală și hemoragie(4). Poate fi împărțit în cinci stadii clinice: febril, șoc hipotensiv, oliguric, diuretic și convalescent. Un episod acut de infecție cu HTNV care duce la HFRS este adesea însoțit de trombocitopenie, leucocitoză, anemie, creatinine serice crescute și enzime hepatice (5). Aceste simptome și semne clinice pot fi parțial explicate prin faptul că HTNV atacă în principal rinichiul și induce leziuni renale caracterizate prin nefrită tubulointerstițială acută care implică infiltrarea celulelor inflamatorii (6), afectând în consecință mai multe alte organe (7)

Rozătoarele sunt rezervoarele naturale pentru hantavirusurile care infectează în mod persistent animalele fără a provoca boli (8). Excrementele lor, cum ar fi saliva, urina și fecalele, devin potențiali contaminanți care pot infecta oamenii care inhalează aerosoli cu particule mici de excretă contaminată. Hantavirusurile provoacă, în general, infecție asimptomatică la șoarecii adulți BALB/c și C57BL/6 (9), dar boli neurologice letale sau infecție persistentă la șoarecii care alăptează și nou-născuți (10, 11). Deși anomalii nefropatice au fost demonstrate la macaci cynomolgus infectați experimental cu PUUV (Macaca fascicularis), aceste animale au prezentat doar proteinurie ușoară, infiltrare a celulelor imune și leziuni tubulare ale rinichilor, similar cu un caz ușor de HFRS (12). În plus, hamsterii infectați cu HTNV pe cale nazală au condus la o infecție persistentă asimptomatică, caracterizată prin viremie sporadică, dar niveluri ridicate de copii ale genomului viral în plămâni, creier și rinichi. Dihorii infectați cu HTNV în doză mare prin injecție musculară au prezentat o scădere treptată a greutății corporale (5-12 procente în timp), dar intacțifuncții renale,absența viremiei și lipsa transmiterii virusului la organe. La marmosets, injectarea intramusculară de HTNV a dus la un grad ridicat de seroconversie și producerea de anticorpi neutralizanți; în mod constant, aceste animale nu au avut leziuni renale, viremie sau transmitere a virusului la organe (13).

În ciuda imperfecțiunii lor, modelele animale folosind șobolani și șoareci au fost utilizate pe scară largă pentru a studia patogenia Hantavirusului (14). Yoshimatsu și colab. a arătat că infecția șoarecilor SCID cu HTNV a provocat boală de pierdere letală cu edem pulmonar (15, 16), iar epuizarea neutrofilelor a prevenit dezvoltarea edemului pulmonar, dar nu au fost găsite leziuni hemoragice caracteristice ale HFRS (15). Shimizu și colab. a constatat că HTNV izolat de la pacienții cu HFRS poate infecta șoareci femele BALB/c în vârstă de 6-săptămână, provocând viremie timp de 6-9 zile, prezentând semne de boală, inclusiv scădere temporară în greutate, riduri ale părului, exudare renală (17 ). În același model de șoarece, a existat o hemoragie macroscopică la granița dintrecortexul renalși medular, dar nu a fost examinat dacă modificările histopatologice observate au fost asociate cu funcția renală redusă. La șoarecii umanizați, infecția cu HTNV duce la pierderea în greutate, scăderea activității, blana ciufulită și leziuni pulmonare, care par că plămânul este principalul organ țintă pentru infecția virală (18). Prin urmare, este încă necesar un model animal adecvat de infecție cu HTNV care să surprindă cele mai multe caracteristici ale bolii HFRS.

recenzii cistanchepentrudilatarea tubului renal

NLR-urile sunt cea mai proeminentă familie de receptori imuni înnăscuți intracelulari și au funcții divergente în reglarea imunității înnăscute. Deși cele mai cunoscute NLR (de exemplu, NLRP3) prezintă funcție de reglare pozitivă în activarea inflamatorie și imună, un subgrup neobișnuit de NLR, definit ca NLR inhibitori, prezintă funcție inhibitoare în răspunsurile inflamatorii. Pentru a înțelege mecanismul suprimării imune înnăscute mediate de NLR, au fost examinați liganzii pentru NLR inhibitori, cum ar fi NLRC3 și NLRX1 (19). NLRC3 este un regulator negativ care atenuează răspunsul interferonului de tip I (IFN-I) prin sechestrarea și atenuarea stimulatorului activării genelor interferonului (STING) (19). NLRX1, ca element central homeostatic între biologia mitocondrială și răspunsul imunologic, a fost implicat într-o gamă largă de boli, atât cauzate de patogeni, cât și de altă natură (20). Deoarece boala HTNV manifestă o mare dereglare a inflamației și a activării imune, am ales șoarecii Nlrc3-/- pentru a investiga mecanismele moleculare ale bolii.

Acest studiu a demonstrat că modelul de șoareci Nlrc3−/− seamănă cu leziunile sistematice observate la pacienții cu HFRS, caracterizate prin trombocitopenie,dilatarea tubului renal și hemoragie.Analiza poverii virale a arătat că șoarecii Nlrc3-/- au prezentat încărcături virale mai mari în mai multe țesuturi, inclusiv ser, splină și rinichi. Studiile noastre stabilesc un model de șoarece pentru infecția cu HTNV util pentru evaluarea vaccinurilor și terapiilor candidate.

METODE

Stocurile VVirus

Tulpina HTNV {{0}} a fost donată de Changshou Hang (Centrul chinez pentru controlul și prevenirea bolilor) și apoi a fost conservată și extinsă în laboratorul nostru. Celulele Vero E6 au fost utilizate pentru propagarea virusului, iar titrurile infecțioase au fost cuantificate utilizând o doză infecțioasă de 50% pentru cultură de țesut (TCID50) prin teste de imunofluorescență (IFA). Conversia între TCID50 și unitățile formatoare de placă (PSU) s-a bazat pe următorul calcul: 1 PFU ≈0,7×TCID50 (21).

generația de model Nlrc3 Knockout Mouse

Modelele de șoareci C57BL/6J de tip sălbatic și modele de șoarece knockout Nlrc3 (Nlrc3−/−) au fost proiectate și dezvoltate de Shanghai Model Organisms Center, Inc (Shanghai, China). Pentru obținerea șoarecelui Nlrc3-/-, ARNm Cas9 și ARNsg au fost preparate prin transcripție in vitro. Două sgRNA-uri vizate pentru a șterge exonii 2-3 ai genei Nlrc3: 5'- GTTGGTCTAATAAGCATCCTGGG {{10}}', 5'- TCCCATGAAACCATGTCAGAAGG -3'. Zigoții de șoareci C57BL/6J au fost primiți și injectați cu ARNm Cas9 și sgRNA transcrise in vitro și transferați la recipiente pseudogravde. Genotipul șoarecilor F0 obținuți a fost identificat și confirmat prin PCR și secvențiere folosind perechi de primeri: F{-5'-GTGATGTCTGCTTACC CCGTCTCC -3'; R-5'- GCCTGTGCCGCCTCTCA -3'. Prin încrucișarea cu șoareci C57BL/6J, șoarecii F0 pozitivi au fost aleși pentru obținerea șoarecilor knockout Nlrc3 heterozigoți F1. PCR și analiza de secvențiere au validat șoarecii F1 obținuți. Pentru obținerea șoarecilor heterozigoți Nlrc3-/-, șoarecii heterozigoți F1 femele și masculi au fost încrucișați aleatoriu. Pentru toate studiile au fost utilizați șoareci cu vârsta cuprinsă între 6 și 8 săptămâni.

Infecția la animale și prepararea probelor

Un total de 5×105 PFU de HTNV în 50 ul de mediu au fost inoculate pe cale intraperitoneală. Șoarecii din grupurile de control au primit cantități identice de PBS. Au fost utilizați douăzeci până la douăzeci și cinci de șoareci Nlrc3-/- sau WT. Fiecare tip de șoareci a fost subdivizat în cinci grupuri pentru eșantionare la 0, 3, 6, 9 și 12 zile după infecție. Greutățile corporale și temperaturile anale au fost înregistrate zilnic. La fiecare moment, patru până la cinci animale din ambele grupuri au fost eutanasiate pentru testare. Pentru analiza virusologică, au fost colectate probe de țesut proaspăt din inimă, ficat, splină, plămân, rinichi și creier și apoi au fost congelate la grade -80 imediat. Șoarecii au fost perfuzați cu PBS rece și organele au fost fixate în paraformaldehidă 4% timp de 4 ore pentru analize histologice și imunohistochimice. Probă de sânge a fost colectată pentru testarea încărcăturii virale și examinarea de rutină a sângelui, iar serul a fost izolat pentru analiza biochimică.

Testul citokinelor

Un total de 25 ml de ser de la fiecare șoarece a fost testat pentru 13 citokine diferite cu LEGENDplex™ Mouse Anti-Virus Response Panel (13-plex) (BioLegend) conform instrucțiunilor producătorului. Citometrul FACS Calibur (Becton Dickinson Biosciences, CA) a fost utilizat pentru detectare. Datele au fost analizate de LEGENDplex v8.0. Software.

Test RT-PCR în timp real

Probele de țesut de la fiecare șoarece au fost cântărite și scufundate în PBS și omogenizate cu un omogenizator automat - TissueLyser II (QIAGEN, Germania), folosind Frecvența 30/s și Timpul 5 min. Pentru extracția totală de ARN, 200 ml de omogenate de țesut au fost transferați în 500 ml de reactiv TRIzol, urmat de extracția cu cloroform și precipitarea cu izopropanol. 140 ml de probe de ser au fost transferați într-un tampon AVL de 560 ml care conține ARN purtător (Qiagen, Marea Britanie) pentru extracția ARN folosind kitul QIAamp Viral ARN Mini (Qiagen, Marea Britanie). În cele din urmă, ARN-ul a fost redizolvat în apă fără RNază. A fost efectuat un test RT-PCR în timp real specific HTNV pentru detectarea ARN viral din fiecare probă. Secvențele de primer care vizează în mod specific segmentul HTNV au fost adoptate după cum urmează: F-5'-GATCAGTCACAGTCTAGTCA- 3' și R-5'-TGATTCTTCCACCATTTTGT-3'. Kitul II RT-PCR TB Green PrimeScript™ într-un pas (Timp Real Perfect) (Takara, Japonia) a fost utilizat pentru testul qRT-PCR. Amestecul principal final (20 ml) a cuprins 2 ml de ARN, 5,6 ml de dH2O fără RNază, 0,8 ml de primer de transmitere și invers (10 mM), 0,8 ml de amestec enzimatic 2 PrimScript 1 Step și 10 ml de 2×One Step TB Green RT-PCR Buffer 4. Condițiile de ciclism utilizate au fost 42 de grade timp de 5 minute, 95 de grade timp de 10 secunde, apoi urmate de 40 de cicluri de 95 de grade timp de 0 secunde, 65 de grade timp de 15 secunde și 95 de grade timp de 0 secunde. Reacțiile au fost efectuate și analizate pe platforma LightCycler (Roche Diagnostics, SUA).

Cuantificarea absolută a încărcăturii virale

Oligonucleotidele ARN virale ca standard de ARN au fost obținute prin transcripție in vitro din ADN folosind kit-ul MAXIscript (Thermo Scientific, Marea Britanie), care a cuprins 562 de baze de ARN HTNV vizate de test (22), și apoi cuantificate cu un spectrofotometru cu microplacă ultramicro ( BioTek Epoch, SUA), concentrația stocului standard de ARN a fost de 800 ng/mL. Pentru evaluarea încărcăturii virale din fiecare probă, ARN-ul standard a fost preparat cu diluție în serie de 10-ori, variind de la 1010 copii la 103 copii per reacție. ARN-ul nostru standard are o limită de detecție de la 1010 copii la 101 copii per reacție și astfel am stabilit pragul de detectare pentru acest test la 100 de copii ale genomului per reacție. Analiza în curs, curbele standard au fost stabilite cu o pantă de -3,6624, o intersecție Y de 41,68 cicluri și o valoare R2 de 0,9996.

Analiza nivelurilor de proteine ​​prin Western Blotting

Lizatele tisulare au fost preparate din probe de țesut de șoarece. Trusa de analiză a proteinei acidului bicinchoninic (BCA) (Thermo Scientific, Marea Britanie) a fost utilizată pentru a detecta concentrația de proteine. Pentru analiza proteinelor, 30 mg de proteină totală din fiecare probă au fost încărcate pe gel SDS-poliacrilamidă și transferate pe membranele NC. Apoi, 5% soluție de lapte degresat a fost folosită pentru blocare la temperatura camerei timp de 2 ore. Apoi, anticorpul monoclonal 1A8 diluat 1:1000 împotriva HTNV-NP (preparat și purificat de laboratorul nostru) (23, 24) a fost adăugat și incubat la 4 grade peste noapte. În cele din urmă, membranele au fost incubate cu anticorpi secundari, IgG anti-șoarece de iepure conjugat cu HRP sau IgG anti-iepure de șoarece conjugat cu HRP la temperatura camerei timp de 2 ore. Substratul chemiluminescent al HRP a fost apoi adăugat pentru a detecta proteinele. Analiza densitometrică a intensității benzii de proteine ​​a fost efectuată utilizând software-ul Image J (NIH, SUA). b-actina a fost folosită ca control al încărcării pentru normalizare.

Test de imunohistochimie

Probele de țesut au fost încorporate în parafină și tăiate în 4 mm pentru colorarea imunohistochimică. Secțiunile suferă deparafinizarea și rehidratarea și inactivarea peroxidazelor endogene. Secțiunile au fost supuse recuperării antigenului în tampon citrat (PH=6) la 95 de grade timp de 10 minute. Apoi, 5% ser normal de capră a fost folosit pentru blocare la temperatura camerei timp de 40 de minute. mAb 1A8 a fost utilizat ca anticorp primar pentru antigenul HTNV NP și incubat cu secțiuni de țesut la 4 grade peste noapte. Aceasta a fost urmată de colorarea cu FITC anti-șoarece IgG (Invitrogen) la 37 de grade timp de 1 oră și apoi DAPI timp de 10 minute la temperatura camerei. 3DHISTECH (Ungaria) a fost folosit pentru achiziția de imagini și CaseViewer2.4 pentru analiza datelor.

Examenul histologic

Pentru a păstra morfologia celulelor și țesuturilor, a fost utilizată formalină tamponată neutră 4% pentru a fixa probe de țesut pentru analiza histopatologică. Aceste țesuturi au fost prelucrate în secțiuni de 5 mm și apoi colorate cu hematoxilină și eozină (H&E). În cele din urmă, secțiunile au fost examinate prin microscopie ușoară, iar imaginile au fost surprinse de 3DHISTECH (Ungaria), analizate de CaseViewer2.4. Gradul de leziuni a fost marcat vizual folosind un sistem prestabilit de note 4-: în limite normale ca 0, minim ca 1, ușoară ca 2, moderat ca 3, sever ca 4.

Studii pe animaleToate experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul de Experimentare de Laborator al Centrului pentru Animale al IV-lea Militar Medical University. (Nr.20210403).

StatisticiDatele au fost analizate folosind software-ul GraphPad Prism 9. Dacă nu se specifică altfel, toate datele au fost prezentate ca medie ± abaterea standard (SD). Testele t sau ANOVA unidirecțional au fost utilizate așa cum se specifică în legendele figurilor. O valoare P mai mică de 0,05 a fost considerată semnificativă.

REZULTATE

Detectarea încărcăturii virale în diferite organe ale șoarecilor Nlrc3−/− după infecția intraperitoneală cu HTNV

Pentru a caracteriza susceptibilitatea șoarecilor Nlrc3-/- la infecția cu HTNV, un grup de șoareci Nlrc3-/- au fost infectați intraperitoneal cu 5 × 105 PFU de HTNV per șoarece, folosind șoareci WT ca martori. Toate animalele au fost monitorizate zilnic pentru simptome clinice, temperatură și modificări ale greutății corporale. Șoarecii au fost sacrificați la 3, 6, 9 și 12 zile după infecție (dpi) pentru a analiza diferiți parametri de laborator, încărcături virale și patologie. Șoarecii Nlrc3−/− au început să piardă în greutate la 4 dpi și cu 6 dpi a fost înregistrată pierderea în greutate > 5% din greutatea lor inițială. În comparație, șoarecii WT nu au prezentat nicio pierdere în greutate (Figura 1A). Nu a fost înregistrată febră în ambele grupuri (Figura 1B). Pentru a evalua diseminarea și replicarea HTNV la șoarecii provocați viral, serul și organele majore (inclusiv inima, ficatul, splina, plămânul, rinichii și creierul) au fost colectate pentru cuantificarea absolută a numerelor de copii ale ARN viral. Rezultatele au arătat că viremia a apărut la 3 dpi în ambele grupuri (șoareci Nlrc3-/-: 943 ± 140 copii echivalente per ml; șoareci WT: 803 ± 277 copii pe ml). În special, încărcările virale serice ale șoarecilor WT au atins un vârf la 3 dpi și au scăzut rapid după aceea, în timp ce la șoarecii Nlrc3-/-, încărcătura virală a menținut un nivel intermediar până la 6 dpi și apoi a scăzut progresiv la nivelul scăzut de 9 dpi (Figura 1C). În plus, am colectat întregul sânge al șoarecilor infectați cu HTNV în zilele 0, 3, 6 și 9 post-infecție pentru a determina replicarea virală în sânge. Rezultatele au arătat că încărcătura virală a crescut cu 3 dpi și apoi a scăzut, sugerând replicarea virală în celulele sanguine. După cum se arată în figura suplimentară 1, numărul de copii virale la șoarecii Nlrc3-/- a fost mai mare decât la șoarecii WT (șoarecii Nlrc{3-/-: 5752 ± 502 copii pe ml; șoareci WT: 3589 ± 869 copii pe ml) la 3 dpi. Mai mult, au fost detectate încărcături virale de 2- ori mai mari în splinele șoarecilor Nlrc3-/- (3033 ± 175 copii echivalente per mg) decât șoarecii WT (1520 ± 425 copii per mg) la 6 dpi; același model a fost observat la rinichi la 9 dpi (șoareci Nlrc3-/-: 500 ± 87 copii echivalente per mg; șoareci WT: 270 ± 40 copii pe mg) (Figura 1C). În general, au fost detectate încărcături virale modeste mai mari la șoarecii Nlrc3-/- decât la șoarecii WT.

Apoi, am examinat nivelurile de nucleoproteine ​​HTNV (NP). După cum se arată în figurile 2A, C, șoarecii Nlrc3-/- au prezentat niveluri mai mari de antigen viral decât șoarecii WT în splină și rinichi. Analiza statistică a antigenelor virale din rinichi și splină a fost prezentată în figurile 2B, D, respectiv. Au fost detectate niveluri scăzute de antigene virale în inimă, ficat, plămân și creier ale șoarecilor Nlrc3-/- (Figura 2 suplimentară). Nivelurile de proteină NP virală în inimă, plămâni și creier ale șoarecilor Nlrc3-/- au fost mai mici decât șoarecii WT la nivel de proteine ​​(Figurile suplimentare 2B, F, H), dar semnificațiile statistice au fost arătate între inimă și creier atât pe ARNm. și nivelurile de proteine ​​(Figurile suplimentare 2A, E, I). Această descoperire a sugerat că activ viral

replicarea a avut loc în sângele, splina și rinichiul șoarecilor Nlrc3-/- după infecția cu HTNV. În cele din urmă, am folosit imunofluorescența pentru a detecta nivelurile de expresie ale HTNV NP în splină și rinichi. Intensitatea fluorescenței HTNV NP FL a fost mai mare în rinichirenaltubuli (Figura 2E) și pulpa roșie a splinei (Figura 2F) a șoarecilor Nlrc3-/- decât șoarecilor WT la 6 dpi și 9 dpi. Împreună, aceste rezultate indică faptul că șoarecii Nlrc3-/- sunt mai sensibili la infecția intraperitoneală cu HTNV.

Testele de sânge de rutină ale șoarecilor Nlrc3−/− după infectarea cu HTNV

S-a acceptat pe scară largă faptul că patologia HFRS este în mare măsură mediată imun, incluzând complexe imune, activarea complementului, răspunsul celulelor T (24-26) și producția de citokine indusă de HTNV (26, 27), provocând leziuni ale mai multor organe. În plus, trombocitopenia este o caracteristică clinică obișnuită la cei infectați cu virușii febrei hemoragice virale (VHF). Astfel, am efectuat mai întâi un test hematologic folosind sânge integral recoltat de la șoareci Nlrc3-/- și WT la 3, 6, 9 și 12 dpi. Rezultatele au arătat că numărul PLT la șoarecii WT a scăzut la 3 dpi și apoi s-a recuperat treptat, dar au continuat să scadă la șoarecii Nlrc3-/- până la atingerea celei mai scăzute valori la 9 dpi, semnificativ mai mică decât cea în WT la 9 dpi (P<0.05) (figure="" 3a).="" the="" decrease="" of="" wbc="" counts="" was="" observed="" on="" 3="" dpi="" and="" then="" gradually="" recovered="" to="" normal="" levels="" in="" both="" mouse="" strains="" (figure="" 3b).="" to="" further="" dissect="" the="" subset="" changes="" in="" wbcs,="" we="" analyzed="" on="" 0,="" 3,="" 6="" dpi="" the="" number="" of="" monocytes,="" neutrophils,="" lymphocytes,="" and="" t="" cells="" by="" routine="" blood="" tests="" combined="" with="" fellow="" cytometry="" assay.="" the="" number="" of="">

a crescut semnificativ la șoarecii Nlrc3-/- la 6 dpi, dar nu la șoarecii WT (Figura 3C). Neutrofilele la ambele tipuri de șoareci au scăzut ușor, dar și-au revenit la un nivel mediu la 6 dpi (Figura 3D). Numărul de limfocite a scăzut semnificativ la 3 dpi, în timp ce au început să crească la șoarecii WT la 6 dpi, numărul de limfocite a rămas la un nivel scăzut la 6 dpi la șoarecii Nlrc3-/- (Figura 3E). Raportul dintre celulele CD3 plus CD4 plus T versus CD3 plus CD8 plus celulele T din sângele periferic a fost determinat prin citometrie colegilor și s-a dovedit a fi crescut la 3 dpi și apoi s-a inversat rapid la 6 dpi, în concordanță cu modificările observate adesea la pacienții cu HFRS (Figura 3F), la care celulele CD4 plus T au scăzut dramatic și celulele CD8 plus T rămân neschimbate sau s-au extins compensator pentru a rezulta un raport invers de CD4/CD8. Aceste constatări au sugerat că inocularea intraperitoneală a HTNV la șoarecii Nlrc3-/- a indus, într-o oarecare măsură, principalele caracteristici clinice ale pacienților infectați cu HTNV, cum ar fi trombocitopenia și raportul inversat al celulelor T CD4/CD8.

Modificări patologice în rinichiul șoarecilor infectați Nlrc3−/− prezintă hemoragie interstițială renală marcată și dilatare a tubilor renaliApoi, modificările patologice ale șoarecilor infectați cu HTNV au fost evaluate prin colorare cu H&E și s-au constatat că există în rinichiul tuturor șoarecilor infectați cu Nlrc3-/-, manifestat ca Edem derenalcelule epiteliale tubulare. La 6 dpi, s-au observat leziuni hemoragice înrenalmedular (Figura 4A).tubul renaldilatația a fost observată devreme la 3 dpi, severitatea sa a atins un vârf la 9 dpi și a persistat până la 12 dpi și este mai pronunțată la șoarecii Nlrc3-/- decât la șoarecii WT (Figurile 4B, C). Aceste constatări au indicat

acea nefropatie acută caracterizată printubii renalidilataţie şihemoragie interstițială renalăa fost indusă la șoarecii Nlrc3-/- infectați cu HTNV. În ceea ce privește alte modificări patologice la nivelul ficatului, splinei, plămânilor, aceste două grupuri de șoareci au prezentat rezultate similare. Acestea au inclus în principal hematopoieza extra-medulară în splină, îngroșarea peretelui alveolar în plămân și degenerarea ficatului (Figurile suplimentare 3A-F). Pe baza celor de mai sus, caracteristicile patologice observate în rinichiul șoarecilor Nlrc3-/- în timpul fazei acute a infecției cu HTNV semănau îndeaproape cu modificările clinico-patologice din cazurile HFRS umane.

Pe baza acestui fapt, am examinat în continuare indicii corelați ai sângelui și urinei la șoareci pentru tulburările funcționale ale rinichilor. Serurile de șoarece au fost colectate pentru evaluarea alanin aminotransferazei (ALT), a fracțiunii MB creatin kinazei (CK-MB), a ureei, precum și a acidului uric (UA). După cum se arată în Figura 4D, în comparație cu șoarecii WT de control, nivelul UA seric a fost crescut semnificativ la 3 dpi la șoarecii Nlrc3-/-, CK-MB seric a fost crescut semnificativ la 9 dpi la șoarecii Nlrc3-/-, dar nivelurile serice de ALT, UREA și CREA nu au prezentat o creștere (Tabelul suplimentar 1).

Renalimplicarea în HFRS infectată cu PUUV include proteinurie tranzitorie, hematurie microscopică, dar rar vizibilă și AKI oligurică, urmată de poliurie și recuperare. Trăsătura tipică a proteinuriei în această boală a fost scăderea sa rapidă după faza acută a bolii (6). Într-o cohortă mare de pacienți cu nefrită tubulointerstițială acută cauzată de diverse etiologii, proteinuria a fost găsită la doar un sfert dintre pacienți, în timp ce doar 2% dintre toți pacienții a fost găsită proteinurie în intervalul nefrotic (28). Am colectat urina la 0, 3, 6 dpi și am constatat că nivelul proteinelor din urină a crescut la 3 dpi, faza acută a infecției. Concentrația proteinei din urină a crescut semnificativ și valoarea medie a fost apropiată de 0.3 g/L la 3 dpi la șoarecii infectați Nlrc3-/- și șoarecii WT (Figura 4E).

Pentru a examina celulele inflamatorii infiltrate înrenalinterstițial după infecția cu HTNV, am efectuat colorarea imunohistochimică (IHC) cu CD3, F4/80 și CD11b. Rezultatele au arătat că un grup de celule imunitare pozitive pentru CD3 s-au infiltrat înrenalinterstițial după infecția cu HTNV (Figura 5A) și celulele mieloide pozitive pentru CD11b au apărut în tubulointerstițial cortical (Figura 5B). Proporția de infiltrare a celulelor CD3 plus T și CD11b plus celule mieloide este semnificativ mai mare la șoarecii Nlrc3-/- infectați decât la șoarecii WT, dar macrofagele pozitive pentru F4/80 s-au distribuit pe tot cortexul renal și medulara și nu au prezentat un semn semnificativ. diferența dintre aceste două tipuri de șoarece (Figura 5C).

Infecția cu HTNV a indus un răspuns robust la citokine la șoarecii Nlrc3-/-

Supraproducția de citokine inflamatorii este raportată frecvent la subiecții cu HFRS și a dat naștere ipotezei că dereglarea citokinelor poate juca un rol esențial în patogeneza bolii. Vaheri şi colab. (8) au descoperit că mai multe citokine au fost produse de diferite celule, cum ar fi macrofage, monocite și limfocite, ca răspuns la semnale pro-inflamatorii, cum ar fi infecția virală. Wang şi colab. au raportat că concentrațiile serice de TNF-a, IL{3}, IFN-g, IL-8, IP-10 și RANTES (dar nu IL-4) au fost mult crescute la pacienții cu HFRS (29), comparativ cu martorii; și că cele mai mari concentrații au fost de obicei găsite în fazele febrile, hipotensive și oligurice, în special în cazurile de HFRS severe și de tip critic. Nivelurile ridicate de IL-6 plasmatice au fost asociate cu niveluri severerenaleșecul și trombocitopenia în HFRS indusă de PUUV și ar putea fi utilizate ca marker al severității bolii.

Rezultatele noastre au arătat că infecția cu HTNV a dus la o producție crescută de citokine, inclusiv CXCL-1, CCL-5, IL-6, IL-12, TNF-a și IFN-g în Șoarecii Nlrc3-/-, iar nivelurile acestor citokine au atins vârful la 6 sau 9 dpi; în comparație, șoarecii WT au avut răspunsuri mai slabe la citokine pe tot parcursul procesului de infecție (Figura 6).

În concluzie, am constatat în acest studiu că, după inocularea intraperitoneală a HTNV, șoarecii Nlrc3−/− dezvoltă pierdere în greutate,hemoragie renală, și dilatarea tubulilor. Aceste caracteristici seamănă cu simptomele clinice ale HFRS mai îndeaproape decât orice alte modele animale publicate anterior. Mai mult decât atât, șoarecii Nlrc3−/− au prezentat, de asemenea, o încărcătură virală mai mare în ser, splină și rinichi decât șoarecii WT, iar șoarecii Nlrc3−/− au dezvoltat tulburări hematologice și modificări patologice semnificative în mai multe organe, stabilind astfel infecția cu HTNV a Nlrc3−/ − şoarecii ca model nou pentru studiul HFRS.

DISCUŢIE

Modelul de șoarece HFRS descris aici demonstrează că șoarecii Nlrc3-/- infectați cu HTNV reprezintă un model de animal mic potrivit care poate fi utilizat pentru a evalua vaccinurile și terapiile HFRS. Modelul de șoarece Nlrc3−/− seamănă cu leziuni sistematice observate la om, caracterizate prin trombocitopenie, limfocitopenie, niveluri serice crescute de AST (disfuncție hepatică), LDH, fracțiune de creatinkinaza MB și UA.(disfuncție renală). În plus, șoarecii Nlrc3-/- au dezvoltat pierderea în greutate și aparentăhemoragie renală. Replicarea virală și modificări histopatologice în organele țintă au fost detectate în plămâni, splină, ficat și rinichi. În plus, a fost găsit un nivel modest mai mare de încărcături de ARN viral în sângele, splina și rinichii șoarecilor Nlrc3-/-. În comparație, șoarecii WT au dezvoltat modificări histologice ușoare, în ciuda detectării ARN viral în sânge, splină și rinichi.

Our findings are generally in agreement with what would be expected for HTNV infection-induced HFRS and signify an improvement over previously published animal models. It has been reported that hemorrhagic fever (HF) virus infection in animal models can lead to a spectrum of diseases from asymptomatic to mild and severe and often transient viremia. A transient weight loss usually manifests mild illness, but severe disease showed more significant weight loss (>20 la sută) (30). De exemplu, hamsterii infectați cu HTNV pe cale nazală au condus la o infecție asimptomatică persistentă, caracterizată prin viremie sporadică, dar niveluri ridicate de copii ale genomului viral în plămâni, creier și rinichi. Dihorii infectați cu HTNV în doză mare prin injecție musculară au prezentat o scădere treptată a greutății corporale (5-12 procente în timp), dar intacțifuncțiile renale, absența viremiei și lipsa transmiterii virusului la organe. La marmosets, injectarea intramusculară de HTNV a dus la un grad ridicat de seroconversie și producerea de anticorpi neutralizanți; în mod constant, aceste animale nu au avut leziuni renale, viremie sau transmitere a virusului la organe (13).

În ceea ce privește observația că modificările hematologice observate doar la un singur punct de timp și modificările citokinelor nu sunt semnificative, credem că acestea pot fi explicate prin natura infecției cu HTNV, care este similară cu multe alte infecții virale care afectează mai multe organe și, prin urmare, adesea. dificil de găsit modificări susținute ale unui singur parametru. În general, constatările noastre sunt în general în concordanță cu cunoștințele existente în domeniu. Mai mult, descoperirea șoarecilor Nlrc3−/− având mai multă susceptibilitate la infecția cu HTNV și care prezintă multe modificări similare cu modificările patologice ale HFRS este o nouă contribuție în domeniu. Este general acceptat că celulele endoteliale vasculare umane sunt ținta primară pentru hantavirus. , ceea ce duce la grade variabile de dilatare a capilarelor generalizate și edem (31).

Antigenele virale pot fi găsite în endoteliul capilar al diferitelor țesuturi (hantavirusurile direcționează permeabilitatea celulelor endoteliale prin sensibilizarea celulelor la factorul de permeabilitate vasculară VEGF, în timp ce angiopoietina 1 și sfingozina 1-fosfat inhibă permeabilitatea dirijată de hantavirus). Analiza histologică a arătat că au fost observați rinichii șoarecilor Nlrc3-/-tubii renalidilatație la 9 dpi, șoarecii Nlrc3-/- cu modificări patologice mai severe decât șoarecii WT și au persistat la 12 dpi. La șoarecii Nlrc3-/-, edem de celule epiteliale tubulare renale și hemoragie interstițială renală remarcabilă au fost observate în rinichi. În plus, a fost observată hematopoieza extra-medulară proeminentă în pulpa roșie a splinei la 6, 9 și 12 dpi și dilatări ale centrului germinal și un număr crescut de celule gigantice multinucleate la 12 dpi. Ficatul a prezentat, de asemenea, degenerare hepatocitară severă și necroză împrăștiată în zilele 3, 6, 9 și 12 dpi. Inflamația pulmonară și îngroșarea peretelui alveolar au fost observate la 6 dpi. Această constatare sugerează că infecția cu HTNV a avut un impact semnificativ și pe termen lung asupra ficatului și rinichilor la șoarecii Nlrc3-/- infectați cu HTNV. În plus, șoarecii Nlrc3-/- s-au arătat proeminentidilatarea tubului renal, hemoragie interstițială și disfuncție renală după infecția cu HTNV. Nivelul UA seric a fost semnificativ crescut la 3 dpi, un indiciu clar al disfuncției renale. Concentrația proteinei din urină a crescut semnificativ și valoarea medie a fost aproape de 0,3 g/L la 3 dpi la șoarecii infectați Nlrc3-/-. Aceeași tendință de creștere a UA nu a fost observată la șoarecii WT. Aceste rezultate sugerează că modelul nostru recapitulează mai multe caracteristici patologice ale infecției umane cu HTNV.

Proteina N (NP) este produsă din abundență în celulele infectate cu hantavirus și poate fi detectată devreme la 4 ore după infecție (32). Aceste caracteristici reprezintă principalul motiv pentru care obiectivul ELISA este de a detecta proteinele hantavirus N și testele de imunofluorescență pentru evaluarea numărului de particule virale și a progresiei infecției virale. Diferite metode pot afecta rezultatele obținute și concluziile la care se ajunge. Proteina virală și viremia sunt doi parametri diferiți ai infecției virale și este posibil să nu se schimbe întotdeauna sincron. Rezultatele PCR cantitative în timp real au arătat că o creștere tranzitorie a nivelurilor de NP a avut loc la 6 dpi în splină, unde virusul ar fi putut suferi o replicare tranzitorie, urmată de eliminarea sa după aceea. După cum era de așteptat, acumularea de proteine ​​virale a fost observată după viremia de vârf, care a apărut la 3 dpi. Într-adevăr, replicarea virală în splină și rinichi a fost menținută la un nivel moderat la 9 și 12 dpi, însoțită de sinteza proteinei N (splină la 9 dpi: șoareci WT: 192 ± 128 copii per mg; șoareci Nlrc3−/−: 431 ± 229 de copii per mg; splină la 12 dpi: șoareci WT: 160 ± 85 de copii per mg; șoareci Nlrc3-/-: 226 ± 118 copii per mg). Cu toate acestea, cantitatea de HTNV NP la nivel de proteine ​​a atins maximul în ziua 6 pi și rămâne ridicată pe tot parcursul 9 și 12 dpi. Diferența de cinetică a copiilor ARN viral și a cantității de proteine ​​ar putea reflecta degradarea diferențială a acestora în diferite organe.

Rolul citokinelor este de obicei mai complex în modelele de boală. În HFRS indusă de PUUV, severinsuficiență renalăiar trombocitopenia sunt asociate cu niveluri plasmatice ridicate de IL-6 (33). Analiza noastră a arătat că infecția cu HTNV a condus la o producție crescută de citokine, inclusiv CXCL-1, CCL-5, IL-6, IL-12, TNF-a și IFN-g în Șoarecii Nlrc3-/-, dar nu la fel de mult la șoarecii WT. Este de remarcat faptul că la 9 dpi, șoarecii Nlrc3-/- au prezentat modificări patologice remarcabile în splina și rinichi, însoțite de un răspuns robust al citokinei în acest moment. Aceste descoperiri indică faptul că un nivel ridicat de citokine ar putea fi legat de patogeneza bolii.

În rezumat, rezultatele pe care le raportăm aici demonstrează că, după ce au fost inoculați cu HTNV pe cale intraperitoneală, șoarecii Nlrc3−/− dezvoltă pierdere în greutate, trombocitopenie, rdisfuncții enale și hemoragie.Acestea seamănă mai mult cu simptomele clinice ale HFRS decât orice alte modele animale publicate anterior. Acest model poate fi utilizat pentru a evalua potențialele vaccinuri și terapii și pentru a studia în profunzime patogeneza HFRS in vivo.