Norwogonin atenuează stresul oxidativ și apoptoza induse de hipoxie în celulele PC12

Pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com

Abstract

Context: Norwogonin este o flavonă naturală cu trei grupe hidroxil fenolice în structură scheletică și are o excelentăactivitate antioxidantă. Cu toate acestea, efectul neuroprotector al norwogoninei rămâne neclar. Aici, am investigat capacitatea de protecție a norwogoninei împotriva daunelor oxidative provocate de hipoxie în celulele PC12. Metode: Viabilitatea celulară și apoptoza au fost examinate prin test MTT și, respectiv, colorarea cu anexină V-FITC/PI. Conținutul de specii reactive de oxigen (ROS) a fost măsurat utilizând testul DCFH-DA. Lactat dehidrogenază (LDH), malondialdehidă (MDA) șienzimă antioxidantănivelurile au fost determinate folosind truse comerciale. Expresia genelor și proteinelor înrudite a fost măsurată prin PCR cantitativă în timp real și, respectiv, Western blot. Rezultate: Am descoperit că norwogonina a atenuat leziunile induse de hipoxie în celulele PC12 prin creșterea viabilității celulare, reducerea eliberării LDH și ameliorarea modificărilor morfologiei celulare. Norwogonin a acționat și ca unantioxidntprin eliminarea ROS, reducerea producției de MDA, menținerea activităților superoxid dismutazei (SOD), catalazei (CAT) și glutation peroxidazei (GPx) și scăderea nivelurilor de expresie ale HIF-1 și VEGF. În plus, wogonina a prevenit apoptoza celulară prin inhibarea nivelurilor de expresie ale caspazei-3, citocromului c și Bax, crescând în același timp nivelurile de expresie ale Bcl-2 și raportul dintre Bcl-2/Bax. Concluzii: Norwogonin atenuează leziunile induse de hipoxie în celulele PC12 prin stingerea ROS, menținerea activităților enzimelor antioxidante și inhibarea căii de apoptoză mitocondrială.

Cuvinte cheie: Norwogonin,Activitate antioxidantă, hipoxie, stres oxidativ,Apoptoza

fundal

Organismele aerobe au nevoie de oxigen (O2) pentru a produce energie. Hipoxia este definită ca aport insuficient de O2 pentru a menține funcția celulară în țesut și apare adesea în unele situații fiziologice, cum ar fi altitudinea mare [1], și în multe situații patologice, cum ar fi accidentul vascular cerebral [2]. Creierul este deosebit de sensibil la leziunile induse de hipoxie datorită consumului său ridicat de oxigen, bogat în acizi grași nesaturați și scăzutcapacitate antioxidantă[3]. Dovezile tot mai mari au indicat că hipoxia poate induce efecte adverse asupra creierului [4-6].

Linlin Jing, Rongmin Gao, Jie Zhang, Dongmei Zhang, Jin Shao, Zhengping Jia și Huiping Ma

Departamentul de Farmacie, Spitalul al 940-lea al Forței de sprijin logistic comun al PLA, Lanzhou 730050, Gansu, China

Stresul oxidativ și apoptoza sunt considerate doi factori care contribuie la leziunile induse de hipoxie [7, 8]. S-a raportat că expunerea la hipoxie crește producția de specii reactive de oxigen intracelulare (ROS), care facilitează stresul oxidativ. Excesul de ROS, cum ar fi anionul superoxid (O2−˙), peroxidul de hidrogen (H2O2) și radicalul hidroxil (HO•), duce la modificări celulare structurale și funcționale, atacând lipidele, membranele, proteinele și ADN-ul și, ulterior, provoacă leziuni celulare. 9].

Faceți clic pentru a cistanche NZ pentru antioxidant

Simultan, ROS supraprodus facilitează, de asemenea, deschiderea porilor de tranziție a permeabilității mitocondriale (mPTP) [10] și transferul proteinelor pro-apoptoză către membrana mitocondrială exterioară, ceea ce induce depolarizarea membranelor mitocondriale și eliberarea de citocrom c [11]. Aceste modificări provoacă în cele din urmă apoptoză mitocondrială dependentă [12]. Deci, se crede că antioxidanții cu capacitatea de a inhiba sau elimina ROS excesive își pot exercita efectul protector prin atenuarea stresului oxidativ și a apoptozei induse de hipoxie. O mulțime de studii au demonstrat că suplimentele antioxidante precum vitamina C [13], izoflavona [8] și radicalii nitroxizi [14] pot limita leziunile induse de hipoxie in vitro și in vivo. Flavonoidele sunt o clasă mare și diversă de metaboliți secundari ai plantelor ubicui. Sunt întotdeauna considerați un excelent antioxidant natural, cu capacitatea de a elimina radicalii liberi și de a inhiba peroxidarea lipidelor.

În prezent, din ce în ce mai multă atenție s-a acordat acestei clase de compuși datorită efectelor lor benefice asupra sănătății umane. S-a demonstrat că flavonoidele dețin o gamă largă de acțiuni farmacologice, cum ar fi activitate antiinflamatoare, antinociceptivă și neuroprotectivă etc., toate acestea putând fi atribuite activităților lor antioxidante [15]. Multe studii au indicat că flavonoidele prezintă efecte protectoare excelente asupra eșecului indus de hipoxie. De exemplu, rutina are un efect neuroprotector puternic împotriva morții celulelor ganglionare retiniene induse de hipoxie [16]. Un studiu recent demonstrează, de asemenea, că rutina poate atenua daunele hipoxiei induse de clorură de cobalt prin inhibarea stresului oxidativ și a apoptozei în celulele H9c2 [17]. Mai mult, Liu și colab. sugerează că nobiletina (3′,4′,5,6, 7,8-hexametoxi flavonă) atenuează leziunea I/R miocardică prin activarea căii Akt/GSK-3 în celula H9c2 [18]. În plus, acacetina poate proteja cardiomiocitele de șobolan și cardiomioblastele H9C2 împotriva leziunilor induse de hipoxie/reoxigenare prin activarea mediată de AMPK a căii de semnalizare Nrf2 [19].

Norwogonin (5,7,8-trihidroxi flavonă, Fig. 1) este o flavonă activă farmacologic separată de rădăcina Scutellaria baicalensis Georgi ("Huang Qin" în chineză), o plantă tradițională chineză folosită pentru a trata gripa și cancerul [20, 21]. Cu toate acestea, au fost raportate studii limitate cu privire la activitățile biologice ale norwogoninei datorită nivelurilor sale scăzute din plantele naturale. Pentru a rezolva această problemă, sunt raportate mai multe metode de sinteză a norwogoninei [22, 23].

Studiul nostru anterior a stabilit, de asemenea, o metodă simplă de obținere a norwogoninei din crizină în patru pași [24]. Aceste cercetări au influențat pozitiv evaluarea ulterioară a activităților biologice ale norwogoninei. Studiile au arătat că norwogonina deține activități antioxidante [25], anticancerigene [26, 27], antivirale [28] și antimicrobiene [29], precum și inhibă producția de ROS stimulată cu cianuri [30]. Cu toate acestea, rămâne necunoscut dacă norwogonina are capacități de protecție împotriva leziunilor induse de hipoxie. Scopul acestui studiu a fost de a investiga efectele protectoare ale norwogoninei împotriva stresului oxidativ indus de hipoxie și a apoptozei în celulele PC12.

Metode

Materiale și reactivi

Norwogonina (puritate mai mare sau egală cu 98 la sută) a fost sintetizată conform metodei noastre raportate anterior [24]. Rutina (puritate mai mare sau egală cu 96 la sută) a fost achiziționată de la Ci Yuan Biotechnology Co., Ltd. (Xian, Shannxi, China). Norwogonina și rutina au fost dizolvate în dimetil sulfoxid steril (DMSO), depozitate la -20 de grade și diluate în mediul de cultură celulară imediat înainte de utilizare. Mediul Eagle modificat de Dulbecco (DMEM), serul fetal bovin (FBS), streptomicina și penicilina au fost achiziționate de la Solarbio Co., Ltd. (Beijing, China).

Trusele de malondialdehidă (MDA), lactat dehidrogenază (LDH), superoxid dismutază (SOD), catalază (CAT) și glutation peroxidază (GPx) au fost obținute de la Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Jiangsu, China). diacetat de 2′,7′-diclorura-hidrofluoresceină (DCFH-DA) și (3-(4,{5-dimetiltiazol{-2-il)-2,5- difeniltetrazoliu bromură) tetrazoliu (MTT) a fost obţinut de la Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO, SUA). Anticorpi primari pentru factorul inductibil de hipoxie-1 (HIF{-1 ), factorul de creștere a endoteliului vascular (VEGF), limfomul cu celule B-2 (Bcl{-2), Bcl{{17 }} proteina X asociată (Bax), caspaza-3, citocromul C și -actina au fost toate achiziționate de la Abcam (Cambridge, Marea Britanie). Anticorpii secundari au fost obținuți de la compania ZsBio (Beijing, China).

Un kit de analiză a apoptozei a fost obținut de la Institutul de Biotehnologie Beyotime (Jiangsu, China). Toate substanțele chimice și solvenții au fost de calitate analitică și au fost obținute de la un furnizor comercial din China. Cultură celulară Celulele PC12 au fost achiziționate de la Banca de celule a Academiei Chineze de Științe (TCR 9, Shanghai, China) și menținute în DMEM cu 10% (v/v) FBS, 100 U/mL penicilină și 100 U/mL streptomicine la 37 de grade într-un incubator umidificat care conține 5 la sută CO2. Pentru a evalua citotoxicitatea norwogoninei, celulele PC12 (pasajul 4 ~ 6) au fost preincubate cu diferite concentrații (10− 8 , 10− 7, 10− 6, 10− 5, 10− 4 mol/L) de nor wogonin pentru 1 oră și apoi cultivat timp de 24 de ore. Expunerea la hipoxie Pentru a induce modelul de leziune a hipoxiei celulare, celulele PC12 au fost supuse unui mediu de hipoxie (1% O2, 5% CO2 și 94% N2) la 37 de grade timp de 24 de ore într-o cameră umidificată. Celulele de control normoxice au fost cultivate la 37 de grade într-un incubator cu 5% CO2 timp de 24 de ore.

Pentru a evalua efectul protector al norwogoninei împotriva leziunilor induse de hipoxie, celulele PC12 au fost pre-incubate cu diferite concentrații (10− 8, 10− 7, 10− 6, 10− 5 mol/ L) de norwogonin timp de 1 oră înainte de tratamentul hipoxiei. Viabilitatea celulelor Viabilitatea celulelor a fost măsurată prin test MTT așa cum s-a descris anterior [31]. Pe scurt, celulele PC12 (1 × 105 celule/mL) au fost însămânțate în plăci de cultură cu 96 de godeuri. Apoi s-au adăugat diferite concentrații de norwogonin în godeuri. S-a adăugat un volum egal de DMSO la godeurile de control. Concentrația finală de DMSO în mediul de cultură celulară este de 0,1 %. După incubare în condiții de normoxie sau hipoxie, s-au adăugat 10 μL de MTT (5,0 mg/mL) în fiecare godeu, urmat de incubare la 37 de grade timp de 4 ore. Apoi, supernatantul cu MTT a fost îndepărtat și produsul formazan a fost dizolvat în 100 μL DMSO. Absorbanța a fost măsurată pe un cititor de microplăci SpectraMax i3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, SUA) la 570 nm. Rezultatele au fost exprimate ca procent relativ al grupului de control. Celulele PC12 colorate cu hematoxilină și eozină (HE) însămânțate pe lamele de sticlă au fost incubate timp de 24 de ore înainte de a fi tratate cu norwogonin în același mod ca cel descris mai sus.

Mediul a fost îndepărtat și lamele de sticlă au fost spălate cu PBS rece, urmată de fixare cu metanol timp de 10 minute la temperatura camerei și apoi spălate cu PBS rece de trei ori timp de 5 minute. În cele din urmă, celulele au fost colorate conform protocolului de colorare HE [32]. Analizele celulei au fost efectuate folosind un microscop OLYMPUS IX73 (100×) pentru a verifica modificările morfologice ale celulei. Imaginile digitale au fost obținute folosind camera digitală DXM 1200 C (Nikon) asociată cu microscopul. Conținutul de ROS Nivelul intracelular de ROS în celulele PC12 a fost determinat utilizând testul DCFH-DA [33]. Pe scurt, celulele PC12 (1 × 105 celule/mL) au fost însămânțate în 6-plăci de godeuri. După tratamentul cu hipoxie, celulele PC12 au fost spălate cu PBS și apoi au fost incubate în mediul de cultură care conține 10 μM DCFH-DA timp de 30 de minute la întuneric la 37 de grade. Celulele au fost observate cu microscopul cu fluorescență inversată Olympus (Tokyo, Japonia) și au fost analizate cu un citometru în flux Bec ton Dickinson FACScan (BD Biosciences, CA, SUA) cu o lungime de undă de excitare de 488 nm și lungime de undă de emisie de 525 nm. Nivelul ROS a fost exprimat ca procent relativ al controlului. Scurgerile de LDH, conținutul de MDA și activitatea enzimatică antioxidantă. Celulele PC12 (1 × 105 celule/mL) au fost însămânțate într-un vas de 90 mm. După tratamentul hipoxiei, așa cum este descris mai sus, s-au colectat 50 μL de supernatant de cultură din fiecare vas și a fost detectată activitatea LDH în mediu folosind kituri comerciale de analiză (Institutul de Biotehnologie Jiancheng, Nanjing, China) și a fost exprimată ca U/mL. Celulele PC12 au fost recoltate și omogenizate după spălare de două ori cu PBS rece. Concentrația proteinei totale a fost măsurată prin trusa de analiză a proteinei BCA. Conținutul de MDA și activitatea enzimatică antioxidantă au fost determinate folosind kituri comerciale de testare (Institutul de Biotehnologie Jiancheng, Nanjing, China).

Conținutul de MDA a fost prezentat ca proteină nmol/mg. Activitățile SOD, CAT și GPx au fost prezentate ca proteină U/mg. Apoptoza celulară (colorare cu anexină-V/PI) După tratamentul cu hipoxie, celulele PC12 au fost recoltate, spălate de două ori cu PBS rece și apoi suspendate cu tampon de legare. Celulele au fost tratate cu soluția de anexină V-FITC și PI urmând protocolul producătorului (Beyotime, Shanghai, China). Colectările de date au fost efectuate utilizând citometrul de flux Becton Dickinson FACScan (BD Biosciences, CA, SUA). Analiza PCR cantitativă în timp real ARN-ul total al celulelor PC12 a fost extras folosind reactiv Trizol (Takara, Dalian, China) și convertit în ADNc utilizând kitul de reactiv PrimeScript TM RT (AK4301,

Takara, Dalian, China). ADNc care codifică gena HIF-1, VEGF, Bcl-2, Bax, caspaza-3, citocromul C și gliceraldehida-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) a fost amplificată prin PCR în timp utilizând un sistem de detectare în timp real 7300 (Applied Biosystems, CA, SUA). Primerii utilizați au fost prezentați în Tabelul 1. Condițiile de ciclu PCR au fost de 95 de grade timp de 30 s, urmate de 40 de cicluri de 95 de grade timp de 5 s și 60 de grade timp de 31 s. Nivelurile de ARNm au fost calculate folosind metoda 2-ΔΔCt și normalizate la GAPDH, care este gena de referință. Celulele Western blot PC12 au fost recoltate și omogenizate în agenți RIPA. Concentrația proteinelor totale a fost cuantificată folosind trusa de analiză a proteinei BCA. 30 ug de probe au fost rezolvate prin electroforeză SDS-PAGE 12% și apoi transferate pe membrane de fluorură de poliviniliden (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, SUA).

Membranele au fost blocate cu lapte uscat degresat 5% în tampon TBST timp de 1 oră la temperatura camerei și incubate cu anticorpi primari: anti-HIF-1 (1:300, ab179483, Abcam, Marea Britanie), anti-VEGF (1:1000, ab46154, Abcam, Marea Britanie), anti-Bcl-2 (1:1000, ab59348, Abcam, Marea Britanie), anti-Bax (1:500, ab32503, Abcam, Regatul Unit), anti caspază-3 (1:300, ab44976, Abcam, Marea Britanie), anti citocrom C (1:1000, ab13575, Abcam, Marea Britanie) și anti- -actină (1:2000, ab8227) , Abcam, Marea Britanie) la 4 grade peste noapte. Apoi, membranele au fost spălate și incubate cu anticorpi secundari (1:2000, ZsBio, Beijing, China;) timp de 1 oră la temperatura camerei. Benzile imunoreactive au fost vizualizate folosind reactivi de chemiluminiscență îmbunătățită (ECL). Intensitățile relative ale benzilor au fost normalizate la controlul intern -actină și analizate folosind Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, SUA).

analize statistice

Rezultatele au fost exprimate ca medie ± SD derivată din cel puțin trei experimente independente. Diferența dintre grupuri a fost analizată utilizând analiza unidirecțională a varianței (ANOVA), urmată de testul post-hoc Student-Newman-Keuls. O valoare P de < 0,05="" a="" fost="" considerată="" semnificativă="">

Rezultate

Celulele PC12 protectoare Norwogonin împotriva leziunilor induse de hipoxie

În primul rând, pentru a preveni activitatea proliferativă a norwogoninei, citotoxicitatea acesteia pe celulele PC12 normale a fost determinată folosind un test MTT. După cum se vede în Fig. 2a, proliferarea celulară nu a fost modificată semnificativ în urma tratamentului cu norwogonină la concentrații de 1 × 10− 8 -1 × 10− 5 mol/L (P > 0,05). ). Cu toate acestea, viabilitatea celulară a scăzut semnificativ atunci când concentrația de norwogonin a fost crescută la 1 × 10-4 mol/L (P <0,05). rezultatele="" au="" indicat="" că="" norwogonina="" nu="" a="" prezentat="" toxicitate="" sau="" activitate="" proliferativă="" pe="" celulele="" pc12="" la="" concentrații="" de="" 1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−="" 5="">

Apoi am examinat efectul protector al norwogoninei împotriva leziunilor celulelor PC12 induse de hipoxie. După cum se arată în Fig. 2b, în ​​comparație cu grupul de control, viabilitatea celulelor în grupul cu hipoxie a scăzut la 58,71 la sută (P <0.01). comparativ="" cu="" tratamentul="" cu="" hipoxie,="" pretratat="" cu="" 1="" ×="" 10−="" 8="" ,="" 1="" ×="" 10−="" 7="" și="" 1="" ×="" 1{0−="" 6="" mol/l="" norwogonin="" protejat="" în="" funcție="" de="" doză="" pc12="" celule="" împotriva="" leziunilor="" induse="" de="" hipoxie,="" recuperând="" viabilitatea="" celulelor="" de="" la="" 58,71="" la="" 62,79="" la="" sută="" (p="">< 0,05),="" 66,68="" la="" sută="" (p="">< 0,01)="" și,="" respectiv,="" 69,88="" la="" sută="" (p="">< 0,01).="" pretratamentul="" cu="" rutina="" de="" 1="" ×="" 10-6="" mol/l="" a="" prezentat,="" de="" asemenea,="" un="" efect="" protector,="" crescând="" semnificativ="" viabilitatea="" celulelor="" la="" 63,78%="" în="" comparație="" cu="" tratamentul="" cu="" hipoxie.="" viabilitatea="" pretratată="" cu="" 1="" ×="" 10−="" 5="" mol/l="" norwogonin="" a="" fost="" scăzută="" la="" 63,43%,="" ceea="" ce="" este="" încă="" semnificativ="" mai="" mare="" decât="" cea="" din="" grupul="" cu="" hipoxie="" (p=""><0,05). aceste="" rezultate="" au="" demonstrat="" că="" norwogonina="" a="" arătat="" o="" citoprotecție="" semnificativă="" la="" concentrații="" de="" 1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−="" 5="" mol/l="" și="" cea="" mai="" eficientă="" concentrație="" este="" 1="" ×="" 10−="" 6="" mol/l.="" apoi="" această="" doză="" a="" fost="" utilizată="" ca="" doză="" optimă="" în="" experimentele="">

Capacitatea protectoare a norwogoninei a fost verificată și prin modificări morfologice. După cum se arată în Fig. 2c, celulele PC12 fără tratament cu hipoxie au crescut bine cu forme regulate (fusiforme), dimensiuni uniforme. După expunerea la hipoxie, celulele PC12 au prezentat contracție, formă rotunjită, descuamare și densitate celulară redusă. Celulele pretratate cu norwogonină sau rutină înainte de expunerea la hipoxie au crescut mai bine, numărul de celule descuamare a scăzut și forma celulelor și-a revenit în mod normal. În plus, capacitatea de protecție a norwogoninei a fost confirmată de scurgerea LDH, care este asociată cu pierderea integrității membranei celulare. După cum se arată în Fig. 2d, activitatea LDH în mediul de cultură a fost semnificativ crescută după expunerea la hipoxie (P <>

Pretratamentul cu norwogonin sau rutina a scăzut dramatic scurgerea de LDH, sugerând că norwogonina și rutina au restabilit integritatea membranei celulare. Norwogonin inhibă stresul oxidant indus de hipoxie în celulele PC12. ROS și MDA sunt doi indicatori importanți ai stresului oxidant celular indus de hipoxie. După cum se arată în Fig. 3a și b, a fost observat un conținut semnificativ crescut de ROS și MDA în celulele PC12 după expunerea la hipoxie. Norwogonina sau pretratamentul cu rutina a inhibat semnificativ producerea de ROS și MDA.

Enzimele antioxidante, cum ar fi SOD, CAT și GPx, sunt considerate ca principalul sistem de apărare împotriva stresului oxidativ în celule. După cum se arată în Fig. 3c-e, expunerea la hipoxie a inhibat semnificativ activitățile SOD, CAT și GPx în celulele PC12. Tratamentul cu norwogonin sau rutina a inversat aceste modificări și a restabilit activitățile enzimelor antioxidante. Toate aceste rezultate au indicat că norwogonina a protejat celulele PC12 împotriva stresului oxidativ indus de hipoxie.