Nicotina paternă îmbunătățește memoria fricii, reduce administrarea de nicotină și modifică funcția genetică și neuronală a hipocampului la descendenți

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Lisa R. Goldberg1*|Dana Zeid1*|Munir Gunes Kutlu2|Robert D. Cole3|Valeria Lallai4|Aswathy Sebastian5|Istvan Albert5|Christie D. Fowler4|Vinay Parikh6|Thomas J. Gould1

1Departamentul de Sănătate Biocomportamentală, Universitatea Penn State, University Park, Pennsylvania

2Departamentul de Farmacologie, Școala de Medicină Vanderbilt, Nashville, Tennessee

3Colegiul de Farmacie, Universitatea din Kentucky, Lexington, Kentucky

4Departamentul de Neurobiologie și Comportament, Universitatea din California Irvine, Irvine, California

5Bioinformatică, biochimie și biologie moleculară, Universitatea Penn State, University Park, PA

6Departamentul de Psihologie, Universitatea Temple, Philadelphia, Pennsylvania

Abstract

Consumul de nicotină rămâne foarte răspândit în cazul produselor din tutun și țigări electronice consumate în întreaga lume. Cu toate acestea, dovezile tot mai mari ale moștenirii epigenetice transgeneraționale sugerează că utilizarea nicotinei poate modifica comportamentul și neurobiologia în generațiile ulterioare. Am testat efectele expunerii paterne cronice la nicotină la șoarecii C57BL6/J asupra condiționării fricii la descendenții F1 și F2, precum și dispariția fricii condiționate și recuperarea spontană, autoadministrarea nicotinei, funcționarea colinergică a hipocampului, expresia ARN și metilarea ADN-ului în F1. descendenți. Expunerea paternă la nicotină a fost asociată cu o condiționare contextuală îmbunătățită a fricii și cu recuperarea spontană a amintirilor de frică stinse. În plus, întărirea cu nicotină a fost redusă la șoarecii cu nicotină, așa cum a fost evaluat într-o paradigmă de auto-administrare. Aceste fenotipuri comportamentale au fost cuplate cu un răspuns modificat la nicotină, legare la receptorul nicotinic de acetilcolină din hipocamp, curenți colinergici hipocampali evocați redusi și metilarea și expresia modificate a genelor hipocampale legate de dezvoltarea neuronală și plasticitatea. Analiza expresiei genelor sugerează efecte multigeneraționale asupra rețelelor mai largi de gene potențial implicate în neuroplasticitate și tulburări mentale. Schimbările în condiționarea fricii sugerează în mod similar fenotipuri analoge tulburărilor de anxietate similare stresului posttraumatic.

CUVINTE CHEIE: colinergic, hipocamp, învățare, multigenerațional, nicotină, transgenerațional

efectele cistanchei

1. INTRODUCERE

Dovezile acumulate sugerează că impactul expunerii la droguri de abuz se extinde dincolo de individ pentru a afecta fenotipurile fiziologice și comportamentale la descendenții neexpuși.1-3 Caracterizarea efectelor nicotinei de-a lungul generațiilor este critică, având în vedere prevalența consumului de produse din tutun4 și creșterea dramatică. prin efectele sale asupra sistemelor colinergice ale creierului, expunerea la nicotină produce modificări marcate ale funcției creierului care pot sta la baza dependenței de nicotină și pot contribui la creșterea riscului de tulburări psihiatrice, inclusiv depresie6 și anxietate.7 Modificările epigenetice în aval de activarea colinergică pot permite efecte persistente asupra funcției celulare și circuitelor.8,9 Până de curând, se credea că aceste modificări epigenetice au fost șterse la stabilirea liniei germinale și astfel sechestrate de la generațiile ulterioare. Cu toate acestea, modificările epigenetice, inclusiv metilarea ADN-ului, modificările posttranslaționale ale histonelor și ARN-urile necodificatoare, dobândite într-o generație pot fi moștenite în generația următoare.10,11 Aceste modificări epigenetice pot media efectele multigeneraționale și transgeneraționale ale expunerii parentale la nicotină asupra comportamentului și neurobiologiei descendenților. .

Studiile la rozătoare de la mai multe laboratoare independente au început să identifice consecințele multigeneraționale și transgeneraționale ale expunerii părinților la nicotină. Această lucrare a identificat până acum efectele expunerii părinților la nicotină asupra fenotipurilor depresive și anxietate,1 flexibilitatea cognitivă,2 comportamentele asemănătoare tulburării de hiperactivitate cu deficit de atenție (ADHD)3 și expresiei genelor.1,2 Consecințele multigeneraționale și transgeneraționale ale expunerea la nicotină poate afecta endofenotipurile implicate în dependența de nicotină și sănătatea mintală. De exemplu, am arătat că expunerea la nicotină modulează condiționarea contextuală a fricii, un model de învățare a fricii dependentă de hipocamp, care este legat de vulnerabilitatea la tulburările de sănătate mintală, cum ar fi tulburarea de stres posttraumatic (PTSD) și dependența.12-14 Nicotinei efectele asupra învățării fricii contextuale sunt modulate de hipocamp.15,16 Am descoperit că expunerea acută la nicotină îmbunătățește învățarea fricii dependente de hipocamp,15,17 afectează stingerea fricii contextuale18,19 și mărește recuperarea spontană a fricii contextuale în urma extincție.18 Cu toate acestea, efectele multigeneraționale și transgeneraționale ale expunerii paterne la nicotină asupra acestor fenotipuri nu au fost studiate. În plus, niciun studiu anterioare nu a caracterizat efectele multi-generaționale ale nicotinei asupra funcției colinergice. Moștenirea multigenerațională se referă la fenotipurile care apar în generația imediat următoare indivizilor expuși, în timp ce moștenirea transgenerațională constă în moștenirea mediată de linia germinativă a informațiilor epigenetice între generații, în absența influențelor directe ale mediului care să conducă la variația fenotipică.11 Aici, am examinat atât multigeneraționale. și efectele transgeneraționale ale expunerii paterne la nicotină asupra învățării fricii contextuale și stimulate în generația F1 și F2, precum și asupra autoadministrarii de nicotină, legarea receptorului nicotinic de acetilcolină din hipocamp (nAChR), funcționarea colinergică a hipocampului, expresia genei hipocampului și metilarea ADN-ului hipocampal în generația F1. Emitem ipoteza că expunerea paternă la nicotină va avea un impact asupra condiționării fricii, asupra expresiei genelor hipocampice și asupra funcției la descendenți și progenituri.

efectele extractului de cistanche

2 METODE ȘI MATERIALE

2.1 Subiecte

Subiecții au fost șoareci masculi și femele C57BL/6J (cu vârsta de 8-20 de săptămâni, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Cu excepția adăposturilor pentru reproducerea haremului, toate animalele au fost găzduite în grup cu un ciclu lumină/întuneric de 12 ore și acces ad libitum la hrană și apă. În timpul autoadministrarii, subiecților li s-a limitat hrana la 85% până la 90% din greutatea corporală alimentată gratuit, iar apă a fost furnizată ad libitum. Toate testele comportamentale au avut loc între 9:00 AM și 6:00 PM. Toate procedurile au fost efectuate în conformitate cu Ghidul NIH pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator și aprobate de comitetele IACUC de la Penn State University, Temple University sau University of California Irvine.

2.2 Expunerea paternă la nicotină

Bărbații (8 săptămâni) au primit 0,9 la sută soluție salină sterilă sau sare hidrogen tartrat de nicotină (12,6 mg/kg/zi, greutate bază liberă - Fisher Scientific, Waltham, MA sau MP Biomedical, Santa Ana, CA) dizolvată în 0, 9% ser fiziologic steril, administrat subcutanat prin mini-pompe osmotice (Alzet, Model 1004, Durect, Cupertino, CA) timp de 28 de zile. Această doză produce niveluri plasmatice de nicotină și cotinină comparabile cu cele observate la fumătorii umani moderati.20,21

2.3 Generarea de șoareci F1 și F2

Timpul de înjumătățire al nicotinei la șoareci este de aproximativ 6 minute.22 S-a demonstrat anterior că efectele retragerii nicotinei se disipează cu 4 zile după eliminarea nicotinei.23-25 Prin urmare, o întârziere de 4 zile între tratamentul cu nicotină și reproducerea a fost implementată pentru a asigura eliminarea sistemică a nicotinei înainte de reproducere. Șoarecii masculi au fost plasați în cuști cu două femele naive C57BL/6 J (cu vârsta de 8-20 săptămâni) timp de 2 săptămâni pentru a genera descendenți F1. Șoarecii F2 au fost generați prin împerecherea șoarecilor masculi F1 naivi cu femele naive.

2.4 Condiționarea fricii

Procedurile de condiționare și stingere a fricii au fost descrise în detaliu anterior.19 Pe scurt, șoarecii au fost dresați și testați în camere de atenuare a zgomotului (18,8 × 20 × 18,3 cm, zgomot de fond de 65 dB; MED Associates, St. Albans, VT). Șoarecii F1 și F2 au fost condiționați de frică cu două perechi de stimuli condiționati (CS, 30 s, zgomot alb de 85 dB)-stimul necondiționat (SUA, 2 s, șocuri de picior de 0,57 mA) separați de 120 de secunde. Pentru a examina efectele acute ale nicotinei asupra condiționării fricii la șoarecii F1 și F2, descendenții au primit nicotină acută (0,09 mg/kg, greutate bază liberă NIC, ip; sare hidrogen tartrat de nicotină, Fisher Scientific) sau soluție salină (SAL) cu 2 până la 4 minute înainte la sesiunile de antrenament și testare. La douăzeci și patru de ore după antrenament, șoarecii au fost returnați în contextul de antrenament timp de 5 minute pentru a evalua înghețarea contextuală. După testarea contextuală, șoarecii au fost plasați în camere distincte pentru a evalua învățarea fricii. Experimentatorii orbi la condițiile evaluate înghețarea, definită ca absența mișcării voluntare în afară de respirație, printr-o metodă de eșantionare a timpului imparțial.19 Pentru a examina efectele potențiale ale plafonului în timpul testării cu indicii, o cohortă separată de șoareci F1 a primit un antrenament identic cu un singur CS-US. împerecherea și stingerea fricii contextuale și recuperarea spontană au fost, de asemenea, examinate. Stingerea fricii a avut loc pe parcursul a cinci sesiuni consecutive, începând cu o zi după testarea fricii contextuale și cu indicii. După sesiunea finală de extincție, șoarecii au fost lăsați netulburați în cuștile lor de acasă timp de 7 zile și apoi retestați în contextul de antrenament pentru recuperare spontană. Pentru a determina dacă orice diferență observată în condiționarea fricii s-a datorat diferențelor de sensibilitate la șoc, anxietate sau deficite mai ample de învățare, animalele masculi și femele NIC și SAL au fost testate suplimentar în câmp deschis, sensibilitate la șoc, labirint plus crescut ( EPM) și noi paradigme de recunoaștere a obiectelor (consultați informațiile de sprijin pentru metode și rezultate complete).

2.5 Autoadministrare de nicotină alimentară și intravenoasă

A separate cohort of adult SAL‐Sired and NIC‐Sired F1 mice were used for food and nicotine self‐administration studies. Beginning at 6 weeks of age, male F1 mice were weighed, mildly food‐restricted to 85% to 90% of their free‐feeding body weight, and then trained to press a lever in an operant chamber (Med Associates) for food chow pellets (20 mg; TestDiet, Richmond, IN) under a fixed‐ratio 5, time out 20 seconds (FR5TO20 sec) schedule of reinforcement (see Supporting Information for full methods). Once stable responding was achieved (>25 de pelete pe sesiune în trei sesiuni ulterioare), subiecții au fost cateterizați în vena jugulară sub anestezie cu izofluran (1% -3%)/vapori de oxigen, așa cum s-a descris anterior.26 Soarecilor li s-a permis mai mult sau egal cu 72 de ore pentru a se recupera de la intervenție chirurgicală înainte de acces. pentru a răspunde din nou pentru o recompensă alimentară. Restabilirea răspunsului alimentar asigură că șoarecii s-au recuperat suficient după intervenția chirurgicală intravenoasă și prezintă un răspuns operant normal după o întârziere a accesului la camerele operante. Apoi șoarecilor li s-a permis să obțină autoadministrare intravenoasă (IV) de nicotină în timpul sesiunilor zilnice de 1 oră, 6 până la 7 zile pe săptămână (sare de hidrogen tartrat de nicotină dizolvată în 0,9% ser fiziologic steril, {{1{ {12}}}}.03 mg/kg/perfuzie, greutate bază liberă; MP Biomedical, Santa Ana, CA). Nicotina IV a fost administrată de o pompă cu seringă Razel (Med Associates). Fiecare sesiune avea două pârghii retractabile (una activă, una inactivă). Completarea criteriilor de răspuns pe pârghia activă a dus la administrarea unei perfuzii IV de nicotină (0.{{2{0}}volum de perfuzie de 3 ml; program FR5TO20 sec). Răspunsurile la pârghia inactivă au fost înregistrate, dar nu au avut consecințe programate. După opt ședințe de achiziție la 0,03 mg/kg/perfuzie, doza de perfuzie a trecut la 0,1 mg/kg/perfuzie timp de șase ședințe. Pentru fiecare doză, aportul mediu din ultimele trei ședințe a fost utilizat pentru analizele statistice. Cateterele au fost spălate zilnic cu soluție salină sterilă fiziologică (0,9 procente g/v) care conținea heparină (100 unități USP/ml). Permeabilitatea cateterului a fost verificată cu Brevital (metohexital de sodiu, Eli Lilly, Indianapolis, IN) după faza de autoadministrare a nicotinei. Pentru a evalua comportamentul legat de recidivă, șoarecii au fost testați pentru incubarea poftei după ședința imediat următoare ultimei doze de 0,1 mg/kg/perfuzie de autoadministrare IV de nicotină; în această procedură, șoarecilor li se permite să răspundă pe pârghia activă, dar nu primesc perfuzii de nicotină. În prima sesiune de incubație inițială (ziua 1), șoarecii au fost plasați în camere operante sub programul FR5TO20 sec cu activare contingentă a luminii indicatoare. După aceea, șoarecii au fost găzduiți în cuști de acasă timp de 20 de zile. În ziua 21 de abstinență, șoarecii au fost examinați pentru incubarea poftei, lumina indicatoare a pârghiei active fiind livrată conform programului FR5TO20 sec. Studiile au fost efectuate de experimentatori orbiți la condițiile grupului, iar răspunsurile comportamentale au fost înregistrate automat de software-ul MedAssociates.

2.6 Legarea receptorului nicotinic de acetilcolină

Un test de legare a radioligandului16 a fost efectuat folosind hipocampi de la șoareci F1 NIC-Sired (5 M și 10F) și SAL-Sired (9 M și 6F) de 8 săptămâni. Probele au fost omogenizate folosind tampon de liză (5 mM Tris plus 5 mM EDTA plus 5 mM EGTA), centrifugate la 100 000 g timp de 30 de minute la 4 grade, resuspendate în tampon de liză și centrifugate din nou. Peletele au fost resuspendate în tampon Tris/10% zaharoză și incubate cu [3H]Epibatidină ([3H]EB) (~2 nM pe baza 27,28) (activitate specifică 54,1 Ci/mmol, PerkinElmer, Boston, MA) timp de 1 oră la temperatura camerei. [3 H]EB a fost ales pentru legarea nAChR, deoarece rezultatele anterioare au arătat că nAChR-urile heteromerice hipocampale 4 2 mediază efectele nicotinei asupra condiționării fricii.17 Legarea nespecifică a fost evaluată în prezența a 300 μM de nicotină (sare hidrogen tartrat de nicotină). dizolvat în Tris Buffer, concentrație de bază liberă). NAChR-urile legate de [3 H]EB au fost filtrate (recoltator de celule cu 24 de godeuri, Brandel Co, Gaithersburg, MD) și un contor de scintilație lichidă (Tri-Carb 2810 TR, Perkin Elmer, Boston, MA) a măsurat radioactivitatea filtrului. Legarea specifică exprimată ca fmol/mg de țesut a fost calculată ca diferență între legarea totală și nespecifică.16

2.7 Înregistrări amperometrice colinergice in vivo

O cohortă separată de șoareci naivi NIC-Sired și SAL-Sired F1 cu vârsta de 10- până la 20 de săptămâni au fost utilizate pentru a evalua modificările transmisiei colinergice hipocampice utilizând amperometrie. Microelectrozii pe bază de ceramică (Center for Microelectrode Technology, Lexington, KY), cu 4 (15 × 333 μm) locuri de înregistrare de platină dispuse în perechi (superioare și inferioare), au fost acoperiți cu colinoxidază (EC Number 1.1.3.17; Sigma‐ Aldrich, St. Louis, MO), așa cum sa raportat anterior.29 Electrozii au fost electropolimerizați cu meta-fenilendiamină (m-PD; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) pentru a spori selectivitatea pentru detectarea curenților de colină. Microelectrozii cu o sensibilitate mai mare sau egală cu 3pA/μM și o limită de detecție mai mică sau egală cu 400 nM pentru colină au fost utilizați pentru a furniza un indice sensibil al eliberării de acetilcolină (ACh).30 Animalele au fost anesteziate cu uretan (1,2-1,5). g/kg, ip) și microelectrozii acoperiți cu enzimă au fost coborâți stereotaxic în dorsal (A/P -1,7 mm, M/L ± 1,5 mm, D/V -2,3 mm) sau ventral (A/P -3,1 mm, M). /L ± 3,0 mm, D/V −4,3 mm) hipocamp. Hipocampul ventral și dorsal au fost evaluate separat, deoarece contribuie în mod diferențial la condiționarea fricii contextuale: hipocampul ventral (vHPC) are un rol mai proeminent în asocierea și exprimarea fricii, în timp ce hipocampul dorsal (DHCP) este critic pentru memoria contextuală.31 Ag/ Electrozii de referință AgCl au fost implantați în cortexul rostral contralateral.

Înregistrările amperometrice au fost efectuate la 2 Hz prin aplicarea unui potențial fix de plus 0.7 V, iar datele au fost digitizate (potențiostat FAST-16, Quainton, Nicholasville, KY). Curenții de fond au fost stabilizați timp de 60 de minute, apoi medicamentele au fost aplicate în hipocamp folosind un capilar de sticlă (diametru vârf: 15 μm) atașat la electrod. Eliberarea de ACh evocată de depolarizare a fost măsurată prin aplicarea fie de impulsuri scurte de potasiu (KCl 70 mM; 100 NL) fie NIC (1 mM bază liberă, tartrat de nicotină; 100 NL) la 2 până la 10 psi la fiecare 2 minute. Înregistrările au fost contrabalansate pentru regiunea hipocampului (dorsal sau ventral) și medicament (potasiu sau NIC). Amplitudinile semnalului de colină au fost măsurate prin modificarea curentului pe canalul acoperit cu enzimă față de curentul de bază și convertite în echivalenți μM de colină pe baza calibrării in vitro. Auto-referința a fost adoptată pentru a elimina artefactele prin scăderea curenților din canalele santinelă.29 Plasarea microelectrodului a fost verificată prin colorarea Nissl a secțiunilor coronale ale hipocampului (Figura S1). Pentru analiza statistică au fost utilizate medii a două răspunsuri per manipulare de droguri per animal.

2.8 Analiză statistică

Comparațiile statistice au fost efectuate folosind SPSS (IBM, Armonk, NY) sau GraphPad Prism (La Jolla, CA, SUA). Valorile aberante au fost determinate de valori cu 2 abateri standard peste medie. Dacă a fost detectat un valori abere, informațiile sunt incluse în secțiunea cu rezultate. Criteriul de semnificație a fost stabilit la=.05. Analiza statistică a fost efectuată inițial, incluzând sexul ca factor pentru toate experimentele care au testat atât descendenții masculini, cât și feminini. Analizele s-au prăbușit în funcție de sex atunci când nu au fost detectate interacțiuni în trei sau în două sensuri cu sexul (P > 0,05). Datele au fost analizate prin test t, 1-way sau 2-way ANOVA, după caz. Efectele principale semnificative sau de interacțiune au fost urmate de comparații post-hoc cu LSD. ANOVA-urile cu măsuri repetate au fost urmate de compararea post-hoc Bonferroni cu corecție pentru comparații multiple. Dacă s-au detectat variații inegale, a fost utilizat testul t al lui Welch pentru variațiile inegale și s-au rotunjit gradele de libertate în jos.

2.9 Izolarea ARN/ADN

Șoarecii adulți F1 (8 săptămâni; n=3 M și 3 F per grup) au fost eutanasiați prin luxație cervicală. Hipocampii au fost disecați rapid în porțiuni ventrale și dorsale (într-un raport de 1: 1), adunați din partea stângă și dreaptă și congelați rapid pe gheață uscată. ADN-ul și ARN-ul au fost co-izolate și purificate folosind un AllPrep DNA/ARN Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Concentrația și calitatea ARN și ADN-ului au fost evaluate folosind NanoDrop2000 (NanoDrop, Wilmington, DE) și Agilent Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA). Pentru extracțiile de ARN, numărul minim de integritate a ARN (RIN) a fost 8,5.

2.10 Analiza transcriptomului prin

Bibliotecile de secvențiere a ARN au fost pregătite de Institutul Huck din Centrul de Genomics Life Sciences (Penn State University) pentru citiri cu un singur capăt de 150 bp folosind trusa de pregătire pentru bibliotecă ARNm ramificată Illumina TruSeq (Illumina, San Diego, CA) și secvențial pe Illumina HiSeq 2500 în modul de rulare rapidă (trei rulări consecutive cu aproximativ 10 milion de citiri per probă). Fișierele FASTQ au fost verificate de calitate prin FASTQC și au avut scoruri de calitate Phred medii pe citire mai mari de 30 (adică, eroare de secvențiere mai mică de 0,1 la sută). Fișierele FASTQ au fost aliniate la un genom de referință de șoarece (mm10; UCSC Genome Browser) folosind TopHat (v2.1.0)32 pe Galaxy Project33. Cufflinks și Cuffmerge (v2.2.1.0)34 au fost folosite pentru a asambla transcrierile din citirile mapate și pentru a îmbina fișierele de transcriere pentru asamblarea finală a transcriptomului. Valorile P ajustate ale ratei de descoperire falsă (FDR) au fost calculate pentru expresia diferențială a genei din probele NIC-Sired și SAL-Sired utilizând Cuffdiff (v2.2.1.3),34 cu o limită standard FDR de 0.05.35. Au fost depuse seturi de date transcriptom. la Gene Expression Omnibus.

2.11 Analiza îmbogățirii

Genele exprimate diferențial au fost analizate utilizând analiza căii ingeniozității (IPA, executată în decembrie 2018; www.qiagen.com/ingenuity; Qiagen, Redwood City, CA, SUA)36 pentru a dezvălui potențiala îmbogățire a rețelelor biologice asociative. Parametrii de rulare au specificat maximum 35 de molecule per rețea de gene și au limitat analiza la țesutul SNC de mamifer sau liniile celulare. Semnificația statistică pentru îmbogățire a fost determinată folosind un test exact Fisher cu coada dreaptă corectat pentru teste multiple.

2.12 Secvențierea țintită a bisulfiților

ADN-ul co-izolat cu ARN (vezi secțiunea 2.9) a fost folosit pentru analiza de metilare a ADN-ului. ARN-seq a identificat 952 și 162 de gene exprimate diferențial în vHPC și, respectiv, DHCP. Cele 101{0 gene unice din aceste liste combinate au fost selectate pentru îmbogățire în bisulfit-seq utilizând un sistem de îmbogățire Epi SeqCap personalizat (Roche, Pleasanton, CA, SUA; Tabelul S1).38 Bisulfit țintit secvențierea a fost efectuată la Penn State Huck Institutes din Life Sciences Genomics Core Facility. Bibliotecile au fost construite folosind kitul KAPA Hyper Prep (Kapa Biosystems, Wilmington, MA). Bibliotecile convertite cu bisulfit de sodiu au fost amplificate prin PCR și îmbogățite pentru regiuni genomice selectate folosind un set de sonde de captare personalizate (SeqCap Epi Choice Probes; Roche, Pleasanton, CA, SUA). ADN-ul capturat a fost secvențiat pe Illumina HiSeq 2500 utilizând citiri de 100 nt împerechete. Fișierele FASTQ au fost verificate de calitate prin FASTQC. Secvențele adaptoarelor Illumina au fost îndepărtate și bazele de calitate scăzută au fost tăiate folosind Trimmomatic.39 Tăierea bazei de calitate scăzută a fost efectuată cu o abordare cu fereastră glisantă, tăind atunci când calitatea medie într-o fereastră cu patru perechi de baze a scăzut sub un prag de 20, cu o lungime minimă de citire de 35. După tăiere, fișierele FASTQ au avut scoruri de calitate Phred medii pe citire mai mari de 30 (adică, eroare de secvențiere mai mică de 0,1 la sută). Citirile tăiate au fost mapate la genomul de referință al șoarecelui (mm10) folosind Bowtie240 implementat în Bismark.41 Extractul de metil_din Bismark a fost folosit pentru a extrage informațiile de metilare CpG și pentru a crea rapoarte de metilare. MethylKit42 a fost utilizat pentru analiza regiunilor metilate diferențiat (DMR). Starea de metilare a fost rezumată pe ferestre care nu se suprapun de 500 de perechi de baze și a fost efectuată o analiză de metilare diferențială, cu un FDR standard de 0,05,35. Seturile de date au fost depuse în Gene Expression Omnibus.

Beneficiul extractului de cistanche

3. REZULTATE

3.1 Nicotina paternă îmbunătățește condiționarea fricii contextuale și inversează îmbunătățirea acută a nicotinei a condiționării fricii contextuale la șoarecii din generațiile F1 și F2

Șoarecii masculi și femele F1 NIC-Sired și SAL-Sred au fost condiționati de frică în urma administrării acute de SAL sau NIC (0.{09 mg/kg ip, Figura 1A). Analiza completă a liniei de bază, pre‐CS și înghețarea CS este inclusă în Informațiile de sprijin. O ANOVA cu trei căi de înghețare contextuală cu tratamentul tatălui, tratamentul medicamentos acut și sexul ca factori a evidențiat o interacțiune semnificativă a tatălui × tratamentul acut cu medicamente (F(1,36)=32.75, P <.{{27 }}01).="" deoarece="" nu="" a="" existat="" o="" interacțiune="" semnificativă="" între="" sex="" și="" tată="" sau="" tratament="" medicamentos="" acut,="" a="" fost="" efectuată="" o="" anova="" bidirecțională="" prăbușită="" în="" funcție="" de="" sex="" și="" a="" evidențiat="" o="" interacțiune="" semnificativă="" între="" tratamentul="" tatălui="" și="" tratamentul="" medicamentos="" acut="" (f(1,40)="20.96" ,="" p="">< .001).="" comparațiile="" post-hoc="" au="" indicat="" că="" șoarecii="" f1="" nic-sired="" tratați="" cu="" soluție="" salină="" au="" prezentat="" o="" condiționare="" contextuală="" crescută="" a="" fricii="" în="" comparație="" cu="" șoarecii="" f1="" sal-sired="" tratați="" cu="" soluție="" salină="" (t20="2.73," p=""><.05). în="" conformitate="" cu="" descoperirile="" anterioare,43="" nic="" acută="" la="" 0,09="" mg/kg="" a="" produs="" o="" condiționare="" contextuală="" îmbunătățită="" a="" fricii="" la="" șoarecii="" sal-sired="" (t22="2.99," p=""><.01). cu="" toate="" acestea,="" nic="" acută="" la="" 0,09="" mg/kg="" a="" afectat="" condiționarea="" fricii="" contextuale="" la="" șoarecii="" născuți="" de="" nic="" (t18="3.36," p=""><.01). în="" general,="" nivelurile="" de="" înghețare="" a="" contextului="" la="" șoarecii="" nic-sired="" nic="" au="" fost="" comparabile="" cu="" cele="" observate="" la="" șoarecii="" sal-sired="" sal="" la="" ambele="" 0,09="" mg/kg="" (p=""> 0,05).

În plus, animalele masculi și femele NIC și SAL au fost testate în sensibilitatea la șoc (Figura S2), în labirint la nivel ridicat (EPM, Figura S3), în câmp deschis și în paradigme noi de recunoaștere a obiectelor (Figura S4, consultați informațiile de sprijin pentru metode complete). și rezultate). Cu excepția femelelor NIC-Sired din EPM (care au prezentat comportamente similare anxietății crescute) și animalelor NIC-Sred cu sensibilitate la șoc (care au arătat o reactivitate vocală scăzută la șoc, care nu ar confunda fenotipul multigenerațional de învățare a fricii sporită), nu există diferențe. au fost detectate între șoarecii NIC- și SAL-Sired.

FIGURA 1 Nicotina paternă îmbunătățește condiționarea fricii contextuală și atenuează creșterea acută de nicotină a condiționării fricii. Înghețarea contextuală a fost semnificativ mai mare în controalele NIC-Sired plus SAL comparativ cu martorii SAL-Sired plus SAL. Nicotina acută la 0,09 mg/kg a îmbunătățit condiționarea fricii contextuale la SAL-Sired, dar a redus semnificativ condiționarea fricii contextuale la animalele NIC-Sired (n=10-12 per grup). B, Înghețarea contextuală a fost semnificativ mai mare la martorii NIC-nepot plus SAL comparativ cu martorii SAL-nepot plus SAL (n=9-11 per grup). Barele de eroare indică eroarea standard a mediei (SEM), *P <>

Pentru a determina dacă condiționarea frică contextuală afectată a continuat în generația următoare (F2), șoarecii masculi și femele F2 NIC-spot și SAL-soare au fost crescuți de la șoareci masculi F1 naivi. Analiza completă a liniei de bază, pre‐CS și înghețarea CS este inclusă în Informațiile de sprijin. O ANOVA cu trei căi de înghețare contextuală a fost efectuată cu tratamentul cu strămoși, tratamentul medicamentos acut și sexul ca factori independenți (Figura 1B). Deoarece nu a existat o interacțiune semnificativă între sex și tată sau tratament medicamentos acut, a fost efectuată o ANOVA bidirecțională colapsă în funcție de sex. S-a găsit un efect principal semnificativ al tatălui (F(1,37)=9.88, P <.01), iar="" comparațiile="" post-hoc="" au="" indicat="" că="" șoarecii="" nic-grandsire="" au="" prezentat="" o="" condiționare="" contextuală="" crescută="" a="" fricii="" în="" comparație="" cu="" șoareci="" sal-grandsire="" (t39="3,04," p=""><0,01). în="" plus,="" șoarecii="" sal-nepoți="" cărora="" li="" s-a="" administrat="" nic="" acută="" au="" avut="" o="" condiționare="" contextuală="" îmbunătățită="" a="" fricii="" (t19="2.41," p="0.026)," dar="" nic="" acută="" nu="" a="" îmbunătățit="" condiționarea="" fricii="" contextuale="" la="" șoarecii="">

FIGURA 2 Nicotina paternă îmbunătățește condiționarea fricii și recuperarea spontană a memoriei fricii. Pentru a examina efectele potențiale ale plafonului în timpul testării cu indicii, o cohortă separată de șoareci F1 a primit un antrenament identic cu o singură pereche CS-US. Atât condiționarea fricii contextuală, cât și cea indicată au fost crescute la șoarecii NIC-Sired în comparație cu șoarecii SAL-Sired antrenați cu 1 pereche CS-US (n=8-10 per grup). B, Expunerea paternă la nicotină nu a afectat stingerea fricii contextuale, dar a îmbunătățit recuperarea spontană a memoriei fricii la 7 zile după sesiunea finală de extincție (n=8-10 per grup). Barele de eroare indică eroarea standard a mediei (SEM), *P <>

3.2 Nicotina paternă îmbunătățește condiționarea fricii la șoarecii din generația F1

Pentru a examina dacă un efect de plafon a împiedicat detectarea diferențelor de grup pentru condiționarea fricii (a se vedea informațiile de sprijin), un grup separat de șoareci F1 a fost antrenat cu o pereche CS-US. În această cohortă, s-a găsit îmbunătățirea condiționării fricii contextuale (t7=3.21, P < .05),="" precum="" și="" a="" condiționării="" fricii="" indiciate="" la="" șoarecii="" nic-sired="" (t6="2.41," p="">< .="" 05;="" figura="">

3.3 Nicotina paternă îmbunătățește recuperarea spontană a memoriei fricii contextuale la șoarecii din generația F1

Cohorta de șoareci F1 care a primit o pereche CS-US a fost ulterior testată pentru dispariția și recuperarea spontană a memoriei fricii contextuale. Șoarecii F1 NIC-Sired au prezentat o stingere normală a fricii, dar au afișat o recuperare spontană îmbunătățită a memoriei fricii contextuale în comparație cu șoarecii SAL-Sired (t7=3.38, P <0.05; figura="">

3.4 Nicotina paternă scade autoadministrarea nicotinei

Înainte de antrenamentul pentru autoadministrarea nicotinei, subiecții au fost analizați pentru capacitatea lor de a învăța o sarcină operantă pentru a obține recompensă alimentară și nu au fost observate diferențe (Informații justificative, Figura S5). Pentru a testa efectele potențiale ale expunerii la nicotină a tatălui asupra întăririi nicotinei la descendenții F1, a fost evaluată achiziția de autoadministrare IV de nicotină (0,03 mg/kg/perfuzie) într-un ANOVA cu design mixt în 2 căi, care a identificat un efect principal al sesiunii (F(7,119)=13.60, P < .001)="" și="" al="" unei="" interacțiuni="" sesiune="" ×="" tratament="" al="" tatălui="" (f(7,119)="5,00," p="">< .001).="" cu="" toate="" acestea,="" testele="" post-hoc="" nu="" au="" evidențiat="" diferențe="" semnificative="" statistic="" între="" grupuri="" la="" fiecare="" dintre="" cele="" opt="" sesiuni="" de="" achiziție="" (figura="" 3a).="" numărul="" de="" apăsări="" ale="" pârghiei="" active="" și="" inactive="" a="" fost="" apoi="" analizat="" pentru="" a="" determina="" dacă="" grupurile="" au="" menținut="" o="" preferință="" între="" sesiuni="" pentru="" pârghia="" activă="" în="" timpul="" achiziției="" (figura="" 3b),="" care="" a="" identificat="" un="" efect="" principal="" al="" sesiunii="" (f(7,238)="" {{20}="" }.18,="" p="">< .001)="" și="" o="" interacțiune="" sesiune="" ×="" tratament="" tare="" (f(21,238)="11.40," p="">< .001).="" analiza="" post-hoc="" a="" arătat="" că="" grupurile="" au="" fost="" diferite="" în="" prima="" zi="" de="" autoadministrare="" a="" nicotinei.="" grupul="" nic-sired="" a="" prezentat="" o="" mai="" mare="" apăsare="" activă="" a="" pârghiei="" în="" comparație="" cu="" grupul="" sal-sired.="" acest="" efect="" poate="" reprezenta="" fie="" un="" nivel="" mai="" mare="" de="" comportament="" de="" căutare="" a="" drogurilor="" în="" prima="" zi="" de="" expunere,="" perseverență="" de="" a="" răspunde="" pentru="" recompensa="" alimentară="" și/sau="" scăderea="" flexibilității="" cognitive="" în="" tranziția="" răspunsului="" de="" la="" hrană="" la="" medicament.="" cu="" toate="" acestea,="" această="" diferență="" nu="" a="" persistat="" în="" sesiunile="" ulterioare.="" șoarecii="" sal-sired="" au="" prezentat="" o="" preferință="" consistentă="" semnificativă="" statistic="" pentru="" pârghia="" activă="" față="" de="" pârghia="" lor="" inactivă="" (post-hoc="" p=""><.01), dar="" șoarecii="" nic-sired="" nu="" au="" prezentat="" această="" preferință="" menținută="" pentru="" sesiunile="" 3="" până="" la="">

FIGURA 3 Nicotina paternă reduce autoadministrarea nicotinei. Un șoareci mascul NIC și SAL (n=9-10 per grup) nu a diferit în numărul total de perfuzii obținute pentru fiecare sesiune în timpul perioadei de achiziție pe 0 .03 mg/kg/doza de perfuzie. B, În timpul achiziției, numărul de apăsări de pârghie active și inactive a diferit semnificativ la prima sesiune, nicotina pentru șoarecii NIC-Sired prezentând un număr mai mare de apăsări de pârghie active în comparație cu șoarecii SAL-Sired. Cu toate acestea, în sesiunile ulterioare, șoarecii NIC-Sired au scăzut răspunsul, ducând la nicio diferență semnificativă între numărul lor activ și inactiv de apăsări ale pârghiei în sesiunile 3 până la 8. În schimb, animalele SAL-Sired au prezentat o preferință consistentă semnificativă statistic pentru pârghia activă. peste pârghia lor inactivă. C, Numărul mediu de perfuzii de nicotină în ultimele trei sesiuni de achiziție nu a diferit semnificativ între șoarecii NIC- și SAL-Sired. D, La o doză moderată de 0,1 mg/kg/perfuzie, șoarecii NIC-Sired și-au auto-administrat un număr semnificativ mai mic de perfuzii de nicotină. E, Incubarea evaluării dorinței a evidențiat o creștere semnificativă a răspunsului la pârghia activă anterior după 21 de zile de abstinență numai pentru șoarecii SAL-Sired. Barele de eroare indică eroarea standard a mediei (SEM), *P <>

Pentru a examina în continuare diferențele potențiale de grup, controlând variabilitatea în timpul fazei inițiale de achiziție, numărul mediu de perfuzii de nicotină a fost examinat pentru ultimele trei sesiuni, un moment în care subiecții au afișat răspunsuri mai consistente pentru nicotină (Figura 3C). Grupurile nu au diferit semnificativ în ceea ce privește numărul mediu de perfuzii cu nicotină (P > .05). Ulterior, șoarecii au fost trecuți la o doză de 0,1 mg/kg/perfuzie de nicotină, care sa dovedit anterior a fi preferată la șoarecii adulți C57BL6/J.44 La această doză, șoarecii NIC-Sired și-au auto-administrat un număr mai mic de perfuzii (t{ {7}}.20, P < .05;="" figura="" 3d).="" pentru="" incubarea="" comportamentului="" de="" poftă,="" care="" este="" considerată="" o="" măsură="" a="" căutării="" crescute="" de="" droguri="" în="" timpul="" abstinenței,="" un="" anova="" cu="" design="" mixt="" în="" 2="" căi="" cu="" tratament="" de="" sesiune="" și="" tare="" a="" identificat="" efectul="" principal="" al="" sesiunii="" (f(1,17)="" {{16}="" }.90,="" p="">< .001).="" în="" timp="" ce="" animalele="" sal-sired="" au="" prezentat="" un="" efect="" de="" incubare="" cu="" răspunsuri="" mai="" mari="" în="" ziua="" 21="" de="" abstinență="" în="" comparație="" cu="" ziua="" 1,="" șoarecii="" nic-sired="" nu="" au="" prezentat="" o="" creștere="" a="" comportamentului="" de="" căutare="" a="" nicotinei="" (p=""><>

3.5 Expunerea paternă la nicotină modifică legarea colinergică și funcția hipocampului

Legarea nAChR heteromerică hipocampală cu afinitate înaltă a fost reglată la șoarecii F1 NIC-Sired (t28=2.14, P < .05;="" sal-sired="1.21" ±="" {{10}="" }.043,="" nic‐sired="1.34" ±="" 0.044).="" un="" subiect="" (nic-sired)="" a="" fost="" eliminat="" deoarece="" valorile="" de="" legare="" au="" fost="" cu="" două="" abateri="" standard="" peste="">

Înregistrările amperometrice ale curenților ACh evocați de potasiu și nicotină au fost evaluate în F1 dHPC și vHPC. Din cauza dimensiunilor inegale ale eșantionului pe sex, sexul nu a fost inclus ca factor preliminar în aceste analize. Semnalele colinergice evocate de depolarizare KCl nu au diferit între șoarecii SAL și NIC-Sired în dHPC (P > .05; Figura 4A); cu toate acestea, aplicarea locală de nicotină a dus la o reducere semnificativă a amplitudinilor semnalului colinergic la șoarecii NIC-Sired (t8=2.33, P <.05; figura="" 4c).="" în="" vhpc,="" eliberarea="" de="" ach="" a="" fost="" scăzută="" la="" șoarecii="" nic-sred="" după="" aplicarea="" kcl="" (t8="2.60," p="">< .05;="" figura="" 4b)="" sau="" nicotină="" (t{8="2.98," p="">< .05).="" figura="">

FIGURA 4 Nicotina paternă reduce semnalizarea colinergică în hipocamp. Semnale de colină a populației dHPC evocate de depolarizarea terminală indusă de KCl. Nu au fost detectate diferențe semnificative între animalele NIC și SAL (n=5 per grup). B, semnalele de colină a populației vHPC evocate de depolarizarea terminală indusă de KCl au fost reduse la șoarecii NIC-Sired. C, Semnalele de colină dHPC ale populației evocate de nicotină au fost reduse la șoarecii NIC-Sired. D, Semnalele de colină vHPC ale populației evocate de nicotină au fost reduse la șoarecii NIC-Sired. Nu au fost observate efecte ale sexului asupra semnalizării colinergice. Barele de eroare indică eroarea standard a mediei (SEM), *P <>

3.6 Expunerea paternă la nicotină modifică diferențial expresia genei hipocampului dorsal și ventral

Analiza transcriptomului hipocampal F1 prin secvențierea ARN a dezvăluit 952 de gene exprimate diferențial în vHPC (FDR=0.05; Tabelul S2). Dintre aceste gene, 612 au fost reglate în jos și 340 au fost reglate în sus la șoarecii NIC-Sired. În dHPC, doar 162 de gene au fost exprimate diferențial la șoarecii NIC-Sired în comparație cu șoarecii SAL-Sired (FDR=0.05). Dintre aceste 162 de gene, 86 au fost reglate în jos și 76 au fost reglate în sus. O sută trei gene cu expresia genică modificată s-au suprapus între vHPC și dHPC.

3.7 Expunerea paternă la nicotină modifică căile transcripționale implicate în dezvoltarea sistemului nervos

În vHPC, analiza IPA a identificat rețeaua de top „Boala neurologică, leziuni și anomalii ale organismului, moartea celulelor și supraviețuirea” (scor=41, Tabelul S3) și a doua rețea de top „Dezvoltarea și funcționarea sistemului nervos, morfologia țesuturilor, neurologice”. Boală” (scor=23). Primele cinci categorii de funcții moleculare și celulare au fost: „Morfologie celulară” (88 de molecule), „Asamblare și organizare celulară” (79 de molecule), „Dezvoltare celulară” (96 de molecule), „Funcție și întreținere celulară” (79 de molecule), și „Creștere și proliferare celulară” (87 de molecule). Principalele dezvoltări și funcții ale sistemului fiziologic au fost „Dezvoltarea și funcționarea sistemului nervos” (175 de molecule), iar unele dintre funcțiile de top pentru boli și tulburări includ „Boala neurologică” (a doua, 191 molecule) și „Tulburări psihologice” (a patra, 90 de molecule). ) (Tabelul S4).

În plus față de rezultatele IPA, analiza de îmbogățire folosind Enrichr a oferit dovezi suplimentare pentru modificări ale creșterii și dezvoltării celulare în vHPC, cu termeni biologici de top GO, inclusiv „splicing ARN”, „răspuns la proteina desfășurată” și „reglarea creșterii celulare” și „ stabilizarea proteinelor” (Tabelul S5). În mod corespunzător, „complexul spliceosomal” a fost identificat ca un termen celular GO de top. Analiza căii KEGG prin Enrichr a indicat în plus funcționarea spliceosomului și semnalizarea MAPK ca căi potențial afectate.

În ciuda unei liste considerabil mai scurte de gene exprimate diferențial în dHPC în comparație cu vHPC, au fost identificate căi și termeni similari îmbogățiți cu dHPC (Tabelele S3 și S4). Analiza IPA a identificat rețeaua de top „Comportament, boli neurologice, leziuni și anomalii ale organismului” (scor=24) și a doua rețea de top „Boala neurologică, leziuni și anomalii ale organismului și tulburări psihologice (scor=20) .

Primele cinci categorii de funcții moleculare și celulare din dHPC au fost „Dezvoltarea celulară” (29 de molecule), „Creșterea și proliferarea celulară” (29 de molecule), „Morfologia celulară” (27 de molecule), „Asamblarea și organizarea celulară” (23 de molecule) și „Funcție și întreținere celulară” (25 de molecule). „Dezvoltarea și funcționarea sistemului nervos” a fost din nou identificată ca un termen de top îmbogățit în cadrul clasificării pentru dezvoltarea și funcționarea sistemului fiziologic (a doua, 44 de molecule). Termenii de top îmbogățiți din clasificarea funcției Boli și tulburări au inclus „Boala neurologică” (în primul rând, 51 de molecule) și „Tulburări psihologice” (a cincea, 31 de molecule). Analiza de îmbogățire folosind Enrichr a identificat mai mulți termeni biologici GO diferiți pentru dHPC în comparație cu vHPC, inclusiv „reglarea morții neuronilor” și „dezvoltarea creierului” (Tabelul S5), care este complementară cu funcția moleculară și celulară IPA „Moartea și supraviețuirea celulelor”.

Pentru a explora în continuare rolul funcțional al transcrierilor exprimate diferențial care se suprapun între dHPC și vHPC, au fost evaluate genele exprimate diferențial comune ambelor regiuni (103 în total). Transcrierile suprapuse exprimate diferențial între cele două regiuni au fost toate reglate în jos sau în creștere în aceeași direcție, ceea ce sugerează modificări comune ale căilor transcripționale în regiunile creierului la șoarecii NIC. Primele cinci categorii de funcții moleculare și celulare identificate de IPA au fost „Moartea și supraviețuirea celulelor” (17 molecule), „Mișcarea celulară” (10 molecule), „Semnalarea și interacțiunea celulă la celulă” (17 molecule), „Creșterea celulară”. și proliferare” (18 molecule) și „Morfologie celulară” (17 molecule) (Tabelul S4)

Genele exprimate diferențial unice pentru dHPC și vHPC au fost ulterior analizate separat în IPA pentru a testa adaptările neurobiologice divergente între cele două regiuni (Tabelul S6). Nu se suprapune căi canonice îmbogățite între analizele unice dHPC vHPC unice. Principalele căi canonice îmbogățite unice pentru vHPC (44 în total) au inclus „semnalizarea calciului” și „semnalizarea receptorilor glucocorticoizi”, în timp ce căile canonice de top dHPC (opt în total) au inclus „metabolismul hormonului tiroidian” și „semnalizarea apoptozei mediată de acid retinoic”. Bolile și funcțiile îmbogățite unice pentru vHPC (295 în total) au inclus „Formarea [Hippocampus] Cornului lui Ammon” și „Cantitatea de proeminențe celulare”, în timp ce termenii de boli și funcții îmbogățite în mod unic cu dHPC (111 în total) au inclus „Inflamația substanței albe” și „Demielinizare”. ."

3.8 Expunerea paternă la nicotină modifică metilarea ADN-ului hipocamp

A fost efectuată o analiză țintită a metilării ADN-ului pentru a determina dacă metilarea ADN-ului modificată în regiunile de reglementare corespunzătoare a explicat expresia diferențială a genei la descendenții F1 NIC-Sired. Țintele au inclus 1114 gene exprimate diferențial identificate fie în dHPC, fie în vHPC. În vHPC, au fost detectate 11 regiuni metilate diferențiat (DMR), opt prezentând o metilare crescută și trei prezentând o metilare scăzută (Tabelul 1). Dintre cele 11 DMR, 10 au fost localizate în regiuni asociate cu o genă care a prezentat expresie alterată în vHPC. În dHPC, au fost detectate 30 de DMR, 15 prezentând o metilare crescută și 15 prezentând o metilare scăzută. Dintre cele 30 de DMR, 29 au fost localizate în regiuni asociate cu o genă care a prezentat o expresie alterată în dHPC.

Benefit de cistanche echinacoside

4. DISCUTIE

Înțelegerea sporită a proceselor epigenetice împreună cu datele recente, inclusiv descoperirile prezente, a provocat înțelegerea tradițională a moștenirii. Factorii dincolo de genotip singuri pot determina fenotipurile în generațiile ulterioare, iar expunerile din cadrul unei generații pot să nu fie sechestrate de descendență. Studiul de față sugerează că efectele dăunătoare asupra sănătății ale expunerii la nicotină pot transcende expunerea individuală și pot afecta generațiile ulterioare. Am identificat efecte multigeneraționale și transgeneraționale ale expunerii paterne preconcepționale la nicotină la șoarecii C57BL/6J asupra condiționării fricii pavloviane, rezultând amintiri de frică mai puternice la descendenții F1 și F2. Expunerea paternă la nicotină a dus, de asemenea, la o scădere a autoadministrarii de nicotină și la atenuarea comportamentelor legate de recădere, sugerând un răspuns aversiv mai mare la nicotină. În sprijinul acestor diferențe de comportament, au fost observate modificări multigeneraționale ale funcției colinergice hipocampului și ale proceselor epigenetice. Împreună, aceste rezultate indică modificări ale funcției sistemului nervos la descendenții șoarecilor expuși la nicotină, care au ca rezultat modificarea fenotipurilor comportamentale.

Puii F1 și F2 ai șoarecilor masculi expuși la nicotină au prezentat o condiționare contextuală îmbunătățită și stimulată de frică. În ciuda faptului că nu există diferențe în stingerea fricii contextuale între șoarecii F1 NIC- și SAL-Sired, șoarecii NIC-Sired au arătat o recuperare spontană îmbunătățită a amintirilor fricii contextuale. Este important că nu s-au găsit diferențe în sensibilitatea la șoc între șoarecii NIC- și SAL-Sired care ar putea explica o condiționare crescută a fricii. Condiționarea îmbunătățită a fricii poate sugera îmbunătățirea generalizată a proceselor de învățare, spre deosebire de modularea proceselor mai specifice fricii de a învăța. Cu toate acestea, nu s-au observat modificări în recunoașterea obiectelor noi, antrenamentul alimentar operant sau locomoția în câmp deschis la șoarecii NIC-Sired, deși a fost identificat un efect specific sexului al creșterii timpului de braț deschis EPM la șoarecii femele NIC-Sired. Deși acest lucru nu exclude potențialele modificări ale altor sisteme de învățare sau procese cognitive, aceste descoperiri împreună sugerează că învățarea fricii poate fi mai sensibilă la efectele multigeneraționale și transgeneraționale ale expunerii paterne la nicotină. Mai mult, aceste descoperiri sugerează o funcție colinergică alterată la animalele NIC-Sired. Nicotina modulează condiționarea fricii contextuale. În timp ce nicotina acută îmbunătățește condiționarea fricii contextuale,15,45 retragerea de la nicotină cronică perturbă condiționarea fricii contextuale.16,21 În studiul de față, nicotina acută a îmbunătățit condiționarea fricii contextuale la șoarecii F1 și F2 de la șoarecii tratați cu soluție salină. În schimb, nicotina acută a perturbat condiționarea fricii contextuale la șoarecii NIC-Sired și nu a avut niciun efect la șoarecii NIC-bunici, ceea ce poate indica o funcționare colinergică alterată în hipocamp.

Efectele expunerii paterne la nicotină asupra autoadministrarii ulterioare de nicotină în generația F1 indică, de asemenea, perturbarea funcției colinergice. În timpul achiziției de autoadministrare IV de nicotină la doza mai mică, grupurile nu au diferit în ceea ce privește numărul de perfuzii de nicotină, deși o creștere a numărului de presări active cu pârghie a fost găsită în grupul NIC-Sired. Acest lucru sugerează că șoarecii NIC-Sired ar putea să fi manifestat perseverență în a răspunde pentru recompensa alimentară și/sau o flexibilitate cognitivă scăzută în tranziția răspunsului de la hrană la medicament. Cu toate acestea, merită de notat că grupurile nu au fost diferite în ziua 1 de incubare a poftei, care reprezintă o sesiune de extincție (de exemplu, fără perfuzii de nicotină în timpul sesiunii) și, prin urmare, acest efect pare să fi fost prezent atunci când întăritorii sunt comutat dar nu în lipsa unui întăritor în timpul unei sesiuni de stingere. Șoarecii NIC-Sired au prezentat, de asemenea, o scădere a auto-administrarii de nicotină la doza moderată, ceea ce se aliniază cu cercetările recente care identifică scăderi ale administrării de alcool, cocaină și opioide asociate cu expunerea parentală la alcool, cocaină și morfină (de exemplu, Vassoler și colab.,46 ca revizuită în Goldberg şi Gould47). Reducerea observată a autoadministrarii de nicotină poate fi atribuită fie unei sensibilități scăzute la efectele recompensatoare ale nicotinei și/sau sensibilității crescute la efectele aversive ale nicotinei. Într-adevăr, grupurile au fost diferite la doza moderată de nicotină, dar nu la doza mai mică de nicotină, ceea ce susține noțiunea unui răspuns aversiv crescut cu doza mai mare. Interesant, am găsit, de asemenea, o lipsă de incubare a poftei în ziua 21 la șoarecii NIC-Sired după auto-administrare la doza moderată, sugerând că scăderea comportamentelor de căutare a nicotinei ar putea fi legată de o memorie asociată aversiunii pentru nicotină. Deși diferite substraturi neuronale pot sta la baza acestor efecte asupra aportului de nicotină și a răspunsului legat de recidivă, un studiu recent a constatat că scăderea metiltransferazei ADN în regiunea hipocampală CA1 a redus autoadministrarea morfinei.48 Această constatare, împreună cu funcția cunoscută a funcției hipocampului colinergic în procesele de învățare și memorie, susține în continuare noțiunea de procesare întreruptă mediată de nicotină în hipocampul șoarecilor NIC-Sired.

În acest sens, șoarecii NIC-Sired au prezentat o legare crescută a nAChR cu afinitate mare la hipocamp. Am găsit, de asemenea, reduceri ale eliberării ACh evocată de potasiu în vHPC, precum și ale eliberării ACh evocată de nicotină atât la dHPC, cât și la vHPC la animalele NIC-Sired. Modificările în eliberarea ACh evocată de depolarizare reflectă funcția colinergică alterată în aval de legarea receptorului, în timp ce modificările eliberării ACh evocată de nicotină reflectă funcția nAChR modificată. Aceste date sunt în concordanță cu constatările anterioare ale legării nAChR cu afinitate înaltă reglată în urma scăderii funcției nAChR.49 Deoarece atât eliberarea ACh evocată de potasiu, cât și evocată de nicotină au fost modificate în vHPC la șoarecii NIC-Sired, vHPC poate fi mai sensibil la efectele multigeneraționale ale expunerii paterne la nicotină. Se știe că DHPC modulează condiționarea fricii contextuale.31,50 Inhibarea vHPC perturbă atât condiția de frică, cât și cea contextuală51,52, iar leziunile colinergice vHPC afectează condiționarea fricii.53

Cistanche cu ierburi

Am arătat, de asemenea, că infuzia directă de nicotină în dHPC îmbunătățește condiționarea fricii contextuale, în timp ce infuzia în vHPC perturbă condiționarea fricii contextuale. 54 În timp ce alte regiuni ale creierului implicate în condiționarea fricii, cum ar fi amigdala,55 pot fi, de asemenea, afectate de expunerea paternă la nicotină, aceste constatări împreună cu datele prezente sugerează că schimbările în funcția vHPC pot fi responsabile pentru condiționarea fricii modificată la șoarecii NIC-Sired. . Am emis ipoteza că efectele multigeneraționale ale expunerii paterne la nicotină pot fi legate de modificări ale efectorilor transcripționali care acționează în amonte de aceste sisteme neuronale. Secvențierea transcripțională la nivel de genom în vHPC și dHPC a șoarecilor din generația F1 a identificat 1114 gene exprimate diferențial între șoarecii NIC și SAL. Această diferență a fost mai mare în vHPC (952) față de dHPC (162), în conformitate cu schimbarea mai mare a vHPC în raport cu funcția colinergică dHPC și modificări ale condiționării fricii atât contextuale, cât și induse. Analiza ulterioară a căilor a sugerat modificări ample ale căilor transcripționale asociate cu semnalizarea glucocorticoizilor și dezvoltarea/plasticitatea neuronală în ambele regiuni hipocampale.

Pentru a identifica potențialele adaptări specifice vHPC, analiza căii a fost efectuată folosind numai transcrieri specifice fiecărei subregiuni hipocampice. Nicio cale canonică IPA îmbogățită nu s-a suprapus între vHPC și dHPC, care sunt subregiuni distincte din punct de vedere funcțional ale hipocampului.31 Când genele care s-au suprapus între dHPC și vHPC au fost îndepărtate, căile canonice de top îmbogățite unice pentru vHPC au inclus „semnalarea receptorilor glucocorticoizi”, sugerând o unică. , modificare suplimentară a funcționării glucocorticoizilor în această regiune în comparație cu dHPC. Cu scopul de a identifica regulatorii epigenetici din amonte care pot acționa asupra expresiei genelor, am efectuat secvențierea metilării ADN-ului țintit folosind lista compilată de gene exprimate diferențial dHPC și vHPC identificate din secvențierea ARN. În mod surprinzător, am găsit doar 11 DMR în vHPC și 30 DMR în dHPC între animalele NIC- și SAL-Sired. Deși acest lucru este neașteptat, având în vedere numărul mult mai mare de transcrieri exprimate diferențial în vHPC, metilarea ADN-ului este doar unul dintre câțiva factori de reglementare care pot avea un impact asupra expresiei genelor, iar metilarea ADN-ului nu se traduce în mod constant în expresia genică modificată.56 Din cele 11 DMR vHPC, șapte au prezentat modele de metilare în concordanță cu direcția transcripției diferențiale (transcripție scăzută cu metilare crescută a ADN și transcripție crescută cu metilare redusă). Genele metilate diferențiat în vHPC au inclus Fkbp5, Ksr1 și Pnpla2. În mod interesant, transcripția Fkbp5 și Ksr1 au fost perturbate într-un model comportamental de șoarece de PTSD,57 în care șoarecii au fost expuși la un șoc electric și apoi au prezentat memento-uri situaționale. Fkbp5 codifică un însoțitor al receptorului de glucocorticoizi a cărui funcționare a fost asociată cu un răspuns dezadaptativ la stres prelungit la persoanele cu PTSD și alte tulburări de anxietate.58

Mai exact, studiile pe oameni arată că metilarea și transcripția Fkbp5 se corelează cu severitatea simptomelor PTSD, astfel încât metilarea crescută și scăderea transcripției prezic simptome mai severe PTSD.59,60 Expresia Fkbp5 modulează funcționarea axei HPA, despre care se crede că mediază implicarea sa în PTSD.59,61 Descoperirea noastră privind recuperarea spontană îmbunătățită a memoriei fricii în combinație cu dereglarea căilor transcripționale asociate cu semnalizarea glucocorticoizilor la animalele NIC-Sred poate indica o vulnerabilitate crescută la fenotipurile asemănătoare PTSD. În dHPC, modelele DMR au fost în mare parte inconsecvente cu direcția exprimării diferențiale a transcripției găsite prin secvențierea ARN, ceea ce sugerează că modificările metilării ADN vHPC produse de expunerea paternă la nicotină sunt mai semnificative în ceea ce privește impactul expresiei genelor decât cele din dHPC. Acest lucru este în concordanță cu identificarea noastră a unui număr mai mare de transcrieri exprimate diferențial și a modificărilor mai exagerate ale transmiterii colinergice în vHPC NIC-Sired comparativ cu dHPC. Abordarea noastră de secvențiere țintită poate să fi limitat capacitatea de a detecta potențiala reglare transcripțională prin secvențe metilate distal. Investigațiile viitoare, inclusiv analiza metilării ADN-ului la nivelul genomului, modificările histonelor și expresia ARN-ului mic, vor oferi o interpretare mai completă a acestor constatări.

O limitare potențială a designului nostru de expunere la nicotină este concentrarea pe expunerea paternă la nicotină pentru a investiga impactul multigenerațional și transgenerațional al expunerii la nicotină. Deși alte studii care au găsit fenotipuri multi/transgeneraționale în urma expunerii paterne la droguri, inclusiv cocaina46 și morfina62, nu au găsit diferențe în îngrijirea maternă, este posibil ca expunerea paternă la nicotină să aibă un impact asupra îngrijirii materne. Studiile viitoare care investighează impactul asupra îngrijirii materne sunt justificate. Întrucât atenția noastră actuală era pe expunerea paternă, munca viitoare ar trebui să compare și impactul expunerii paterne față de cea maternă. În general, prezentele descoperiri oferă o nouă înțelegere a efectelor multigeneraționale și transgeneraționale ale expunerii la nicotină, care sunt susținute de o literatură în creștere care caracterizează efectele multigeneraționale și transgeneraționale ale expunerii la medicamente (așa cum a fost revizuit în Goldberg și Gould47). Acest studiu a fost primul care a testat condiționarea contextuală a fricii la descendenții F1 și F2 ai bărbaților expuși la nicotină și a identificat formarea îmbunătățită a memoriei fricii și recuperarea spontană a amintirilor fricii. Acest studiu a fost, de asemenea, primul care a identificat autoadministrarea alterată a nicotinei și incubarea poftei la descendenții expuși la nicotină F1.

Metilarea diferențială în genele asociate cu PTSD și dereglarea axei HPA, precum și întreruperi concomitente în căile transcripționale legate de stres au fost găsite la șoarecii NIC-Sired. Nicotina paternă a fost, de asemenea, asociată cu scăderea funcției colinergice a hipocampului și cu creșterea legării nAChR din hipocamp. În mod interesant, pacienții cu PTSD care nu fumau prezintă o legare semnificativ mai mare a nAChR corticale meziotemporale cu afinitate înaltă63, iar PTSD este asociat cu o condiționare mai mare a fricii și cu recuperarea spontană a amintirilor de frică stinse.64 Împreună, descoperirile noastre sugerează că expunerea la nicotină poate avea un impact multigenerațional asupra creșterea susceptibilității descendenților la simptome asemănătoare PTSD. Această constatare, împreună cu alte descoperiri recente care arată efectele multi-generaționale ale expunerii la nicotină asupra flexibilității cognitive2 sugerează că rezultatele negative asupra sănătății ale expunerii la nicotină aruncă o rețea mai largă decât se credea anterior.

Extract de Cistanche

REFERINȚE

1 Dai J, Wang Z, Xu W, et al. Expunerea paternă la nicotină definește un comportament diferit în generația ulterioară prin hipermetilarea mmu-miR-15b. Sci Rep. 2017;7(1):7286.

2. McCarthy DM, Morgan TJ Jr, Lowe SE, et al. Expunerea la nicotină a șoarecilor masculi produce tulburări de comportament în mai multe generații de descendenți. PLoS Biol. 2018;16(10):e2006497.

3. Zhu J, Lee KP, Spencer TJ, Biederman J, Bhide PG. Transmiterea transgenerațională a hiperactivității într-un model de șoarece de ADHD. J Neurosci. 2014;34(8):2768‐2773.

4. Cummings KM, Proctor RN. Schimbarea imaginii publice a fumatului în Statele Unite: 1964-2014. Biomarkeri de epidemiol de cancer Prev. 2014;23(1):32‐36.

5. Huang LL, Kowitt SD, Sutfin EL, Patel T, Ranney LM, Goldstein AO. Utilizarea țigărilor electronice în rândul elevilor de liceu și asocierea acesteia cu consumul de țigări și renunțarea la fumat, North Carolina Youth Tobacco Surveys, 2011 și 2013. Prev Chronic Dis. 2016;13:E103.

6. Holliday ED, Nucero P, Kutlu MG, et al. Efectele pe termen lung ale nicotinei cronice asupra comportamentelor emoționale și cognitive și morfologiei celulelor hipocampului la șoareci: comparații ale expunerii la nicotină la adulți și adolescenți. Eur J Neurosci. 2016;44:2818‐2828.

7. Johnson JG, Cohen P, Pine DS, Klein DF, Kasen S, Brook JS. Asocierea dintre fumatul de țigară și tulburările de anxietate în timpul adolescenței și la vârsta adultă timpurie. JAMA. 2000;284:2348-2351.

8. Jung Y, Hsieh LS, Lee AM și colab. Un mecanism epigenetic mediază efectele de dezvoltare ale nicotinei asupra structurii și comportamentului neuronal. Nat Neurosci. 2016;19(7):905‐914.

9. Gitik M, Holliday ED, Leung M, et al. Colina ameliorează deficitele de învățare a adulților și inversează modificarea epigenetică a factorilor de remodelare a cromatinei legate de expunerea adolescenților la nicotină. Neurobiol Learn Mem. 2018;155:239‐248.

10. Pasărea A. Percepţiile epigeneticii. Natură. 2007;447:396‐398.

11. Skinner MK. Moștenirea transgenerațională epigenetică de mediu și stabilitatea mitotică epigenetică somatică. Epigenetica. 2011;6:838‐842.

12. Davis JA, Gould TJ. Învățare asociativă, hipocampul și dependența de nicotină. Curr Drug Abuse Rev. 2008;1:9‐19.

13. Kutlu MG, Parikh V, Gould TJ. Dependența de nicotină și tulburări psihice. Int Rev Neurobiol. 2015;124:171‐208.

14. Parikh V, Kutlu MG, Gould TJ. Disfuncția nAChR ca substrat comun pentru schizofrenie și dependența comorbidă de nicotină: tendințe și perspective actuale. Schizophr Res. 2016;171:1‐15.

15. Kenney JW, Raybuck JD, Gould TJ. Receptorii nicotinici din hipocampul dorsal și ventral modulează diferențial condiționarea fricii contextuale. Hipocampul. 2012;22:1681‐1690.

16. Wilkinson DS, Turner JR, Blendy JA, Gould TJ. Contextul genetic influențează efectele retragerii de la nicotină cronică asupra învățării și legării receptorului de acetilcolină nicotinic de mare afinitate în hipocampul dorsal și ventral. Psihofarmacologie (Berl). 2013;225(1): 201‐208.

17. Davis JA, Gould TJ. Efectele DHBE și MLA asupra îmbunătățirii induse de nicotină a condiționării fricii contextuale la șoarecii C57BL/6. Psihofarmacologie (Berl). 2006;184:345‐352.

18. Kutlu MG, Zeid D, Tumolo JM, Gould TJ. Șoarecii preadolescenti și adolescenți sunt mai puțin sensibili la efectele nicotinei acute asupra dispariției și recuperării spontane. Brain Res Bull. 2018;138:50‐55.

19. Kutlu MG, Gould TJ. Nicotina acută întârzie stingerea fricii contextuale la șoareci. Behav Brain Res. 2014;263:133‐137.

20. Benowitz NL, Hukkanen J, Jacob P 3rd. Chimia, metabolismul, cinetica și biomarkerii nicotinei. În: Psihofarmacologia nicotinei. Berlin, Heidelberg: Springer; 2009:29-60.

21. Davis JA, James JR, Siegel SJ, Gould TJ. Retragerea de la administrarea cronică de nicotină afectează condiționarea fricii contextuale la șoarecii C57BL/6. J Neurosci. 2005;25:8708‐8713.

22. Petersen DR, Norris KJ, Thompson JA. Un studiu comparativ al dispoziției nicotinei și metaboliților săi la trei tulpini consangvinizate de șoareci. Drug Metab Dispos. 1984;12:725‐731.

23. Gould TJ, Portugalia GS, Andre JM, et al. Durata deficitelor asociate sevrajului de nicotină în condiționarea fricii contextuale este paralelă cu modificările reglării pozitive a receptorului nicotinic de acetilcolină cu afinitate ridicată a hipocampului. Neurofarmacologie. 2012;62:2118‐2125.

24. Kutlu MG, Oliver C, Huang P, Liu‐Chen LY, Gould TJ. Deteriorarea dispariției fricii contextuale de către nicotină cronică și retragerea de la nicotină cronică este asociată cu reglarea nAChR a hipocampului. Neurofarmacologie. 2016;109:341‐348. 25. Damaj MI, Kao W, Martin BR. Caracterizarea retragerii spontane și precipitate de nicotină la șoarece. J Pharmacol Exp Ther. 2003;307:526-534.

26. Fowler CD, Lu Q, Johnson PM, Marks MJ, Kenny PJ. Semnalizarea subunității receptorului nicotinic alfa5 habenular controlează aportul de nicotină. Natură. 2011;471:597‐601.

27. Lomazzo E, MacArthur L, Yasuda RP, Wolfe BB, Kellar KJ. Analiza cantitativă a receptorilor nicotinici neuronali heteromeri din hipocampul șobolanului. J Neurochem. 2010;115:625‐634.

28. Turner JR, Castellano LM, Blendy JA. Efecte paralele asemănătoare anxioliticului și reglarea în sus a receptorilor neuronali de acetilcolină nicotinici în urma nicotinei și vareniclinei cronice. Nicotina Tob Res. 2011;13:41‐46.

29. Parikh V, Ji J, Decker MW, Starter M. Receptorii prefrontali care conțin subunitatea beta2 și receptorii nicotinici de acetilcolină alfa7 controlează diferențial semnalizarea glutamatergică și colinergică. J Neurosci. 2010;30: 3518‐3530.

30. Parikh V, Starter M. Sisteme colinergice și cogniție ale creierului anterior: noi perspective bazate pe detectarea rapidă a vârfurilor de colină folosind biosenzori pe bază de enzime. În: Biosenzori cu microelectrozi. Totowa, NJ: Humana Press; 2013:257‐277.

31. Fanselow MS, Dong HW. Hipocampul dorsal și ventral sunt structuri distincte din punct de vedere funcțional? Neuron. 2010;65(1):7‐19.

32. Kim D, Pertea G, Trapnell C, Pimentel H, Kelley R, Salzberg SL. TopHat2: alinierea precisă a transcriptomilor în prezența inserțiilor, delețiilor și fuziunilor de gene. Genom Biol. 2013;14(4): R36.

33. Afgan E, Baker D, van den Beek M, et al. Platforma Galaxy pentru analize biomedicale accesibile, reproductibile și colaborative: actualizare 2016. Acizi nucleici Res. 2016;44:W3‐w10.

34. Trapnell C, Williams BA, Pertea G, et al. Asamblarea transcrierilor și cuantificarea prin ARN-Seq dezvăluie transcrieri neadnotate și schimbarea izoformelor în timpul diferențierii celulare. Nat Biotechnol. 2010;28(5): 511‐515.

35. Benjamini Y, Drai D, Elmer G, Kafkafi N, Golani I. Controlling the false discovery rate in behavior genetics research. Behav Brain Res. 2001; 125(1-2):279-284.

36. Kramer A, Green J, Pollard J Jr, Tugendreich S. Abordări ale analizei cauzale în Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatica. 2014;30(4): 523‐530.

37. Kuleshov MV, Jones MR, Rouillard AD, et al. Enrichr: un server web cuprinzător de analiză a îmbogățirii setului de gene, actualizare 2016. Acizi nucleici Res. 2016;44(W1): W90‐W97.

38. Wendt J, Rosenbaum H, Richmond TA, Jeddeloh JA, Burgess DL. Secvențierea țintită a bisulfiților folosind sistemul de îmbogățire epidemiologică SeqCap. Metode Mol Biol. 2018;1708:383‐405.

39. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: un trimmer flexibil pentru datele secvenței Illumina. Bioinformatica. 2014;30(15):2114‐2120.

40. Langmead B, Salzberg SL. Aliniere rapidă cu citire întreruptă cu Papionul 2. Metode Nat. 2012;9(4):357‐359.

41. Krueger F, Andrews SR. Bismark: un alinier flexibil și apelant de metilare pentru aplicațiile Bisulfite-Seq. Bioinformatica. 2011;27(11):1571‐1572.

42. Akalin A, Kormaksson M, Li S, et al. methylKit: un pachet R cuprinzător pentru analiza profilurilor de metilare a ADN-ului la nivelul întregului genom. Genom Biol. 2012;13(10): R87.

43. Gould TJ, Lommock JA. Nicotina îmbunătățește condiționarea fricii contextuale și ameliorează deficitele induse de etanol în condiționarea fricii contextuale. Behav Neurosci. 2003;117(6):1276‐1282.

44. Fowler CD, Kenny PJ. Autoadministrarea intravenoasă a nicotinei și restabilirea indusă de indicii la șoareci: efectele dozei de nicotină, rata de perfuzie a medicamentului și pregătirea instrumentală anterioară. Neurofarmacologie. 2011;61(4):687‐698.

45. Gould TJ, Wehner JM. Creșterea nicotinei a condiționării fricii contextuale. Behav Brain Res. 1999;102(1-2):31-39.

46. ​​Vassoler FM, White SL, Schmidt HD, Sadri‐Vakili G, Pierce RC. Moștenirea epigenetică a unui fenotip de rezistență la cocaină. Nat Neurosci. 2013;16(1):42‐47.

47. Goldberg LR, Gould TJ. Efectele multigeneraționale și transgeneraționale ale expunerii paterne la droguri de abuz asupra funcției comportamentale și neuronale. Eur J Neurosci. 2018;50(3):2453‐2466.

48. Zhang JJ, Jiang FZ, Zheng W, și colab. DNMT3a din hipocampul CA1 este crucial în achiziția de autoadministrare a morfinei la șobolani. Dependent Biol. 2019;▪:▪‐▪.

49. Schwartz RD, Kellar KJ. Locurile de legare la receptorii colinergici nicotinici în creier: reglare in vivo. Ştiinţă. 1983;220(4593):214‐216.

50. Logue SF, Paylor R, Wehner JM. Leziunile hipocampului cauzează deficite de învățare la șoarecii consangvini din labirintul de apă Morris și sarcina de frică condiționată. Behav Neurosci. 1997;111(1):104‐113.

51. Zhang WN, Bast T, Feldon J. Hipocampul ventral și condiționarea fricii la șobolani: diferite amnezii anterograde ale fricii după perfuzia de N-metil-D-aspartat sau antagonistul său necompetitiv MK-801 în hipocampul ventral. Behav Brain Res. 2001;126(1-2):159-174.

52. Maren S, Holt WG. Condiționarea hipocampului și a fricii pavloviane la șobolani: infuziile de muscimol în hipocampul ventral, dar nu dorsal, afectează dobândirea înghețului condiționat la un stimul auditiv condiționat. Behav Neurosci. 2004;118(1):97‐110.

53. Staib JM, Della Valle R, Knox DK. Perturbarea septului medial și a benzilor diagonale ale proiecțiilor colinergice Broca către hipocampul ventral perturbă memoria fricii auditive. Neurobiol Learn Mem. 2018;152:71‐79.

54. Vasquez JH, Leong KC, Gagliardi CM, Harland B, Apicella AJ, Muzzio IA. Activarea specifică căii a celulelor hipocampale ventrale care se proiectează către cortexul prelimbic diminuează reînnoirea fricii. Neurobiol Learn Mem. 2019;161:63-71.

55. LeDoux JE, Cicchetti P, Xagoraris A, Romanski LM. Nucleul amigdaloid lateral: interfața senzorială a amigdalei în condiționarea fricii. J Neurosci. 1990;10(4):1062‐1069.

56. Jones PA. Funcțiile metilării ADN-ului: insule, locuri de pornire, corpuri de gene și nu numai. Nat Rev Genet. 2012;13(7):484‐492.

57. Tanaka M, Li H, Zhang X și colab. Reglarea genelor dependentă de regiune și timp în amigdala și cortexul cingulat anterior al unui model de șoarece asemănător PTSD. Mol Brain. 2019;12(1):25.

58. Liant EB. Rolul FKBP5, un co-chaperon al receptorului de glucocorticoizi în patogeneza și terapia tulburărilor afective și de anxietate. Psihoneuroendocrinologie. 2009;34(Supliment 1): S186‐S195.

59. Sarapis C, Cai G, Bierer LM, et al. Markeri genetici pentru riscul și rezistența PTSD în rândul supraviețuitorilor atacurilor World Trade Center. Dis Markers. 2011;30(2‐3):101‐110.

60. Yehuda R, Daskalakis NP, Desarnaud F, et al. Biomarkeri epigenetici ca predictori și corelați ai îmbunătățirii simptomelor în urma psihoterapiei la veteranii de luptă cu PTSD. Front Psych. 2013;4:118.

61. Yehuda R, Cai G, Grolier JA, et al. Modele de expresie genetică asociate cu tulburarea de stres posttraumatic în urma expunerii la atacurile World Trade Center. Biol Psihiatrie. 2009;66:708‐711.

62. Li CQ, Luo YW, Bi FF și colab. Dezvoltarea unui comportament asemănător anxietății prin semnalizarea hipocampului IGF-2 la descendenții expunerii parentale la morfină: efectul mediului îmbogățit. Neuropsihofarmacologie. 2014;39(12):2777‐2787.

63. Czermak C, Staley JK, Kasserman S, et al. beta2 Disponibilitatea receptorului de acetilcolină nicotinic în tulburarea de stres posttraumatic. Int J Neuropsihofarmacol. 2008;11(3):419‐424.

64. Milad MR, Pitman RK, Ellis CB, et al. Bazele neurobiologice ale eșecului de a reaminti memoria de extincție în tulburarea de stres posttraumatic. Biol Psihiatrie. 2009;66(12):1075‐1082.