Noile vaccinuri recombinate ale bolii Newcastle, bazate pe virusul Ovo, ocolesc imunitatea maternă pentru a oferi protecție completă împotriva provocării virulente timpurii Partea 1

Abstract:

Boala de Newcastle (ND) este una dintre cele mai importante boli ale păsărilor de curte. În ciuda eforturilor intense cu programele actuale de vaccinare, această boală încă apare la nivel mondial, provocând o mortalitate semnificativă chiar și în efectivele vaccinate. Acest lucru a fost parțial atribuit unei decalaje în imunitate în timpul perioadei de după ecloziune din cauza prezenței anticorpilor materni care au un impact negativ asupra replicarii vaccinurilor vii utilizate în mod obișnuit. Vaccinurile in ovo au multiple avantaje și prezintă o oportunitate de a aborda această problemă.

În prezent, utilizate în vaccinurile ovo ND sunt vaccinuri cu vector herpesvirus recombinant al curcanilor (HVT) care exprimă antigenele virusului bolii Newcastle (NDV). Deși s-au dovedit eficiente, aceste vaccinuri au unele limitări, cum ar fi imunogenitatea întârziată și incapacitatea de a administra un al doilea vaccin HVT după ecloziune. Utilizarea vaccinurilor ND vii pentru vaccinarea in-ovo nu este în prezent aplicabilă, deoarece acestea sunt asociate cu mortalitate embrionară ridicată. În acest studiu, vaccinurile experimentale recombinate cu vector NDV care conțineau o secvență antisens de interleukină aviară 4 (IL4R) și coloana vertebrală a acestora au fost administrate in ovo în doze diferite în ouă comerciale vechi de 18-o zi care posedă titruri mari de anticorpi materni. Păsările eclozate au fost provocate cu NDV virulent la vârsta de 2 săptămâni. Eliminarea vaccinului după ecloziune, supraviețuirea după provocare, eliminarea virusului provocat și răspunsurile imune umorale au fost evaluate în mai multe momente. Păsările vaccinate cu NDV recombinant (rNDV) au redus semnificativ mortalitatea după ecloziune în comparație cu vaccinul LaSota de tip sălbatic.

Toate vaccinurile rNDV au fost capabile să pătrundă în imunitatea maternă și să inducă un răspuns imun umoral precoce puternic. Mai mult, vaccinurile rNDV au protejat împotriva bolilor clinice și au scăzut semnificativ eliminarea virusului după provocarea precoce cu NDV virulentă la două săptămâni după ecloziune. Titrurile de anticorpi de inhibare a hemaglutinării post-provocare în grupurile vaccinate au rămas comparabile cu titrurile pre-provocare, sugerând capacitatea vaccinurilor studiate de a preveni replicarea eficientă a virusului provocării. Supraviețuirea după ecloziune după vaccinarea cu vaccinurile rNDV-IL4R a fost dependentă de doză, cu o creștere a supraviețuirii pe măsură ce doza a scăzut. Această supraviețuire îmbunătățită și datele dependenței de doză sugerează că vaccinurile noi atenuate in ovo pe bază de rNDV care pot pătrunde în imunitatea maternă pentru a declanșa un răspuns imun puternic încă de la 14 zile după ecloziune, rezultând o protecție ridicată sau completă împotriva provocării virulente, arată promit ca un contribuitor la controlul bolii Newcastle.

Pe lângă vaccinarea umană, oamenii pot lua și alimente și suplimente. Cistanche conține o varietate de substanțe chimice, precum polizaharide, steroizi, alcaloizi, flavonoide etc. Aceste substanțe au un rol semnificativ în reglarea sistemului imunitar. Printre acestea, polizaharidele pot favoriza activarea și proliferarea celulelor imune și pot crește imunitatea organismului; steroizii pot regla funcția celulelor imune și pot spori răspunsul imun; alcaloizii și flavonoizii pot rezista la oxidare, antiinflamatorii, antibacterieni și pot îmbunătăți și mai mult imunitatea. Prin urmare, Cistanche are un efect semnificativ de reglare imunitară și poate fi folosit ca aliment sănătos și medicament pentru îmbunătățirea imunității.

Faceți clic pe beneficiile pentru sănătate ale cistanche

1. Introducere

Boala Newcastle (ND), o boală devastatoare a păsărilor de curte, care poate atinge o mortalitate de 100% la păsările naive, este cauzată de tulpini virulente ale virusului bolii Newcastle (NDV) [1]. Această specie de virus, redenumită recent orthoavulavirus aviar 1, este un membru al familiei Paramyxoviridae [2,3]. Virușii bolii Newcastle au un genom ARN monocatenar, nesegmentat, cu sens negativ care codifică pentru cel puțin șase proteine ​​structurale (30—nucleoproteină [NP]—fosfoproteină [P]—proteina matricei [M]—proteina de fuziune [F]— hemaglutinină-neuraminidază [HN]—și ARN-polimerază mare [L]—50) și cuprinzând una dintre cele trei dimensiuni ale genomului (15,186, 15,192 și 15,198 nucleotide) [4,5]. Boala de Newcastle este considerată a treia cea mai importantă boală a păsărilor de curte la nivel mondial [6] și rămâne endemică în multe țări din Asia, Africa și America [7].

Controlul ND include biosecuritate strictă pentru a preveni introducerea NDV virulentă (vNDV) în fermele de păsări [8,9] și administrarea corectă a vaccinurilor [10]. Cu toate acestea, focarele multiple de ND care apar la nivel mondial [11] sugerează faptul că vaccinurile și procedurile de vaccinare actuale nu sunt pe deplin eficiente. În plus față de vaccinurile vii și inactivate convenționale, în ultimele două decenii au fost explorate mai multe concepte pentru vaccinarea ND, inclusiv vaccinuri vectorizate, complex antigen-anticorp, particule asemănătoare virusului și vaccinuri cu ligand receptori de tip toll-like, printre altele [1, 8,9]. Mai multe vaccinuri aviare, concepute pentru a co-exprima citokine imunostimulatoare, au fost, de asemenea, sugerate pentru a îmbunătăți imunitatea protectoare [12]. O altă abordare care a fost explorată este utilizarea vaccinurilor potrivite antigenic. Deși toate NDV sunt considerate ca membri ai unui singur serotip [3,13], există variații antigenice între tulpini [14]. Studiile anterioare cu găini de diferite vârste au demonstrat că găinile vaccinate cu tulpini care au fost potrivite antigenic cu virusul provocare elimină semnificativ mai puțină cantitate de provocare vNDV decât cantitatea excretată de puii vaccinați cu vaccinuri heterologe [15-17]. De notat, anticorpii materni anti-NDV transferați pasiv, deși protejează puii în primele săptămâni cruciale de viață, interferează cu dezvoltarea imunității gazdei după vaccinare [18].

Vaccinarea in ovo este o abordare care oferă multiple avantaje — de exemplu, reducerea semnificativă a costurilor, standardizarea, aplicarea în masă a vaccinului, vaccinarea automatizată la incubator, livrarea uniformă a vaccinului în fiecare ou și lipsa de stres pentru păsări [19–21]— și este o metodă de imunizare atractivă pentru industria păsărilor [22]. Între 80% și 90% dintre puii de carne crescuți în SUA sunt în prezent ovo-vaccinați cu două până la trei zile înainte de eclozare [23,24], iar automatizarea procesului permite până la 70 de ouă000 să fie vaccinat la oră [23].

La nivel global, această metodă de administrare a vaccinului este folosită în 26 din cele 30 de țări producătoare de păsări de curte din lume [23]. Câteva vaccinuri in-ovo împotriva ND sunt disponibile în prezent, dar toate sunt generate folosind vectori non-NDV. S-a demonstrat că vaccinurile bazate pe vectori cu virusul variolei aviare (FPV) care exprimă proteinele NDV F și HN aplicate in ovo protejează păsările de curte de o provocare cu vNDV [25,26].

Cu toate acestea, vaccinurile recombinate FPV-ND nu sunt utilizate pe scară largă din cauza interferenței imune de la vaccinările sau expunerile anterioare FPV (FPV este prezent în mod obișnuit în mediu) și lipsa de optimizare pentru aplicarea prin metode de masă [9]. Cel mai utilizat vector pentru ND recombinant în producția de vaccin ovo este Meleagrid alphaherpesvirus 1, cunoscut în mod obișnuit ca herpesvirus al curcanilor (HVT) sau virusul bolii Marek de serotip 3 [12,23]. Numai în SUA, au fost produse 8,2 miliarde de doze de vaccinuri recombinate HVT (rHVT)-ND în 2018, comparativ cu 3,6 miliarde de doze de vaccinuri ND convenționale [27].

În plus față de avantajul de a fi utilizate in ovo, vaccinurile rHVT care exprimă proteine ​​NDV provoacă imunitate puternică și pe termen lung în urma unei singure aplicări [28]. Mai mult, aceștia sunt afectați tranzitoriu de prezența anticorpilor anti-NDV derivați matern [8]. Cu toate acestea, vaccinurile rHVT-ND au unele limitări, cum ar fi imunitatea întârziată, iar o vaccinare anterioară HVT pare a fi refractară la utilizarea vaccinurilor de rapel HVT la aceleași păsări [9,29]. Vaccinurile HV sunt asociate celulelor și trebuie să fie depozitate și transportate în azot lichid, ceea ce reprezintă o limitare a utilizării lor în multe țări.

Perspectiva pentru noi vaccinuri in ovo este în creștere [23]. Au fost explorați diferiți vectori pentru calea de administrare in-ovo și au fost raportate rezultate promițătoare cu vaccinuri cu adenovirus uman nereplicativ [30] și vector alfavirus [31]. Deși nu s-au înregistrat progrese în ceea ce privește utilizarea comercială de rutină, s-au depus, de asemenea, eforturi pentru dezvoltarea de vaccinuri noi in ovo non-HVT NDV-vectored [32-35]. Folosirea vaccinurilor vii ND in ovo este o provocare. În timp ce vaccinurile vii ND, cum ar fi LaSota, B1, Clone 30 și Ulster, pentru a numi câteva, conferă un răspuns imunitar puternic și sunt utilizate în mod obișnuit pentru vaccinarea puilor de găină de la vârsta de o zi, ele sunt asociate cu mortalitate embrionară ridicată atunci când administrat la 18 zile de națiune embrionară. Mortalitatea de până la 100% folosind virusuri de tip sălbatic cu virulenta scăzută și 80% folosind viruși vii atenuați genetic au fost raportate după utilizarea in-ovo și nu sunt utilizate vaccinuri vii ND în prezent pentru această metodă de administrare a vaccinului [36,37] .

Un nou vaccin experimental NDV recombinant (rNDV) care conține o inserție antisens de interleukină aviară 4 (IL4), denumit ZJ1*l-IL4R, s-a dovedit recent a fi un candidat promițător la vaccin in ovo după evaluarea fără agent patogen specific (SPF). ) ouă de pui embrionate (ECE) [38]. Acest studiu și-a propus să evalueze în continuare aplicabilitatea acestui vaccin NDV recombinat cu vector și coloana vertebrală recombinată a acestuia (situl de clivaj atenuat de la virusul de tip sălbatic) și a unui virus recombinant LaSota-IL4R pentru vaccinarea in-ovo a 18-vechilor de o zi. ouă comerciale cu titruri mari de anticorpi materni. Vaccinurile disponibile comercial LaSota și rHVT-ND au fost incluse ca martori. În plus, acest studiu și-a propus să evalueze eficacitatea de protecție a vaccinurilor studiate împotriva provocărilor timpurii cu vNDV. Aici, este demonstrată capacitatea acestor vaccinuri recombinate de a depăși eficient imunitatea maternă, chiar și în doze mici, și de a induce un răspuns imun puternic. Vaccinurile experimentale rNDV au demonstrat o protecție de 100% după provocările timpurii cu vNDV.

2. Materiale și metode

2.1. Viruși

Gâscă virulentă/China/ZJ1/2000 (ZJ1, numărul de acces GenBank AF431744) NDV, membru al sub-genotipului VII.1.1 (fostul VIId), a fost utilizat ca virus de provocare în acest studiu. Un virus ZJ1 recombinant (versiune atenuată a ZJ1) cu un loc de clivaj virulent scăzut (ZJ1*L) care a fost generat anterior în laboratorul nostru prin genetică inversă [39] a fost folosit ca coloană vertebrală pentru crearea vaccinurilor recombinate ZJ1*L și ca vaccin. virus. Tulpina de vaccin LaSota (LS) cu virulentă scăzută a fost utilizată ca control al vaccinului și ca coloană vertebrală pentru a genera un vaccin recombinant LS-IL4R. Toți virușii au fost obținuți din depozitul Southeast Poultry Research Laboratory (SEPRL) al Centrului Național de Cercetare a Păsărilor din Statele Unite (USNPRC), Departamentul Agriculturii al SUA (USDA). În plus, un vaccin rHVT-ND disponibil comercial (inserție de genă de fuziune) a fost, de asemenea, utilizat ca martor.

Vaccinurile experimentale recombinate NDV utilizate în acest studiu au fost create folosind genetica inversă, așa cum a fost descris anterior [38,39]. Pe scurt, secvența de codificare a IL4 aviară a fost donată în coloana vertebrală a ZJ1*L și LS în orientare inversă (IL4R) între genele P și M, generând doi virusuri vii atenuate recombinanți - și anume, ZJ1*L-IL4R și LS- IL4R (numerele de acces GenBank MM680659 și, respectiv, MM680665). Virușii recombinanți au fost salvați folosind virusul vaccinia modificat Ankara care exprimă polimeraza T7 (MVA/T7), urmând protocoalele publicate anterior [38-41]. O reprezentare schematică a constructelor este furnizată în figura suplimentară S1A. În scopul acestei lucrări, termenul „vaccinuri DV” utilizat în continuare se referă la ZJ1*L, ZJ1*L-IL4R şi LS-IL4R.

Stocurile de lucru ale tuturor NDV au fost propagate în {{0}} la 11-ouă de pui embrionate SPF (ECE) vechi de o zi [42]. Stocurile virale utilizate pentru inocularea ouălor în acest studiu au fost diluate în bulion de infuzie pentru inimă pentru creier (BHI) (BD Biosciences, MD, SUA), care conține 200 µg/mL gentamicină, 2{{22} }00 U/mL penicilină și 4 µg/mL amfotericină B, la trei titruri țintă diferite, 105,5/0,1 mL, 104,5/0,1 mL și 103,5/0,1 mL doze infecțioase pentru embrioni (EID50), cu excepția LS , care a fost diluat la 105,5/0,1 ml şi 104,5/0,1 ml EID50. Titrurile stocurilor de lucru diluate ale vaccinurilor vii au fost confirmate prin titrari inverse în 9- la 11-ECE SPF vechi de o zi, urmând procedurile standard, după cum s-a menționat mai sus. Vaccinul rHVT-ND a fost diluat direct utilizând diluantul albumină glutamat de zaharoză fosfat pentru vaccinurile rHVT descrise în Protocolul de testare al Centrului pentru Biologice Veterinare al USDA [43].

2.2. ouă

Două sute șaizeci și două de ouă comerciale (non-SPF) din turma de rase Hy-Line Rockside W-36 (Mansfield, GA, SUA) au fost donate cu amabilitate pentru acest experiment. Turma stratului a fost vaccinată în mod obișnuit cu vaccinul LaSota. Imunitatea turmei a fost testată în mod regulat prin ELISA și, deși aceste rezultate nu sunt direct translabile în titrurile de inhibare a hemaglutinării (HI), nivelurile medii de anticorpi anti-NDV ale efectivului parental au fost foarte mari (adică, 15.534 cu un limit pentru pozitiv. mostre de 1159). Sursa de ECE SPF (42 de ouă) a fost turma SEPRL SPF White Leghorn. Toate ouăle au fost incubate la 37,5 ◦C temperatură și 55-60% umiditate relativă timp de 18 zile.

2.3. Vaccinare

Ouăle comerciale (n {{{{10}}}}) și SPF (n=42), la 18 zile de embrionare (DOE), au fost separate în 14 grupuri cu 21 de ouă în fiecare grup (cu excepția grupurilor de control BHI și Hatch, care au avut fiecare 26 de ouă). Folosind seringi de 1 mL, 24 G × 1/2, fiecare ou a fost inoculat în cavitatea alantoidiană cu 0,1 mL de vaccin diluat sau BHI, cu excepția grupului de control Hatch, în care ouăle nu au fost manipulate la toate. Au fost treisprezece grupuri de ouă inoculate, separate în șapte grupuri experimentale și șase de control. Cele șapte grupuri experimentale au fost după cum urmează: ZJ1*L-IL4R 104,5, ZJ1*L-IL4R 105,5, LS-IL4R 103,5, LS-IL4R 104,5, LS-IL4R 105,5, ZJ1*L 104,5*L și fiecare primește 10515*L. doza respectivă de inocul EID50 per 0,1 ml, așa cum este menționat în numele grupului. În plus, au fost create șase grupuri de control. Două grupuri de control de ouă comerciale au fost inoculate așa cum este descris mai sus cu BHI și, respectiv, rHVT-ND. Două grupuri de control de ouă comerciale au fost inoculate, așa cum s-a descris mai sus, cu doze de inocul LS 104,5 și LS 105,5 EID50 per 0,1 ml. Două grupuri de control de ouă SPF au fost inoculate cu ZJ1*L 103,5 și ZJ1*L-IL4R 103,5. O reprezentare schematică a designului studiului este oferită în figura suplimentară S1B, C.

După inoculare, ouăle au fost plasate în incubatoarele Turbofan Hova-Bator (GQF Manufacturing Company Inc., GA, SUA) care au fost ulterior plasate în izolatoare într-o unitate de biosecuritate animală de nivel 2 (ABSL-2). Incubatoarele au fost reglate cu termostate pentru a menține o temperatură constantă de 37,5 ◦ C și umiditatea relativă între 55 și 60 la sută.

2.4. Eclozare, eșantionare, mortalitate

După ecloziune la 21 DOE, puii au fost găzduiți în izolatoare de presiune negativă (ABSL-2) și au furnizat hrană și apă cu acces ad libitum. Cinci pui non-SPF din ambele grupuri de control Hatch și BHI au fost sacrificați și s-au sângerat imediat după ecloziune pentru a stabili titrul de bază al anticorpilor materni anti-NDV HI. Toți puii au fost cântăriți la 1, 8 și 13 zile după ecloziune (DPH). Tampoane orofaringiene și cloacale au fost colectate în BHI de la fiecare pasăre la 2 și 4 DPH. Semnele clinice și mortalitatea au fost înregistrate de două ori pe zi pe parcursul perioadei de după ecloziune și au fost colectate probe de sânge la 13 DPH.

2.5. Provocare

Douăsprezece păsări din fiecare grup (cu excepția LS 1{{10}}5,5, în care toate păsările au murit cu 6 DPH) au fost transferate la unitatea ABSL-3E la 13 DPH. Păsările au fost plasate în izolatoare de presiune negativă și lăsate să se aclimatizeze timp de 24 de ore înainte de provocare. Toate păsările au fost provocate la 14 DPH cu ZJ1 NDV virulent la 106 EID50/0,1 mL pe cale oculo-nazală. Păsările au fost observate zilnic pentru semne clinice și mortalitate. Tampoane orofaringiene și cloacale au fost colectate de la fiecare pasăre la 2 și 4 zile post-provocare (DPC). Toate păsările supraviețuitoare au fost cântărite și sângerate la 14 DPC și au fost eutanasiate prin dislocare cervicală după anestezie cu 0,2 ml soluție de ketamina/xilazină (66 mg/ml ketamina și 6,6 mg/ml xilazină) administrată intramuscular cu un 25- manometru.

2.6. RT-PCR în timp real

ARN a fost extras din toate mediile tampon folosind kitul de izolare a ARN viral MagMAX 96 AI/ND (Ambion, Inc. Austin, TX, SUA) cu un procesor de particule magnetice KingFisher (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) urmând instrucțiunile producătorului , cu modificarea de îndepărtare a inhibitorului descrisă de Das și colab. [44]. RT-PCR cantitativ în timp real (rRT-PCR) pentru detectarea NDV care vizează gena matricei (M) a fost efectuată utilizând kitul RT-PCR într-un singur pas AgPath-ID (Ambion) și ABI 750{{31 }} Sistem rapid de PCR în timp real (Applied Biosystems, Waltham, MA, SUA) care utilizează primeri și sondă descrise anterior de Wise și colab. [45]. Condițiile testului au fost transcripție inversă timp de 10 min la 45 ◦C; denaturare inițială timp de 10 min la 95 ◦C; 40 cicluri de denaturare timp de 10 secunde la 94 ◦C, recoacere primerului timp de 30 de secunde la 56 ◦C și alungire a primerului timp de 10 secunde la 72 ◦C. Volumul total de reacție de 25 µL pentru fiecare probă a constat din apă de grad molecular – 2,5 µL; tampon 2X—12,5 uL; primer înainte - 0,25 µL (20pmol/µL); primer invers - 0,25 uL (20 pmol/pl); sondă - 0,50 uL (6pmol/ul); amestec de enzime 25X—1,0 µL; și șablon ARN - 8,0 µL. Pentru cuantificarea virusului, a fost stabilită o curbă standard pentru fiecare virus, cu ARN extras din același stoc titrat al virusurilor utilizate pentru inocularea ouălor (pentru probele de tampon colectate după ecloziune) sau virusul provocat (pentru probele de tampon colectate după ecloziune). -provocare).

Rezultatele sunt raportate ca EID50/mL. Limita inferioară de detecție calculată a testelor a fost între 101,7 și 101,9 EID50/mL. Este important de menționat că rRTPCR detectează acizi nucleici virali și că valorile estimate nu reprezintă neapărat viruși infecțioși. Valorile EID50/mL nu urmăresc să prezinte infecțiozitatea și sunt utilizate pentru a oferi mijloace pentru compararea relativă a excreției virale între grupuri. În ciuda utilizării protocolului de extracție a acizilor nucleici pentru îndepărtarea inhibitorilor, volumul mare de matriță de ARN poate fi afectat calculele din curba standard. De notat, aceeași cantitate de șablon de ARN a fost utilizată în toate reacțiile, iar potențialii inhibitori de reziduuri ar fi afectat toate rezultatele în mod egal.

2.7. HI Test

Testul de inhibare a hemaglutinării (HI) a fost utilizat pentru a evalua prezența și titrurile de anticorpi în probele de ser colectate pe parcursul experimentului. Urmând procedurile standard [46], virusul folosit ca coloană vertebrală pentru fiecare vaccin a fost utilizat ca antigen pentru fiecare grup respectiv de seruri (ZJ1*L pentru toate grupurile ZJ1 și LS pentru toate grupurile LS). Pentru probele de ser colectate după provocare, virusul virulent ZJ1 a fost utilizat ca antigen în testul HI. Titrurile au fost calculate ca reciproca ultimei diluții de ser HI pozitive, iar probele cu titruri HI de log2 3 și mai mici au fost considerate negative.

2.8. Analize statistice

Software-ul Prism v.7.03 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, SUA) a fost folosit pentru a analiza datele, iar valorile aberante au fost identificate folosind testul ROUT. Testul de normalitate D'Agostino-Pearson a fost efectuat pentru a estima dacă valorile din fiecare grup provin dintr-o distribuție Gaussiană. Pe baza distribuției de normalitate, testul neparametric Kruskal-Wallis cu post-testul Dunn a fost utilizat pentru comparații multiple între grupuri. În scopuri statistice, tuturor probelor de tampon din care virușii nu au fost detectați au primit o valoare numerică de 1 log sub limita de detectare pentru fiecare virus. Curbele de supraviețuire au fost analizate folosind testul Log-rank (Mantel-Cox). Semnificația statistică a fost stabilită la o valoare p < 0,05.

3. Rezultate

3.1. Eclozare, supraviețuire după ecloziune și greutăți corporale

Supraviețuirea după ecloziune pentru toate grupurile eclozate din ouă comerciale este descrisă ca curbe de supraviețuire în Figura 1 (separate în figurile 1A și B pentru claritate și pentru a evita congestionarea graficelor). Un grafic combinat este disponibil în Figura suplimentară S2. Grupul de control Hatch (neinoculat) a fost inclus în proiect pentru a se asigura că nu a existat o ecloziune anormală sau mortalitate după ecloziune care nu a fost legată de inocularea ouălor.

După cum era de așteptat, a fost observată o mortalitate foarte scăzută (rHVT-ND) până la deloc (Hatch și BHI) în trei dintre grupurile de control. În schimb, grupurile de control LS au avut o supraviețuire de 57,1% și 0% atunci când au fost utilizate dozele de 104,5 și, respectiv, 105,5, ceea ce a fost raportat anterior pentru vaccinurile vii convenționale ND. Două ouă nu au eclozionat în grupul LS-IL4R 105.5 și un ou nu a eclozionat în grupul LS 104.5. Mortalitatea variabilă a fost observată în celelalte loturi în funcție de vaccin și doza de inoculare. Loturile ZJ1*L-IL4R 104,5 și 105,5 au avut o supraviețuire de 90,5%, respectiv 71,4%, iar supraviețuirea înregistrată în grupurile ZJ1*L 104,5 și 105,5 a fost de 80,9% și, respectiv, 76,2% (Figura 1A), dar diferențele au fost nesemnificativ statistic. Supraviețuirea în grupul LS-IL4R 103,5 a fost de 95,2 la sută. Ratele de supraviețuire observate în grupurile LS-IL4R 104,5 și 105,5 au fost de 85,7% și, respectiv, 66,7% (Figura 1B).

Nu au existat diferențe semnificative de supraviețuire între grupurile experimentale de vaccin ZJ1*L, ZJ1*L-IL4R și LS-IL4R și grupurile de control Hatch, BHI și rHVT-ND, dar procentul de supraviețuire în aceste grupuri de control a fost numeric mai mare. , cu o corelație negativă între doza de vaccin și supraviețuirea după ecloziune observată (supraviețuirea a crescut pe măsură ce doza de vaccin a scăzut). Grupul de control LS 1{{10}}5,5 a avut diferențe semnificative de supraviețuire în comparație cu grupurile experimentale (valori p între 0.{0001 și 0,02). Grupul de control LS 104.5, deși nu este diferit din punct de vedere statistic, a avut rate de supraviețuire substanțial mai mici în comparație cu grupurile experimentale cu aceeași doză. Cele două grupuri de control LS au avut diferențe semnificative în supraviețuire în comparație cu grupurile de control Hatch, BHI și rHVT-ND (valori p între 0,0001 și 0,04). Nu au fost observate semne clinice în niciunul dintre grupuri după ecloziune. În loturile în care mortalitatea după ecloziune a fost prezentă, păsările au fost găsite moarte la verificările zilnice.

Toate păsările au fost cântărite în zilele 1, 8 și 13 după ecloziune (Tabelul 1). La 1 DPH, greutatea corporală medie per pasăre în majoritatea grupelor a fost între 38,5 și 42,6 grame (g). Au existat diferențe semnificative de greutate corporală doar între grupurile rHVT-ND și ZJ1*L-IL4R 104,5 dintr-o parte și ZJ1*L 104,5 și LS 1{{4{{42} de control }}}4,5 de la altul (păsările din primele două grupuri au cântărit mai mult decât păsările din grupul martor) (valori p între 0.{0001 și respectiv 0,017). La 8 DPH, cele două grupuri ZJ1*L și LS-IL4R 104.5, grupul LS-IL4R 105.5 și grupul de control LS (greutate medie 50-63 g) au avut greutăți corporale semnificativ mai mici în comparație cu păsările din Hatch, Grupuri de control BHI și rHVT-ND (greutate medie 77–82 g) (valori p între 0,0001 și 0,03). Aceleași grupuri care au fost semnificativ diferite de martorii la 8 DPH (cu excepția LS-IL4R 104,5) au avut greutăți corporale semnificativ mai mici decât grupurile de control Hatch, BHI și rHVT-ND și la 13 DPH (valori p între 0,0001 și 0,01). Păsările din grupurile de control SPF inoculate nu au fost incluse în această comparație, deoarece ouăle SPF (și păsările eclozate din ele) sunt în mod tradițional mai mici și mai ușoare decât ouăle comerciale.

Figura 1. Supraviețuirea găinilor după ecloziune după inocularea ouălor comerciale la 18 zile de națiune embrionară cu vaccinuri experimentale in ovo NDV. Ouăle Hy-Line Rockside W-36 au fost inoculate cu viruși recombinați și LaSota. Trei grupuri de control au fost inoculate cu vaccin BHI sau rHVT-ND sau nu au fost inoculate (grupul de control Hatch). Păsările au fost monitorizate timp de 13 zile după ecloziune. Curbele de supraviețuire sunt prezentate în două figuri: (A) grupurile de control și grupurile ZJ1*L și (B) grupurile de control și grupurile LS-IL4R. Litere superscripte diferite indică diferențe semnificative statistic între grupuri (valoarea p < 0.05). Abrevieri de grup: HATCH—ouă neinoculate; BHI - ouă inoculate cu BHI; rHVT-ND - ouă inoculate cu vaccin HVT recombinant; ZJ1*L - ouă inoculate cu virusul recombinant ZJ1*L al cărui situs de clivaj a fost modificat pentru a fi de virulenţă scăzută; ZJ1*L-IL4R - ouă inoculate cu ZJ1*L cu virulenta scăzută recombinantă cu gena interleukinei-4 inserată în orientare inversă; LS—ouă inoculate cu tulpina LaSota; LS-IL4R — ouă inoculate cu virusul LaSota recombinant cu gena interleukinei-4 inserată în orientare inversă. Doza de virus pe care ouăle din fiecare grup au primit-o este reprezentată ca un număr după numele grupului în EID50/per ou.

Tabelul 1. Greutăți medii (și abateri standard) ale puilor la 1, 8 și 13 zile după ecloziune după inocularea ouălor comerciale la 18 zile de națiune embrionară cu vaccinuri experimentale in ovo și la 14 zile după provocarea cu boala Newcastle virulentă virus.

3.2. Eliminarea virusurilor vaccinale după vaccinare, așa cum sa demonstrat prin rRT-PCR

La 2 DPH, nu au existat diferențe semnificative în eliminarea virală între grupurile de vaccin. (Figura 2A). În mod similar, la 4 DPH, diferențele dintre grupuri nu au fost semnificative statistic. (Figura 2B). Nu a fost detectată nicio vărsare virală la niciuna dintre păsările de control Hatch și BHI.

Figura 2. Evacuarea medie a vaccinului după ecloziune de la puii eclozați din ouă comerciale inoculate la 18 zile de națiune embrionară cu vaccinuri experimentale in ovo. Fiecare punct de date reprezintă o pasăre și titruri NDV detectate în tampoane orofaringiene (OP) și cloacale (CL) în zile diferite după ecloziune (DPH). Deversarea este prezentată separat timp de 2 zile după ecloziune (A) și 4 zile după ecloziune (B). Barele reprezintă abaterile standard ale mediei. Toate tampoanele din care virusul nu a fost detectat au primit o valoare numerică de 1 log sub limita de detecție pentru fiecare dintre virușii respectivi. Limita de detecție a rRT-PCR este prezentată ca o linie punctată orizontală (se folosește limita cea mai inferioară). Abrevieri de grup: HATCH—ouă neinoculate; BHI - ouă inoculate cu BHI; rHVT-ND - ouă inoculate cu vaccin HVT recombinant; ZJ1*L - ouă inoculate cu virusul recombinant ZJ1*L al cărui situs de clivaj a fost modificat pentru a fi de virulenţă scăzută; ZJ1*L-IL4R — ouă inoculate cu ZJ1*L cu virulenta scăzută recombinantă cu gena interleukinei-4 inserată în orientare inversă; LS—ouă inoculate cu tulpina LaSota; LS-IL4R — ouă inoculate cu virusul LaSota recombinant cu gena interleukinei-4 inserată în orientare inversă. Doza de virus pe care ouăle din fiecare grup au primit-o este reprezentată ca un număr după numele grupului în EID50/per ou.

3.3. Răspunsul imun umoral după ecloziune

Analiza probelor de ser colectate la 13 DPH (bare umplute cu dungi diagonale) prin testul HI (detectarea anticorpilor de hemaglutinare la NDV) este prezentată în Figura 3. Pentru a stabili titrul de anticorpi HI materni anti-NDV transferați pasiv în ouăle comerciale, zece puii au fost sângerați imediat după ecloziune (0 DPH). Titrurile HI la trapă au variat între log2 5 și log2 8, cu o medie de log2 7,17 (Figura 3, linie roșie orizontală punctată). Anticorpii la 13 DPH din grupurile Hatch, BHI și rHVT-ND (media log2 4.7) sunt anticorpi materni reziduali, deoarece aceste grupuri fie nu au fost vaccinate, fie vaccinate cu vaccinul rHVT-ND, ceea ce nu nu induce anticorpi HI la NDV. Titrurile de anticorpi în grupurile ZJ1*L, ZJ1*L-IL4R și LS 104,5 au fost semnificativ mai mari în comparație cu grupurile de control Hatch, BHI și rHVT-ND. Nu s-au observat diferențe semnificative între diferitele grupuri de doze ale vaccinurilor cu aceeași coloană vertebrală. Grupurile LS-IL4R au avut titruri HI post-vaccinare mai mici în comparație cu grupurile ZJ1*L-IL4R și ZJ1*L, deși aceste diferențe nu au fost semnificative statistic. De notat, deși numeric ușor mai mari, titrurile HI post-vaccinare ale păsărilor din toate grupurile LS-IL4R nu au fost semnificativ diferite de titrurile măsurate la păsările martor nevaccinate.

Figura 3. Titruri de anticorpi HI înainte și post-provocare (și abaterea standard) de la pui eclozionați din ouă comerciale inoculate la 18 zile de națiune embrionară cu vaccinuri experimentale in ovo și provocare precoce cu virusul virulent al bolii Newcastle la 14 zile după ecloziune. Barele umplute cu dungi diagonale reprezintă titrurile pre-provocare la 13 zile după ecloziune. Batoanele umplute cu solid reprezintă titrurile post-provocare la 14 zile după provocare. Diferențele semnificative statistic între diferitele grupuri sunt prezentate cu litere mici deasupra fiecărui grup (valoarea p<0.05). The level of maternal antibodies on the day of hatch (0 DPH) is presented as a horizontal dotted line. Group abbreviations: HATCH—eggs not inoculated; BHI—eggs inoculated with BHI; rHVT-ND—eggs inoculated with recombinant HVT vaccine; ZJ1*L—eggs inoculated with the recombinant ZJ1*L virus whose cleavage site was modified to be of low virulence; ZJ1*L-IL4R—eggs inoculated with the recombinant low virulent ZJ1*L with the interleukin-4 gene inserted in reverse orientation; LS—eggs inoculated with the LaSota strain; LS-IL4R—eggs inoculated with the recombinant LaSota virus with the interleukin-4 gene inserted in reverse orientation. The virus dose that the eggs in each group received is represented as a number after the group name in EID50/per egg.

3.4. Semne clinice și supraviețuire după provocarea timpurie cu CDV

În grupurile de control, primele semne clinice care au fost observate au fost în grupurile Hatch și BHI la 3 DPC. Trei păsări din grupul Hatch și o pasăre din grupul BHI au respirat greu. La 4 DPC, s-au observat pene ciufulite și tremurături ale capului în grupurile BHI și hatch, iar la 5 DPC în grupul rHVT-ND; în ultimul grup, ataxie și torticolis sever au fost, de asemenea, înregistrate la două păsări. Păsările din grupul de control Hatch au prezentat letargie la 5 DPC, iar două păsări din grupul BHI au prezentat paralizie. Letargie și paralizii au fost observate în grupul rHVT-ND la 6 și 7 DPC. Opistotonos, torticolis și respirație dificilă au fost observate în grupurile de control Hatch și BHI începând cu 9 DPC. În grupul rHVT-ND, torticolisul a fost observat încă de la 5 DPC, respirația dificilă și ataxia au început la 6 DPC, iar opistotonos a început la 13 DPC. Până la 14 DPC, toate păsările, cu excepția a două păsări Hatch, una BHI și două rHVT-ND (83,3%, 91,6% și, respectiv, 83,3% morbiditate) fie au murit, fie au dezvoltat semne clinice predominant neurologice, cum ar fi ataxie, opistoton, torticolis, tremor. , și paralizează. Păsările care au prezentat semne clinice severe, au încetat să mănânce sau să bea sau au rămas culcate au fost eutanasiate și raportate ca moarte în ziua următoare pentru calcularea timpilor de supraviețuire. Nu au fost observate semne clinice în niciunul dintre grupurile ZJ1*L și ZJ1*L-IL4R. Semne clinice ușoare de opistotonos sau torticolis au fost observate la o singură pasăre (8,4 la sută morbiditate) în fiecare dintre grupurile LS-IL4R și grupul LS 104,5 la 14 DPC.

Supraviețuirea post-provocare cu virulent ZJ1 NDV este descrisă ca curbe de supraviețuire în Figura 4. În timp ce toate grupurile inoculate cu vaccinuri recombinate și LS au arătat o supraviețuire de 100%, păsările din grupurile Hatch, BHI și rHVT-ND au avut 58,3%, 58,3 la sută și, respectiv, supraviețuire 66,6 la sută. Supraviețuirea post-provocare în grupurile de control Hatch și BHI a fost semnificativ mai mică în comparație cu grupurile cu vaccin experimental. De notat, deși greutățile corporale ale păsărilor din grupurile inoculate au fluctuat după ecloziune în comparație cu martorii Hatch, BHI și rHVT-ND, toate păsările vaccinate cu rNDV (282-328 g) au depășit greutățile corporale ale celor nevaccinate. păsări de control post-provocare (255–266 g) (Tabelul 1). Cu toate acestea, nu a fost observată nicio diferență semnificativă de greutate corporală între niciunul dintre grupurile studiate.

Figura 4. Supraviețuirea găinilor după inocularea ouălor comerciale la 18 zile de națiune embrionară cu vaccinuri experimentale in ovo și provocarea timpurie cu virusul virulent al bolii Newcastle la 14 zile după ecloziune. Păsările au fost monitorizate timp de 14 zile după provocare. Litere superscripte diferite indică diferențe semnificative statistic între grupuri (valoarea p < 0.05). Abrevieri de grup: HATCH—ouă neinoculate; BHI - ouă inoculate cu BHI; rHVT-ND - ouă inoculate cu vaccin HVT recombinant; ZJ1*L - ouă inoculate cu virusul recombinant ZJ1*L al cărui situs de clivaj a fost modificat pentru a fi de virulenţă scăzută; ZJ1*L-IL4R—ouă inoculate cu ZJ1*L cu virulenta scăzută recombinantă cu gena interleukinei-4 inserată în orientare inversă; LS—ouă inoculate cu tulpina LaSota; LS-IL4R — ouă inoculate cu virusul LaSota recombinant cu gena interleukinei-4 inserată în orientare inversă. Doza de virus pe care ouăle din fiecare grup au primit-o este reprezentată ca un număr după numele grupului în EID50/per ou.

3.5. Eliminarea post-provocare, așa cum a fost demonstrat de rRT-PCR

La 2 DPC, păsările din grupurile de control Hatch, BHI și rHVT-ND elimină titruri virale mari (1{{20}}5,3-5,7 EID50/mL) pe cale orală, în timp ce toate grupurile de vaccin a avut titruri medii de eliminare mai mici de 104 EID50/mL (Figura 5A). Rezultatele pentru eliminarea virală prin cloaca au fost sub limita de detecție a testului în toate grupurile. La 2 DPC, păsările din toate grupurile ZJ1*L și ZJ1*L-IL4R și cele din grupul LS-IL4R 105.5 au avut semnificativ mai puțin ARN viral detectat pe cale orală în comparație cu grupurile de control Hatch, BHI și rHVT-ND (valorile p au variat între 0,001 și 0,02). La 4 DPC, scurgerea pe cale orală în grupurile Hatch, BHI și rHVT-ND a fost ridicată (106,2-6,9 EID50/mL) (Figura 5B).

În schimb, s-a observat mai puțină eliminare în toate grupurile de vaccin la 4 DPC comparativ cu 2 DPC, cu cel mai mare titru mediu de 102,9 EID50/mL în grupul ZJ1*L 104,5 și cel mai scăzut titru mediu de 101,5 EID50/mL în ZJ1* Grupa l-IL4R 104,5 (ARN viral nu a fost detectat la unele păsări). Toate grupurile experimentale de vaccin rNDV elimină semnificativ mai puțin virus pe cale orală în comparație cu grupurile de control Hatch, BHI și rHVT-ND (valorile p de la<0.0001 to 0.03). No significant differences in oral shedding were observed among the experimental rNDV vaccine groups. The birds in the rNDV vaccine groups shed significantly less virus through the cloacal route compared with the Hatch, BHI, and rHVT-ND control groups (p values from <0.0001 to 0.007). The differences in the titers were not significant among the experimental rNDV vaccine groups and the LS control group.

Figura 5. Eliminarea virală medie post-provocare de la găini după inocularea ouălor comerciale la 18 zile de națiune embrionară cu vaccinuri experimentale in ovo și provocarea precoce cu virusul virulent al bolii Newcastle la 14 zile după ecloziune. Fiecare punct de date reprezintă titrurile NDV detectate în tampoane orofaringiene (OP) și cloacale (CL) în diferite zile post-provocare (DPC). Deversarea este prezentată separat timp de 2 zile post-provocare (A) și 4 zile post-provocare (B). Barele reprezintă abaterile standard ale mediei. Toate tampoanele din care nu a fost detectat virusul au primit o valoare numerică de 1 log sub limita de detectare. Limita de detecție a rRT-PCR este prezentată ca o linie punctată orizontală.

Diferențele semnificative statistic între diferitele grupuri sunt prezentate cu litere mici deasupra fiecărui grup (valoarea p < 0.05). Abrevieri de grup: HATCH—ouă neinoculate; BHI - ouă inoculate cu BHI; rHVT-ND - ouă inoculate cu vaccin HVT recombinant; ZJ1*L - ouă inoculate cu virusul recombinant ZJ1*L al cărui situs de clivaj a fost modificat pentru a fi de virulenţă scăzută; ZJ1*L-IL4R — ouă inoculate cu ZJ1*L cu virulenta scăzută recombinantă cu gena interleukinei-4 inserată în orientare inversă; LS—ouă inoculate cu tulpina LaSota; LS-IL4R — ouă inoculate cu virusul LaSota recombinant cu gena interleukinei-4 inserată în orientare inversă. Doza de virus pe care ouăle din fiecare grup au primit-o este reprezentată ca un număr după numele grupului în EID50/per ou.

3.6. Serologie post-provocare

Toate păsările din grupurile de control Hatch, BHI și rHVT-ND au prezentat titruri de anticorpi HI crescute (mai mult decât dublu) la 14 DPC (peste log2 10) în comparație cu titrurile pre-provocare la 13 DPH (log{ {6}}.7). Diferențele de titruri în aceste trei grupuri înainte și după provocare au fost semnificative (valoarea p<0.0001) (Figure 3, solid bars). In contrast, the post-challenge HI titers in all experimental rNDV vaccine groups and the LS control group did not change significantly compared with the pre-challenge titers of the same groups. In all groups, the differences between pre-and post-challenge antibody titers were within a log (except LS-ILR4 103.5, in which the difference was log2 1.8).

3.7. Grupuri de control SPF inoculate

Supraviețuirea în grupurile de control SPF după ecloziune a fost de 66,7 la sută în grupul inoculat cu ZJ1 * L 103,5 și de 57,1 la sută în grupul inoculat cu ZJ1 * L-IL4R 103,5 (Figura suplimentară S3A). Extinderea virală activă a fost detectată la păsările din grupurile de control SPF prin ambele căi, cu titruri mai mari detectate în probele de tampon orofaringian (a se vedea Figura suplimentară S3B). Titrurile HI post-vaccinare ale păsărilor martor SPF inoculate au fost mai mari decât titrurile din grupurile de control Hatch, BHI și rHVT-ND și au atins valorile medii de log2 7.08 și log2 7. 58 la 13 DPH în grupurile ZJ1*L-IL4R 103.5 și, respectiv, ZJ1*L-IL4R 103.5 (a se vedea figura suplimentară S3C). Nu au fost observate semne clinice post-provocare sau mortalitate în cele două grupuri de control SPF inoculate (a se vedea Figura suplimentară S3D pentru curbele de supraviețuire). Păsările din grupurile de control SPF inoculate elimină semnificativ mai puțin virus pe cale orală la 2 DPC și 4 DPC în comparație cu grupurile de control (valorile p de la<0.0001 to 0.009) (see Supplementary Figure S3E). The post-challenge antibody titers in both inoculated SPF control groups did not change significantly compared with the pre-challenge titers of the same groups (see Supplementary Figure S3C).

For more information:1950477648nn@gmail.com