A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Imane Bensaada, Blaise Robin3, Joeille Perez, Yann Salemkour, Anna Chipont, Marine Camus, Mathilde Lemoine, Lea Guyonnet, Helene Lazareth, Emmanuel Letavernier, Carole Henique, Pierre-Louis Tharaux și Olivia Lenoir

„Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, Franța; și Université Paris Descartes, Sorbona Paris Cite, Paris, Franța

Valoarea predictivă puternică a proteinuriei în glomerulopatiile cronice este ferm stabilită, precum și rolul patogen al angiotensinei ll în promovarea progresiei bolii glomerulare cu o barieră de filtrare glomerulară alterată, leziuni podocice și cicatrizare a glomerulilor. Aici am descoperit că hipertensiunea cronică indusă de angiotensină Il a inhibat fluxul de autofagie în glomerulii de șoarece. Deleția Atg5 (o genă care codifică o proteină implicată autofagie) în mod specific în podocit a dus la podocitopatie accelerată indusă de angiotensină I, albuminurie accentuată și glomeruloscleroză. Acest lucru indică faptul că autofagia este un mecanism de protecție cheie în podocit în această stare. Activitatea calpainei indusă de angiotensină-Il în podocite inhibă fluxul de autofagie. Podocitele de la șoareci cu expresia transgenică a inhibitorului endogen al calpainei, calpastatin, au prezentat autofagie mai mare a podocitelor la momentul inițial, care a fost rezistentă la inhibarea dependentă de angiotensină Il. De asemenea, autofagia susținută cu calpastatină a limitat leziunile podocitelor și albuminuria. Aceste descoperiri sugerează că hipertensiunea arterială are efecte patogene asupra structurii și funcției glomerulare, parțial prin activarea calpainelor care duce la blocarea autofagiei podocitelor. Aceste descoperiri descoperă un mecanism original prin care hipertensiunea mediată de angiotensină Il inhibă autofagia prin recrutarea calpainei indusă de calciu cu consecințe patogene în caz de dezechilibru prin activitatea calpastatinei. Astfel, prevenirea scăderii autofagiei mediată de calpaină poate fi o nouă strategie terapeutică promițătoare pentru nefropatiile asociate cu o activitate ridicată a sistemului renină-angiotensină.

Cistanchedeserticola previnerinichiboala

Declarație translativă

Având în vedere rolul crucial al autofagiei în dezvoltarearinichiboli, modularea farmacologică a autofagiei ar putea fi o strategie promițătoare pentru prevenirea și tratamentul mai multor boli de rinichi. În paralel, s-a constatat că supraactivarea activității calpainei în podocite are efecte dăunătoare asupra funcției podocitelor, în timp ce mecanismele sale dăunătoare de acțiune nu au fost identificate. Aici, oferim dovezi că calpaina leagă acțiunea dăunătoare a angiotensinei Il de blocarea dăunătoare a autofagiei în podocite și sugerăm că inhibarea calpainei ar putea fi o țintă terapeutică promițătoare pentru bolile podocitelor, parțial prin menținerea autofagiei podocitelor.

Hipertensiunea arterială este a doua după diabet ca principală cauză a progresieicronicrinichiboala-și chiar și creșterea modestă a tensiunii arteriale este un factor de risc independent pentru boala renală în stadiu terminal. Un număr tot mai mare de studii experimentale au evidențiat importanța podoccitelor în dezvoltarearinichirănire. Pierderea progresivă a podocitelor și alterările microvasculare apar precoce odată cu declinul funcțional al rinichilor în nefropatia hipertensivă experimentală. La pacienți, excreția urinară a podocitelor viabile s-a dovedit a fi un marker sensibil și specific pentru preeclampsie, iar pacienții cu nefroscleroză au avut o densitate semnificativ mai mică de podocite glomerulare decât donatorii de rinichi. Mai mult, rolul patogen al angiotensinei II (Angel) de promovare a progresiei bolii glomerulare este bine stabilit, nu numai în afecțiunile hipertensive, ci și în mai multe boli glomerulare.

Hipertensiunea glomerulară are ca rezultat întinderea capilară glomerulară, leziuni endoteliale și filtrarea proteinelor glomerulare crescute care provoacă colaps glomerular și glomeruloscleroză. De asemenea, exercită o acțiune directă asupra structurilor glomerulare, determinând răspunsuri regulatoare de semnalizare menite să compenseze. Un sistem activat sistemic și local renină-angiotensină-aldosteron (RAAS) favorizează hiperplazia mezangială și sinteza factorilor de permeabilitate vasculară. Concomitent, podocitele afișează semnale de calciu și își modifică forma asupra receptorului AnglI de tip 1 (AT1)-28Aceste mecanisme de adaptare dependente de stimulare.24-28 devin dezadaptative pe termen lung, ducând în cele din urmă la glomeruloscleroză. AT1 mediază implicarea proeminentă a RAAS pentru tensiunea arterială și homeostazia apei și sării. Inhibitorii enzimei de conversie a angiotensinei și blocanții AT1 sunt utilizați clinic pentru tratamentul hipertensiunii arteriale și insuficienței cardiace la pacienți. Interesant este că ambele blocante prezintă, de asemenea, un efect protector asuprarinichifuncţie.

S-a demonstrat că autofagia este esențială pentru menținerea homeostaziei celulare, în special în postmitotice și în special în podocite.1- Autofagia este un sistem de degradare asociat cu cl9olizozomi pentru proteinele citoplasmatice cu viață lungă și organele disfuncționale55 și implică sechestrarea proteinelor și organitelor. în autofagozomi. Formarea autofagozomilor depinde de inducerea mai multor gene, inclusiv Mapllc3a/b, Berlin 1 și Atgs. Există tot mai multe dovezi că dereglarea căii autofagice este implicată în patogenezarinichiîmbătrânire și mai multerinichiboli precum afectarea acută a rinichilor, boala polichistică a rinichilor, îmbătrânirea și nefropatia diabetică.

Reglarea autofagiei în podocite, fiziologică și, mai ales, în context patologic, nu este bine cunoscută. Am demonstrat recent că autofagia podocitelor este independentă de ținta mecanicistă a reglării rapamicinei (mTOR) în condiții fiziologice, făcând din acest tip de celulă o excepție. Activarea AT1 stimulează sinteza proteinelor și turnover-ul proteinelor în celule. Astfel, am motivat că activarea RAAS poate influența, de asemenea, stimularea turnover-ului proteinelor și proteostaza.

În studiul de față, ne-am concentrat asupra rolului semnalizării AnglI în reglarea autofagiei podocitelor. Am identificat proteazele calpaine activate de calciu care mediază un efect de blocare cronică al AnglI asupra autofagiei podocitelor. În plus, am descoperit că inhibitorul endogen al calpainei calpastatin a fost capabil să prevină inhibarea autofagiei dependente de AngI și leziunile podocitelor în timpul hipertensiunii.

Aceste descoperiri descoperă un mecanism original prin care hipertensiunea mediată de AnglI inhibă autofagia prin recrutarea calpainei indusă de calciu, cu consecințe patogene în caz de dezechilibru prin activitatea calpastatinei.

METODE

animale

Șoarecii transgenici cu calpastatină (CST18) au fost furnizați cu amabilitate de Dr. E. Letavernier. Șoarecii cu o perturbare specifică podocitelor a Atg5) au fost generați ca gena descrisă anterior (Nphs2.cre Atg5'o prin încrucișarea șoarecilor Nphs2.cre cu Ag5lxlomice5 pe fundalul C57BL6/J. Șoarecii Nphs2.cre Atg5'oxlox și masculii de așternut control). , cu vârsta cuprinsă între 10 și 12 săptămâni, au fost utilizate în acest studiu. Modelul hipertensiv a fost indus prin perfuzia sc de AnglI (Sigma-Aldrich, A9525) la o doză de 1 ug/kg/min timp de 4 până la 6 săptămâni prin minipompe osmotice (Alzet Corp, model 2006). Pompele au fost implantate în spatele dintre omoplați și șolduri. Șoarecii au primit supliment de sare (3% NaCl) în alimente. Soarecii Atgsloxilox (de tip sălbatic [WT]) au fost utilizați ca martori în toate studiile. Pentru sare de acetat de deoxicorticosteron (DOCA) cu modelul de reducere a nefronului, șoarecii masculi adulți au suferit nefrectomie stângă unilaterală. La două săptămâni după nefrectomie, au primit granule DOCA cu eliberarea de 21-zi (Innovative Research of America) implantat sc Un al doilea pelet a fost implantat la 3 săptămâni după primul implant.Toţi şoarecii re au primit 0,9 la sută NaCl în apa potabilă ad libitum și au fost uciși după 6 săptămâni de administrare DOC.6 Experimentele au fost efectuate în conformitate cu ghidurile veterinare franceze și cele formulate de Comunitatea Europeană pentru utilizarea animalelor de experiment (L358-86/609EEC) și au fost aprobate de Ministerul francez al Cercetării și de comitetul local de etică a cercetării universitare (APAFIS-7646 și -22373).

Experimentul de cultură primară a podocitelor

Podocitele primare diferențiate au fost cultivate așa cum s-a descris anterior./Pe scurt, cortexul renal proaspăt izolat a fost amestecat și digerat de colagenaza I (Gibco, {{0}}) în Roswell Park Memorial Institute 1640 (Life Technologies,{{2} }}). Țesuturile au fost apoi trecute prin filtre de celule de 70 μm și 40 μm (BD Falcon, 352340 și 352350). Glomerulii, care aderă la sita de celule de 40 um, au fost îndepărtați cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS; Life Technologies, 10010023) plus albumină serică bovină 0,5% (Eurobio, HALALB07-65) injectată sub presiune și apoi au fost spălate de două ori în PBS. Glomerulii proaspăt izolați au fost plasați în vase de 6-godeuri în Roswell Park Memorial Institute 1640 (Gibco, 61870036) suplimentați cu 10% ser fetal de vițel și 1% penicilină/streptomicina (Life Technologies, 15140122) pentru a permite evacuarea podocitelor din glomeruli. si creste. Îmbogățirea podocitelor a fost verificată prin analiză Western blot ca anterior (Figura suplimentară S1). Podocitele au fost cultivate în absența sau prezența bafilomicinei Al (100 nmol/, Sigma-Aldrich, B1793) timp de 4 ore. Pentru experimentele de imunofluorescență, podocitele primare au fost placate pe etichete cu 4 vase (Dutcher, 055071). Podocitele au fost apoi fixate în paraformaldehidă 4% timp de 10 minute și procesate pentru imunofluorescență.

Testul activității calpainei

Activitatea intracelulară a calpainei a fost determinată în podocite primare, așa cum s-a descris anterior. Un total de 100,000 celule au fost cultivate în 24-cuve de cultură de țesuturi în godeuri în Roswell Park Memorial Institute 1640, suplimentate cu 10% ser fetal de vițel și 1% penicilină/streptomicina. După perioada de cultură indicată, mediul a fost înlocuit cu soluție de bicarbonat HEPES (KRH) Krebs-Ringer (pH 7,4) care conține 4 mM CaCl2, cu sau fără inhibitor de calpaină 10 uM-1 și incubat timp de 10 minute înainte de adăugare. de substrat calpaină 50 mM N-succinil-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-metilcumarină (Sigma-Aldrich, S6510). După o perioadă de 90-minut de incubație, activitatea cal-painei a fost determinată ca diferență între fluorescență (măsurată la 360 nm de excitare și 430 nm de emisie) cu și fără inhibitor de calpaină-1.

Western blot

Podocitele primare au fost zgâriate cu 80 ul de tampon de testare de radio-imunoprecipitare care conținea fosfatază și inhibitor de protează. Concentrația de proteine ​​a fost măsurată cu Kit-ul de testare a proteinelor BCA (Merck Biochemistry, 71285). Douăzeci de micrograme de proteine ​​au fost supuse electroforezei pe gel prefabricat Criterion XT (12% Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). Proteinele au fost transferate pe membrana de poliviniliden difluorură (Thermo Fischer Scientific, 88518). După blocarea în lapte 5% în Tris Buffer Saline 0,1% Tween (TBS-T), membranele au fost incubate cu iepure policlonal anti-LC3 (1:1000, Cell Signaling Technology, 2575), iepure policlonal anti-ATG5 (1:2000, Tehnologia de semnalizare celulară, 2630), anti-Sequestosome policlonal de cobai 1 (SQSTM1)/P62 (1:10.000, PROGEN, GP62), domeniul policlonal anti-calpaină de iepure 1 IV (1:1000, Abcam, ab39170) ), iepure policlonal anti-calpaină 2 amino-terminal capăt al domeniului I (1:1000, Abcam, ab39165), șoarece monoclonal IgG1 anti-calpaină 4 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc-32325), iepure anti-podocină (1:1000, Abcam, ab50339), anticorp anti-nefrină de cobai (1:500, PROGEN, GP-N2) și anticorp monoclonal anti-tubulină de șobolan (1:5000, Abcam, ab6160). După spălare, membranele au fost incubate cu anticorpi legat de peroxidază de hrean (1:2000, Cell Signaling Technology, 7074,7076,7077). Detectarea semnalelor specifice a fost efectuată utilizând kitul ECL chemiluminescent (Bio-Rad, 170-5070) pe un dispozitiv LAS 4000 (Fuji). Pentru cuantificare a fost utilizată analiza densitometrică cu software-ul ImageJ (National Institutes of Health).

Măsurătorile tensiunii arteriale și evaluările fiziologice

Tensiunea arterială sistolică a șoarecilor a fost înregistrată folosind metoda manșetei cozii (Visitech Systems Inc., BP-2000). Au fost luate zece măsurători de la fiecare șoarece și apoi a fost determinată o valoare medie. Tensiunea arterială sistolică a fost măsurată la momentul inițial (vârsta de 12 săptămâni) și apoi săptămânal până la sfârșitul perioadei de tratament. Toți șoarecii au fost plasați în cuști metabolice cu acces liber la apă pentru o colectare de urină de 6-oră. Concentrațiile urinare de creatinina și ureea plasmatică au fost analizate spectrofotometric folosind o metodă colorimetrică (Olympus, AU400). Excreția urinară de albumină a fost măsurată utilizând un test imunoabsorbant specific legat de enzime pentru determinarea cantitativă a albuminei în urina de șoarece (Crystal Chem, 80630).

Histologie

Rinichii au fost recoltați și fixați în formalină tamponată cu PBS 4%. Secțiunile încorporate în parafină (3-um grosime) au fost colorate cu tricromul Masson pentru a evalua morfologia rinichilor. Anomaliile rinichilor au fost clasificate pe baza prezenței și severității anomaliilor componente, inclusiv glomeruloscleroza, expansiunea mezangială, atrofia sau gipsurile tubulare și fibroza. Proporția de glomeruli sclerotici a fost evaluată printr-o examinare oarbă a cel puțin 50 de glomeruli pe secțiune de rinichi.

Colorarea prin imunofluorescență a secțiunilor de rinichi și a podocitelor primare

Podocitele primare fixe au fost blocate în TBS-T 3% albumină serică bovină și incubate peste noapte la 4 grade cu anticorpi primari de cobai anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C) și iepure anti-verde proteină fluorescentă (GFP; 1:500, Abcam, ab290). După clătiri TBS-T, anticorpii secundari conjugați cu fluorofor de măgar anti-cobai IgG AF594-anticorp conjugat (Jackson ImmunoResearch,706-585-148) și anticorpi conjugați de măgar anti-iepure IgG{488-( S-a aplicat Invitrogen, A21206). Imaginile au fost realizate folosind un microscop fluorescent Zeiss 2, o cameră AxioCam HRc și software-ul Axiovision 4.3.

Pentru rinichii încorporați în parafină (FFPE) fixați în formalină, secțiunile (3 um) au fost deparafinizate și hidratate și extragerea antigenului a fost efectuată în tampon citrat încălzit (pH 6). Secțiunile au fost apoi permeabilizate cu Triton 0,1% (Euromedex) și blocate în TBS-T3% albumină serică bovină înainte de incubarea anticorpilor peste noapte la 4 grade. Am folosit anti-nefrină de capră(1:100, PROGEN, GP-N2), cobai anti-SQSTM1/P62(1:1000,PROGEN, GP-62C), iepure anti-GFP (1:1000, Abcam, ab290), anticorp de capră anti-Podocalyxin (PODXL; 1:1000, Bio-Techne, AF-1556) și iepure anti-Wilm's Tumor 1 (WT1;1:100, Abcam, ab192). Anticorpii secundari au fost Alexa 488- și Alexa 568-anticorpi conjugați de la Invitrogen. Nucleii au fost colorați în albastru folosind Hoechst. Lamele au fost montate folosind un mediu de montare fluorescent (Dako, S3023). Fotomicrografiile au fost realizate cu un fotomicroscop Zeiss Axiophot și software-ul Axiovision. Cuantificările semiautomate pe Fiji au fost utilizate pentru cuantificări de nefrină pozitivă și PODXL plus zone pe secțiune glomerulară pe cel puțin 30 de glomeruli per șoarece. Numărul de podocite a fost numărat ca numărul de nuclei WT1 plus per secțiune glomerulară pe cel puțin 30 de glomeruli per șoarece.

Procedura de microscopie electronică cu transmisie

Bucăți mici din cortexul renal (1 mm) au fost fixate în glutaraldehidă EM de 3 procente (Electron Microscopy Sciences) timp de 1 până la 30 zile și spălate de trei ori în PBS. Probele au fost postfixate în te-troxid de osmiu 1% 0,1 M (Electron Microscopy Science) în 0,1 M PBS (pH 7,4) și spălate în apă. Probele au fost deshidratate în grade de alcool și oxid de propilenă 100% (Electron Microscopy Science). Infiltrarea cu rășină a fost efectuată după cum urmează: se amestecă Epikote 812 și propilenoxidul într-un raport de 1:1 timp de 30 de minute, urmat de amestecarea Epikote 812 și propilenoxidul într-un raport de 1:2 pentru temperatura camerei peste noapte. Probele au fost încorporate în capsule de gelatină de 4 mm în Epikote 812 100% și polimerizate într-un cuptor încălzit la 60 de grade C. Secțiuni ultrasubțiri au fost tăiate cu un ultramicrotom UFC7 (Leica Microsystems GmbH) și depuse pe Gilder Grids 200 mesh (Electron Microscopy Science). Au fost contracolorate cu acetat de uranil 7% (distribuție LFG) și citrat de plumb Reynolds (LFG). Probele au fost examinate în microscopul electronic cu transmisie JEM1011 (JEOL) cu camera CCD Orius SC1000 (Gatan), operată cu software-ul Digi-talMicrograph (Gatan) pentru achiziție.

Reacție cantitativă a polimerazei în lanț

Glomerulii proaspăt izolați au fost congelați în reactiv QIAzol Lysis (Qiagen) la -80 grade . Extracția totală a ARN-ului folosind metoda pe bază de fenol a fost procesată conform recomandărilor producătorului. ADNc-urile au fost sintetizate utilizând kitul RT²First Strand (Qiagen, 330401) și reacția în lanț a polimerazei (PCR) în timp real a fost efectuată folosind o matrice personalizată RT²Profiler PCR （ Qiagen, CLAM36771C) cu RT'SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 330502). Plăcile PCR cantitative au fost rulate pe un ciclu Applied Bio-systems StepOnePlus. Fiecare matrice conține controlul calității pentru eficiența transcripției inverse și contaminarea ADN-ului genomic. Analiza PCR cantitativă a fost efectuată folosind metoda 2-△△CT cu ajutorul Centrului de analiză a datelor GeneGlobe (www.Qiagen.com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) și exprimat ca modificarea pliului Log2 în expresia genei.

Analiza proteomică in silico

Predicția in silico a locului de clivaj calpainei a fost făcută cu DeepCalpain (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org) și CaMPDB (http:// calpain.org/)instrumente online. Secvența de aminoacizi a proteinei de șoarece a fost obținută de la Uniprot (https://www.uniprot.org). Rezultatele sunt reluate în tabelele suplimentare S1 și S2.

analize statistice

Toate graficele reprezintă valori individuale și media ± SEM. Analizele statistice au fost efectuate folosind software-ul GraphPad Prism, versiunea 9. Comparația între 2 grupuri a fost efectuată folosind un test t Student parametric atunci când probele au trecut testele de normalitate Anderson-Darling și D'Agostino și testul F pentru egalitatea varianței. În caz contrar, a fost utilizat un test neparametric Mann-Whitney. Comparația între mai multe grupuri a fost efectuată utilizând analiza varianței 1-mod sau 2-mod, urmată de un test de comparație multiplă cu corecția Sidak. Valorile lui P<0.05 were="" considered="" significant.=""><><><>

Figura 1| Angiotensina I (Angel) plus hipertensiunea indusă de dieta bogată în sare (HSD) inhibă autofagia glomerulară. (ac)

Imunofluorescența Podocalyxin (PODXL; roșu) și P62 (verde) în glomeruli (a, a') de la șoareci de tip sălbatic (WT), (b, B) de la șoareci WT după 6 săptămâni de Angel plus HSD și (c) de la șoareci Nphs2.cre Atgsl/ox care prezintă acumularea de P62 în podocite în timpul hipertensiunii și la șoareci cu deficit de ATG5-podocite specifici. Capurile săgeților indică P62 plus puncte în WT în (a'). Nucleele au fost contracolorate cu Hoechst (albastru). Subpărțile figurii cu prim indică o mărire mai mare. Bare =50 μm. （d）Cuantificarea asociată a P62 plus este exprimată ca procent din zona glomerulară.n =4 șoareci WT și n=5 WT cu Angel plus HSD și șoareci Nphs2.cre Atgsoxlo. Valorile sunt prezentate ca diagrame individuale și media ± SEM. Testul Mann-Whitney:*P= 0.0159.

Angel plus hipertensiunea indusă de dietă bogată în sare a inhibat autofagia podocitelor

Podocitele prezintă un nivel ridicat de autofagie in vivo, așa cum se arată prin expresia puternică a GFP la șoarecii transgenici cu fuziunea GFP cu LC3 (șoareci GFP-LC3), un marker cheie al autofagiei (Figura suplimentară S2A). Autofagia este un proces dinamic cu formarea constantă a autofagozomilor și degradarea autofagolizozomilor. Blocarea degradării autofagozomale cu clorochină a dus la acumularea de puncte GFP plus, indicând un flux autofagic ridicat în podocite (Figurile suplimentare S2A și B). Confirmarea faptului că punctele GFP plus erau autofagozomi a fost demonstrată prin imuno-fluorescență dublă pentru GFP și SQSTM1/P62, o proteină însoțitoare degradată de autofagie (Figura suplimentară S2C și D). Din nou, tratamentul cu clorochină a indus acumularea de GFP plus P62 plus puncte, demonstrând un flux autofagic important în podocite. În cele din urmă, fluxul autofagic ridicat a fost conservat in vitro, așa cum se arată prin expresia GFP și P62 în podocitele primare izolate de la șoarecii GFP-LC3 și acumularea puternică de puncte GFP plus și P62 plus sub tratament cu bafilomicina Al, un alt blocant al degradării autofagozomale (Figura suplimentară S2E- H).

Capacitatea hipertensiunii arteriale de a modula răspunsurile autofagice ale podocitelor a fost apoi evaluată la șoarecii cărora li s-a administrat AngII cu o dietă bogată în sare (HSD) timp de 6 săptămâni și la martori non-hipertensivi. După cum se arată în Figura 1, AnglI plus HSD a indus acumularea P62 în glomeruli cu acumulare puternică în podocite, sugerând astfel că Angl plus HSD a fost responsabil pentru blocarea autofagiei podocitelor (Figura teren). În mod interesant, acumularea P62 în podocite a fost similară cu cea observată la șoarecii cu deficit de autofagie a podocitelor (șoareci Nphs2.cre Atg5'olox). Într-un alt model de hipertensiune arterială, modelul DOCA-sare, am observat și acumularea progresivă de P62 în podocite de-a lungul cursul în timp al bolii (Figura suplimentară S3).

Eliminarea Atg5 în mod specific în podocite are ca rezultat creșterea albuminuriei, pierderea podocitelor și leziuni glomerulare în modelul Angel plus HSD

Apoi am examinat dacă blocarea autofagiei numai la podocite (șoarecii Nphs2.cre Atg5laxlox) afectează leziunea glomerulară în modelul AnglI plus HSD. Am confirmat mai întâi că Nphs2. Șoarecii cre Atg5 au avut tensiune arterială normală, funcție renală normală și nicio leziuni histologice glomerulare până la vârsta de 10 luni, așa cum s-a raportat anterior (Suplimentary lox (WT) și Nphs2.cre Atgslox Figura S4).2 Apoi, șoarecii Atg5'cl au fost perfuzați cu AngII cu HSD timp de 6 săptămâni. Important, tensiunea arterială sistolica a fost similară în cele 2 grupuri după perfuzia AnglI pe parcursul studiului (Figura 2a), deși metoda coadă-manșetă utilizată pentru măsurarea tensiunii arteriale ar putea să nu aibă capacitatea de a rezolva diferențele mici de tensiune arterială. Infuzia de Angl cu HSD a crescut semnificativ raportul albumină urinară-creatinină la șoarecii WT, iar acest efect a fost crescut semnificativ la șoareci (Figura 2b). Șoarecii hipertensivi Nphs2.cre Atg5lox/lox Nphs2.cre Atgsoxlox au prezentat, de asemenea, o scleroză glomerulară semnificativ crescută în comparație cu tovarășii WT (Figura 2c-e). În acord cu proteinuria măsurată, gipsurile proteice și dilatația tubulară au fost semnificativ mai răspândite la șoarecii cu deficiență de podocite în ATG5 (Figura 2f-h).

Numărul de podocite per glomerul a scăzut semnificativ în Nphs2.cre Atg5loxlox (Figura 2i-k). Leziunea podocitelor la șoarecii Nphs2.cre Atgsoxlo cu perfuzie de AngII plus HSD a progresat chiar la glomeruloscleroza focală și segmentară, așa cum se arată prin expresia celulei epiteliale parietale (PEC). ) marker de activare CD44 în glomeruli (Figura 2l și m). Analiza microscopiei electronice a identificat modificări semnificative asociate cu deficiența ATG5 la perfuzia cronică de AngII cu HSD, inclusiv ștergerea procesului piciorului la... șoareci. În schimb, puține Nphs2 ultrahipertensive. cre Atg5'oxlx defecte structurale au fost găsite în podocite de la șoareci WT chiar și după 10 săptămâni de perfuzie AngII cu HSD (Figura 2n și o), indicând faptul că activitatea autofagică a podocitelor este necesară pentru rezistența lor la Angel plus leziuni induse de HSD. În total, rezultatele noastre au indicat că, în modelul AnglIl plus HSD, inhibarea autofagiei agravează leziunea și pierderea podocitelor și induce glomeruloscleroza focală și segmentară ulterioară.

Figura 2|Ștergerea Atg5 în mod specific în podocite are ca rezultat o creștere semnificativă a albuminuriei, leziunii renale și pierderea podocitelor după 6 săptămâni de perfuzie cu angiotensină Il(Angel) plus dietă bogată în sare (HSD). (a) Tensiunea arterială sistolică la șoarecii Atgslo/b și Nphs2.cre Ataslo pe parcursul a 36 de zile de șoareci Angel plus HSD.n =9 per genotip. Valorile sunt prezentate ca medie ± SEM. Analiza bidirecțională a varianței (ANOVA): ns. La (bm),n =10 șoareci pe genotip. În (b,g,h,k), valorile sunt prezentate sub formă de diagrame individuale și medie± SEM.(b) Angel plus HSD (continuare

Figura 3| Expresia și activitatea calpainei în podocite. (a) Analiza Western blot a expresiei calpainei-1.calpainei-2 și calpainei-4 în podocite primare. Expresia tubulinei servește ca normalizare. (b) Activitatea calpainei a fost măsurată pe podocite primare tratate sau nu cu angiotensină ll (Angel; 100 nM) timp de 24 de ore cu sau fără calpeptină (10 uM), n =5 experimente independente. Valorile sunt prezentate ca diagrame individuale și media ± SEM. Analiza unidirecțională a varianței (ANOVA): tratament, P=0.0035.Testul de comparație multiplă Sidak:*P{=0.0128 pentru Angll față de valoarea de bază," P=0.0056 pentru Angll plus calpeptină versus Angll.(c) Activitatea calpainei a fost măsurată pe podocite primare de la șoareci de tip sălbatic (WT) sau transgenici cu calpastatină (CST') tratați sau netratați cu Angel (100 nM) timp de 24 de ore. n {{18} } experimente independente. Valorile sunt prezentate sub formă de diagrame individuale și medie ± SEM. ANOVA bidirecțională pereche pentru genotipul de tratament. P= 0.0483. Testul de comparație multiplă Sidak:**P{=0.0009 pentru WT Angll față de linia de bază,*P=0.0420 pentru CST'9 Angll față de linia de bază, *P=0.0424 pentru WT față de CST9 Angll.

Vă rugăm să faceți clic aici pentru partea 2