A lua legatura:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Vă rugăm să faceți clic aici pentru partea 1

Vă rugăm să faceți clic aici pentru partea 3

Cistanche poate îmbunătăți memoria

Având în vedere aceste constatări, am examinat în continuare dacă expresia hipocampului miR-466f{-3p reglată la șoareci la învățare spațială șimemorieformarea a afectat și morfologia neuronală in vivo. În mod semnificativ, am constatat că densitatea medie a coloanei vertebrale a neuronilor hipocampali ai șoarecilor GLN a fost mai mare decât a șoarecilor PLN, așa cum a relevat prin impregnarea Golgi a piramidei.

Figura 3. Efectele modificării nivelurilor de expresie miR-466f{{-3p ale hipocampului asupra performanței MWM la șoarece

(A) Cronologia experimentală a sarcinii MWM, analiza expresiei sau măsurarea electrofiziologică a creierului șoarecelui după injectarea de lentivirus.

(B) Panouri din stânga: expresia dsRed în hipocampul șoarecelui. Imagini IF reprezentative cu mărire scăzută și mare ale hipocampului de la șoareci infectați cu lentivirusuri recombinate care exprimă dsRed-only ca martor (coloana stângă a imaginilor) sau miR-466f{-3p plus dsRed (dreapta). coloana de imagini). Zonele în casete din primele două imagini sunt mărite și afișate mai jos. Bare de scară, 100 mm. Liniile punctate indică limitele DG. Nucleii au fost colorați cu DAPI. GCL, strat de celule granulare; ML, strat molecular. Histograma dreaptă, niveluri relative de expresie ale miR-466f{-3p în hipocampul de șoarece infectat cu lentivirus care exprimă control sau miR{-466f{{-3p, așa cum a fost testat prin RT-qPCR ( n=16 per grup).

(C) Performanțe MWM ale șoarecilor infectați cu diferite lentivirusuri recombinate, ambalate cu utilizarea a cinci plasmide diferite care exprimă dsRed-only, miR-466f{-3p, mut-miR-466f{ {5}}p și, respectiv, bureții miR/SCR, în hipocampul lor (n=13, 26, 16, 19 și, respectiv, 11 per grup). Panoul din stânga: latența de evacuare în timpul antrenamentului. Panoul din dreapta: latența de evadare individuală la a 6-a sesiune.

Datele prezentate în (B) sunt prezentate ca medie ± SD, iar datele prezentate în (C) sunt prezentate ca medie ± SEM. Semnificația statistică a fost evaluată prin testul t nepereche (B), ANOVA în două căi cu comparație post hoc Bonferroni (C, panoul din stânga) sau one-ANOVA cu testul post hoc al lui Tukey (C, panoul din dreapta). Diferențe statistice: #p < 0.05,="" **/##p="">< 0,01="" și="" ****p="">< 0,0001;="" *mir-466f{-3p="" față="" de="" alții;="" #mir-burete="" versus="">

neuronii din hipocampul șoarecelui GLN și PLN (Figura S3). Aceste descoperiri demonstrează că reglarea în sus a hipocampului miR-466f{{-3p promovează creșterea neuritei și formarea coloanei dendritice, ceea ce este similar cu inducerea densității coloanei vertebrale observată în hipocampul șoarecilor GLN în comparație cu șoarecii PLN.

miR-466f{-3p modulează pozitiv învățarea spațială a mouse-ului șimemorieperformanța, precum și plasticitatea sinaptică

Pentru a investiga dacă miR-466f{-3p reglează pozitiv învățarea spațială a mouse-ului șimemorieformarea, am folosit o abordare a infecției cu lentivirus recombinant pentru a supraexprima miARN în hipocampul șoarecelui. Șoarecii au fost analizați la 7 zile după injectarea de lentivirus în DG (Figura 3A). Imaginile reprezentative ale nivelurilor de expresie a șoldului ale miR-466f{-3p au fost într-adevăr crescute în grupul de supraexpresie miR{-466f{-3p comparativ cu grupul de control (histograma din dreapta în Figura 3B). Am descoperit că șoarecii cu supraexpresia hipocampală a miR-466f{{- 3p și supuși sarcinii MWM au prezentat latențe de evadare de 88 ± 5 s în prima sesiune și 19 ± 1 s în a șasea sesiune (roșu linie de puncte, Figura 3C), care au fost mai bune decât pentru șoarecii de control vectorial (linia neagră) sau șoarecii de control mutant (linia cerc roșu) și similare cu latențele de evadare ale șoarecilor GLN descrise în Figura 1A. În paralel, am examinat efectul pierderii funcției miR{-466f{-3p asupra învățării spațiale șimemorieprin inhibarea miR-466f{-3p folosind miR-burete. În special, performanța MWM a șoarecilor în care hipocampul miR-466f{-3p a fost prins de buretele miR a fost similară cu cea a șoarecilor PLN, adică ei nu au învățat să găsească platforma nici măcar prin ultima sesiune (linie pătrată verde continuă,

Figura 3C). În plus, șoarecii injectați cu lentivirus nu par să fi perturbat plasticitatea homeostatică, deoarece unii șoareci din fiecare grup au învățat sau cel puțin erau în proces de învățare în timpul ultimei sesiuni (Figura 3C, histograma din dreapta).

Având în vedere că supraexprimarea miR-466f{-3p în hipocampul șoarecelui le-a îmbunătățit învățarea șimemoriecapacitatea, am analizat electrofiziologia comparativă a neuronilor hipocampali cultivați care exprimă diferite niveluri de miR-466f{-3p. Curentul postsinaptic excitator miniatural (mEPSC) de la neuronii hipocampali DIV14 care supraexprimă miR-466f{-3p sau mut-miR-466f{-3p, miR-burete sau control a fost înregistrate folosind cleme de plasture cu celule întregi. În timp ce nu au existat diferențe semnificative în amplitudinea mEPSC, creșterea Tau sau dezintegrarea Tau între cele patru seturi de probe, frecvența mEPSC a neuronilor care supraexprimă miR-466f{{-3p a fost semnificativ mai mare în comparație cu alte grupuri (Figura 4A), indicând faptul că receptorii glutaminergici postsinaptici au fost activați mai puternic la supraexprimarea miR-466f{- 3p.

Apoi am măsurat potențarea pe termen lung (LTP) pentru a determina direct rolul miR-466f{-3p în plasticitatea sinaptică in vivo. Am injectat hipocampusul șoarecilor cu lentivirus recombinant așa cum este descris în Figura 3 și apoi am indus LTP în felii de hipocamp prin stimularea tetanică (trei trenuri de stimulare de înaltă frecvență [3xHFS]) a căii colaterale Schaffer. Am descoperit că protocolul nostru a indus LTP în toate grupurile, așa cum demonstrează creșterea persistentă a potențialelor postsinaptice excitatoare de câmp (fEPSP) în regiunea cornu ammonis 1 (CA1) (Figura 4B, panoul din stânga). LTP a fost mai puternic în feliile care supraexprima miR-466f{-3p (188 la sută ± 2 la sută din valoarea inițială la 40-50 de minute după stimulare, medie ± SEM) comparativ cu mutantul (169 la sută ± 1 la sută din valoarea inițială), burete SCR (173 la sută ± 3 la sută din valoarea inițială) și felii infectate cu virus de control (159 la sută ± 2 la sută din valoarea inițială), ca inhibare miR-466f{-3p de către miR-sponge a redus LTP (128 la sută ± 1 la sută din valoarea inițială) în raport cu controalele (Figura 4B, panoul din dreapta). De asemenea, am măsurat LTP-ul grupurilor GLN și PLN după antrenament. Datele respective au evidențiat, de asemenea, diferențe semnificative în panta fEPSP în regiunea CA1 între grupurile GLN și PLN (Figura 4C). Astfel, un nivel ridicat de miR-466f{-3p îmbunătățește LTP și plasticitatea sinaptică care, la rândul său, poate promova învățarea șimemoriecapacitatea șoarecilor. Împreună, datele prezentate în figurile 2, 3 și 4 demonstrează că miR-466f{-3p joacă un rol pozitiv critic în învățarea spațială șimemorieformarea, probabil prin îmbunătățirea formării coloanei vertebrale, a LTP și a rezistenței plasticității sinaptice.

ARNm Mef2a este o țintă de reglementare a miR-466f{-3p

Am efectuat o analiză bioinformatică pentru a identifica potențialele ARNm țintă reglementate prin legarea miR-466f{-3p la cele 30 de UTR ale acestora. Printre candidații pe care i-am identificat a fost ARNm Mef2a care codifică MEF2A. Interesant, s-a constatat anterior că expresia MEF2A a fost reglată în jos după antrenamentul MWM, iar supraexprimarea acestui factor a exercitat un efect negativ asupra performanțelor șoarecilor (Cole și colab., 2012). Prin urmare, am folosit un test de raportare a luciferazei pentru a examina dacă miR-466f{-3p reglează traducerea ARNm Mef2a prin legarea la 30 UTR al acestuia. Am inserat secvențe Mef2a 30 UTR de tip sălbatic sau mutant în aval de un ADNc de luciferază SV40-controlat de promotor (Luc), rezultând plasmida reporter psiCHECK2-MEF2A 30 UTR sau psiCHECK2- mut-MEF2A 30 UTR (Figura 5A). După cum se arată în histograma din stânga din figura 5B, co-expresia miR-466f{-3p a atenuat expresia luciferazei direcționată de Mef2a 30 UTR. Acest efect părea să fie dependent de interacțiunea dintre miR-466f{-3p și Mef2a 30 UTR, deoarece mutația fie a site-ului de legare prezis al miR{-466f{-3p pe Mef2a 30 UTR (50-UGU-GUAU-30) sau regiunea de însămânțare a miR{-466f{-3p (50-AUACACA-30) recunoașterea Mef2a 30 UTR a abrogat efectul inhibitor al miR-466f{{-3p asupra activității luciferazei (Figura 5B, histograma mijlocie). În plus, co-exprimarea buretelui miR, dar nu a buretelui CR, a eliminat și efectul represiv al miR{-466f{{-3p asupra activității luciferazei (Figura 5B, histograma din dreapta). În mod remarcabil, nici supraexprimarea miR{-466f{{{-3p, nici miR-burete nu au avut vreun efect asupra nivelurilor de ARNm Mef2a în neuronii hipocampali primari (Figura 5C), dar au redus sau, respectiv, au crescut nivelul proteinei MEF2A (Figura 5D). De asemenea, am constatat că supraexprimarea miR{-466f{{-3p sau, respectiv, miR-burete, a reglat în jos sau a suprareglat nivelul mARN al proteinei asociate citoscheletului (Arc) reglată de activitate în neuronii hipocampali primari (Figura 5C) , care a fost o țintă cunoscută în aval, reglementată pozitiv de MEF2A (Flavell și colab., 2006)

De asemenea, am efectuat hibridizare in situ prin fluorescență (FISH) pentru a detecta miR-466f{{-3p și am combinat-o cu etichetarea IF a MEF2A în neuronii hipocampali primari DIV14 fără sau cu tratament cu forskolină. Se știe că forskolina induce LTP chimic și activează adenilil ciclaza, crescând astfel nivelul cAMP intracelular. Am observat colocalizarea nucleară a MEF2A cu miR-466f{- 3p, așa cum este ilustrat de imaginile reprezentative din Figura 5E. După stimularea cu forskoline, totuși, semnalul miR-466f{{{-3p a crescut atât în ​​soma, cât și în dendrite, în timp ce semnalul MEF2A în

nucleul s-a diminuat, după cum arată modificările reciproce ale intensităților semnalelor MEF2A și, respectiv, Fast Red ale celulelor neuronale individuale (Figura 5E). În concluzie, datele din figurile 5A–5E indică faptul că miR-466f{{-3p reglează negativ expresia proteinei MEF2A prin legarea la 30 UTR al ARNm Mef2a și, în consecință, reprimând traducerea acesteia.

În conformitate cu rezultatele descrise mai sus, am constatat că nivelurile hipocampale ale proteinei MEF2A au fost reglate în jos la șoarecii GLN după antrenamentul MWM, dar nu și la șoarecii PLN (Figura 5F). În plus, nivelurile relative de MEF2A la șoarecii GLN individuali (puncte) și șoarecii PLN (pătrate) au fost invers corelate cu nivelurile de miR-466f{-3p (R=0.60, Figura 5G). Astfel, modele eterogene de învățare spațială șimemoriecapacitatea sunt modulate de creșterile stocastice ale hipocampului miR- 466f{-3p la șoareci individuali și scăderea ulterioară a MEF2A la stimularea activității neuronale.

Activarea stocastică a hipocampului CREB și, în consecință, suprareglarea transcripțională a clusterului miR- 466-669 în timpul antrenamentului MWM

Am investigat mecanismele prin care miR-466f{-3p în hipocampul șoarecelui ar putea fi reglat în mod stocastic de sarcina MWM. Există trei precursori de miARN care codifică miR-466f{-3p, toți aparținând grupului miR-466-669 specific rozătoarelor, situat în intronul 10 al genei gazdă, mSfmbt2 (Inoue și colab. ., 2017) (Figura 6A). Interesant, spre deosebire de miR-466f{-3p, nu a existat nicio diferență semnificativă în nivelurile de expresie ale mSfmbt2 între grupurile GLN și PLN (Figura 6B), sugerând că clusterul miR-466-669 ar putea codifica o transcriere separată în loc să facă parte din transcrierea primară a mSfmbt2. În consecință, am proiectat mai multe seturi de primeri pentru a identifica transcrierea primară presupusă a clusterului miR-466-669 prin RT-qPCR. După cum este descris în figura 6A, un fragment PCR lung (plus 282 la 2381), împreună cu o serie de benzi qPCR suprapuse, și anume A (plus 282 la 115), B (131 la 406), C (388 la 686), D ( 662 la 1.028), E ( 1.004 la 1.299), F ( 1.242 la 1.629), G ( 1.605 la 2.029) și H ( 2.005 la 2.381), au putut fi detectate în hipocampul șoarecelui, dar nu în partea I ( 2, 3706 ) ) (datele nu sunt afișate). Aceste date susțin faptul că clusterul miR-466-669 a codificat o transcriere lungă aproape de aproximativ 2.388 bp în amonte de primul precursor de miARN (adică pre-mir{-466m, notat plus 1 în Figura 6A). În mod remarcabil, similar cu ceea ce am găsit pentru miR{-466f{{-3p, nivelul mediu al acestei transcrieri în hipocampul șoarecilor GLN a fost mai mare decât pentru șoarecii PLN (Figura 6C). Astfel, învățarea îmbunătățită șimemoriecapacitatea șoarecilor GLN se datorează activării transcripționale a clusterului miR-466-669.

Activarea CREB nuclear prin fosforilare în timpul sarcinilor MWM sau în alte forme de învățare este un pas critic pentru transformarea pe termen scurt în pe termen lung.memorie(Lisman et al., 2018; Rogerson et al., 2014). Prin urmare, am investigat dacă nivelurile diferite de miR-466f{-3p printre șoarecii individuali care au suferit sarcina MWM ar putea fi corelate cu starea de activare a CREB. Pentru a explora această idee, mai întâi am examinat nivelurile de fosforilare ale CREB hipocampal la șoareci individuali. După cum se arată în Figura 6D, activarea CREB (prin fosforilare la reziduul S-133) a fost îmbunătățită la șoarecii GLN în comparație cu șoarecii PLN și HC. De asemenea, am confirmat că miR-466f{-3p a fost într-adevăr co-exprimat cu pCREB în neuroni prin efectuarea miARN ISH combinată cu colorarea IF a pCREB și MAP2 în neuronii hipocampali primari (Figura S2A). În plus, nivelurile de transcriere primară ale clusterului miR- 466-669 au fost corelate pozitiv cu pCREB la șoarecii GLN (R=0.52), în timp ce au fost corelate negativ cu pCREB la șoarecii PLN (R=0 .71) (Figura 6E). Am verificat o corelație între nivelurile unui alt factor activ, kinaza reglată de semnal fosfo-extracelular (pERK) și nivelurile de transcriere primară ale clusterului miR-466-669. Am descoperit că ambele tipuri de șoareci antrenați cu MWM au prezentat corelații pozitive între semnalul cluster miR-466-669 și pERK (R=0.59 și, respectiv, 0,48; Figura S4A) și nu a existat nicio diferență în pERK/ Expresia tERK între aceste două grupuri (Figura S4B). Pentru a clarifica în continuare impactul activării CREB asupra reglării transcripționale a grupului miR-466-669și, în consecință,

inductionofmiR-466f{-3p,weusedaspecificCREBinhibitor,666- 15 (Xie et al., 2015), în combinație cu tratamentul cu forskolin al neuronilor hipocampali primari DIV14. Se știe că forskolina activează fosforilarea CREB (Malhotra și colab., 2015). Am descoperit că pretratamentul neuronilor primari ai hipocampului cu 666-15 a blocat activarea CREB indusă de forskolină (Figura 6F) și a redus nivelurile de miR-466f{-3p și miR-466-669 cluster transcriere (Figurile 6G și 6H). Concomitent, nivelurile de ARNm ale genelor țintă pCREB cunoscute nurr1 și homer1a (Bridi și colab., 2017; Jensen și colab., 2017) au fost, de asemenea, reduse la tratamentul cu 666-15 (Figura 6H). Luată împreună, Figura 6 arată că activarea stocastică a CREB în hipocampul unei subpopulații de șoareci consangvini supuși sarcinii MWM induce transcripția clusterului miR-466-669 și, în consecință, inducerea miR-466f{{23 }}p, sporind astfel învățarea lor spațială șimemoriecapacitatea de a performa mai bine în sarcină.

DISCUŢIE

Am explorat posibilul rol al miRNA-urilor în modularea capacității variabile a învățării spațiale șimemorieprintre șoarecii C57BL/6J consangvini. Sugerăm că activarea stocastică a CREB și, în consecință, reglarea în sus a hipocampului miR-466f{-3p reprezintă o mai mare învățare spațială șimemoriecapacitatea unui subgrup de șoareci noștri de testare, probabil datorită inhibării translaționale miR{-466f{{-3p a ARNm Mef2a care codificămemorieregulator negativ MEF2A. Descoperirile noastre oferă un scenariu care demonstrează rolul funcțional și evolutiv al unui miARN specific în reglarea cunoașterii prin inducerea stocastică a unei axe CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A de către stimulii de mediu.

Sarcina MWM a fost utilizată pe scară largă pentru a examina capacitatea variabilă a învățării spațiale șimemoriepentru rozătoare. În condiții normale, rozătoarele folosesc indicii distale pentru a se orienta, permițându-le să învețe și să memoreze locația platformei ascunse în sarcină. Majoritatea șoarecilor noștri C57BL/6J consangviniți (62 la sută) au prezentat un model normal de latență de evadare, găsind platforma în 30 s de sesiuni a treia-6 (Figura 1A, GLN). În schimb, un grup de șoareci (38 la sută) nu a învățat sarcina nici până la a șasea sesiune (PLN). În special, am supus șoarecii la alte două teste de recunoaștere. Primul a fost testul de recunoaștere a obiectelor noi (NOR), care este un singur test bazat pe explorarea înnăscută fără întărire sau stres pentru a motiva comportamentul (Leger și colab., 2013). Corelația dintre sarcinile NOR și MWM în ceea ce privește performanța mouse-ului este slabă (R {{1{{20}}}}.13), ceea ce este similar cu corelația dintre performanțele NOR și nivelurile de expresie a hipocampului de miR-466f{-3p (R=0,01; datele nu sunt afișate). Testul NOR a evidențiat, de asemenea, nicio diferență în indicele de discriminare între grupurile MWM GLN și PLN (0,36 ± 0,25 față de 0,29 ± 0,18; Figura S1B). Cealaltă învăţare spaţială şimemorie-sarcina dependentă pe care am aplicat-o este labirintul Barnes (BM), care este similar cu MWM. Se bazează pe presupunerea că rozătoarele plasate într-un mediu aversiv ar trebui să învețe și să-și amintească locația unei cutii de evacuare situată sub suprafața platformei. După cum se arată în Figura S1C, am constatat că performanța șoarecelui în studiile cu sondele BM sunt, de asemenea, corelate pozitiv cu nivelurile de expresie hipocampală ale miR-466f{-3p. Astfel, inducerea axei CREB-pCREB-miR-466f{-3p-MEF2A în hipocamp în timpul învățării șimemorieformarea este dependentă de context spațial.