Partea 2: Receptorul canabinoid tip 2 promovează fibroza rinichilor prin orchestrarea semnalizării cateninei

Contact: emily.li@wecistanche.com

Figura 4| Complexul -arrestin 1(-arr1)/SRC proto-oncogene (Src) mediază activarea indusă de receptorul canabinoid tip 2(CB2) a semnalizării -cateninei(-cat). (a) Graficele reprezentative arată legarea CB2 cu -arr1 sau Src. UmanrinichiproximalătubularCelulele (HKC{0}}) au fost tratate cu amino chilindol (AM1241; 10 uM) singur sau cotratate cu XL-001(10 uM) timp de 24 de ore. Lizatele de celule întregi au fost imunoprecipitate cu un anticorp împotriva CB2 și blotate cu anticorpi împotriva -arr1 și Src. (Continuare)

Cistanche este bun pentru fibroza renală

CB2 amplifică semnalizarea Wnt prin promovarea căii -arrestin 1/Src/-catenina

După cum se arată în Figura 6a-c, expresia ectopică a CB2 sau Wnt1 a indus reglarea în sus a -arrestinei 1 și a fosfo-Src (Tyr15), o formă activă a Src. Nivelurile de expresie ale -arrestin 1 și fosfo-Src(Tyr416) ​​au fost îmbunătățite în continuare prin coexpresia CB2 și Intl. Apoi am efectuat co-antrenament pentru CB2 cu -catenina prin hibridizare in situ și imunofluorescență la șoareci UIRI cu coexprimarea CB2 și Wnt1. Aproape toate celulele tubulare CB2-pozitive au exprimat -catenina, implicând rolul potențial al -cateninei în calea CB2 (Figura 6d). Apoi am testat expresia -arrestinei 1 și a -cateninei active prin colorare prin imunofluorescență. După cum se arată în Figura 6e, CB2 a cooperat cu Wntl pentru a crește expresia lor. În plus, la șoarecii UIRI, activarea indusă de CB2-sau Wntl a -cateninei și a țintelor sale MMP-7 și Snail a fost crescută în continuare prin coexprimare unul cu celălalt (Figura 6f-i). Modelul de expresie similar al lui Kim-1, așa cum a fost evaluat prin imunohistochimie și analiza Western blot, a demonstrat, de asemenea, că CB2 a avut un efect de stimulare sinergică asupra leziunii tubulare induse de Wnt1-(Figura 6e, f și j).

Cistanchese poate îmbunătățirinichifuncţie

CB2 și Wnt1 exogen induc sinergic semnalizarea -cateninei și fibroza renală în nefropatia indusă de acid folic

Designul experimental detaliat este prezentat în Figura 7a. După cum se arată în figurile 7b și c, în indusă de acid folicrinichi, expresia ectopică a CB2 sau Wntl a indus reglarea în sus a CB2, iar nivelurile CB2 au fost crescute în continuare prin coexprimarea CB2 și Wntl. Am examinat apoi expresia -arrestinului 1 și fosfo-Src (Tyr416). După cum se arată în Figura 7d-g, CB2 și Wnt1 exogen au crescut sinergic expresia atât a -arrestinei 1, cât și a fosfo-Src. În plus, imunocolorarea -cateninei active a arătat că CB2 sau Wntl au crescut activarea -cateninei și au avut un efect de cooperare (Figura 7d). Rezultate similare au fost obținute atunci când expresia -cateninei active și țintele sale din aval MMP-7 și Snail au fost evaluate prin Western blot (Figura 7h-k). Nivelurile de expresie ale Kim-1, fibronectină și a-SMA, au fost reglate în sus prin expresia ectopică a CB2 sau Wnt1 și crescute în continuare prin coexpresia lor (Figurile 7h și l și 8a-c). Rezultate similare au fost obținute atunci când au fost evaluate colorația cu fibronectină, colagen I, Kim-1 și tricrom Masson (Figura 8d). Aceste rezultate sugerează în plus că CB2 joacă un rol activ în calea -cateninei indusă de -arrestin 1/Src.

Cistanchese poate îmbunătățirinichifuncţie

Reducerea -arrestinei 1 ameliorează semnalizarea -cateninei și fibroza renală la șoarecii UIRI induși de AM1241-

Apoi, am examinat rolul tăcere in vivo mediată de ARN-ul scurt a -arrestinului 1 la șoarecii UIRI injectați cu AM1241 (Figura 9a). Eficacitatea de tăcere a -arrestinei l a fost confirmată prin PCR cantitativă în timp real (Figura 9b). Administrarea de AM1241 a crescut și mai mult nivelul creatininei serice și a azotului ureic din sânge; cu toate acestea, distrugerea -arrestinei 1 a inhibat semnificativ aceste creșteri chiar și la șoarecii UIRI după administrarea AM1241 (Figura 9c și d). Cuantificarea colorației periodice cu acid Schiff (Figura suplimentară S3) a arătat că distrugerea -arrestinei 1 a fost foarte protejată împotriva leziunii tubulare induse de AM (Figura 9e). Rezultatele imunocolorării au arătat că scăderea -arrestinei 1 a inhibat expresia AM1241-reglată în sus (Figura 9f). În plus, rezultatele colorării fibronectinei, colagenului I și Kim-1 au confirmat și mai mult rolul protector al interferenței cu -arrestina 1 înrinichifibrogeneza(Figura 9g). Rezultate similare au fost observate atunci când expresia -cateninei active, MMP-7, Snail, fibronectin, a.-SMA sau Kim{-1 a fost evaluată prin analiza Western blot (Figura 9h-n). Interesant, am observat că declanșarea -arrestinului 1 a inhibat expresia CB2, sugerând o buclă de activare între CB2, -arrestin 1 și -catenină (Figura 9h și o). Colorarea tricromului lui Masson și cuantificarea zonei fibrotice au demonstrat în continuare -arrestin-1 tăcere a inhibat puternic AM1241-acceleratărenalfibroză(Figura 9g și p).

CB2 este o țintă în aval a -cateninei și facilitează o buclă de activare cu -catenina

Au existat mai multe copii ale site-urilor de legare a factorului de legare a factorului de amplificare a limfoidului / factorului de legare a celulelor T presupuse în regiunile promotoare atât ale genelor CB2 umane, cât și ale șoarecilor (Figura 10a). Celulele HKC-8 au fost transfectate cu trunchi N-terminal, marcate FLAG, activate constitutiv

Cistanchese poate îmbunătățirinichifuncţie