Partea 2: Sortilină carbamilata asociată cu calcificarea cardiovasculară la pacienții cu boli renale cronice

Contact: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

ClicAicipentru partea 2.

Sortilina carbamilata modifică legarea ligandului

Sortilina este un coreceptor pentru mai mulți liganzi.8 Carbamilarea lizinei modifică în mod semnificativ proprietățile catenei laterale ale lizinei, prin care gruparea amino încărcată pozitiv este înlocuită cu o grupare polară voluminoasă, afectând potențial legarea ligandului. Am examinat interacțiunile celor mai frecvent modificate lanțuri laterale de lizină de sortilină găsite încronic rinichiboala(secvență de aminoacizi [secvență de structură cristalină]), Lys95(62), Lys205(172), Lys260(227) și Lys294(261), prin modelare in silico pentru a prezice posibile consecințe structura-funcție ale carbamilării lizinei. Am folosit structura cristalină existentă a ectodomeniului sortilină atât din forma legată de neurotensină la pH neutru (fișier PDB Q24: 4PO7; Figura 3a), cât și din forma fără liganzi la pH acid (fișier PDB: 6EHO; Tabel suplimentar S5).

La pH neutru, Lys95(62) formează o punte de sare cu Glu609(576) și o legătură de hidrogen cu gruparea carbonil a lanțului principal a Arg90(57). La pH acid, interacțiunea cu Glu609(576) este mai strânsă, deoarece distanța dintre gruparea amino a lui Lys95(62) și gruparea carboxil a lui Glu609(576) permite acum formarea unei legături de hidrogen, în timp ce interacțiunea cu Arg90(57). ) nu este prezent. Prin urmare, carbamilarea la Lys95(62) poate destabiliza ambele conformații sortilinei. Astfel, carbamilarea la Lys205 ar favoriza probabil conformarea pH-ului acid a sortilinei. Lys294(261) nu are interacțiuni atât la pH neutru, cât și la acid.

Efectele cistanche: tratarea bolilor de rinichi

În cele din urmă, la pH neutru, Lys260(227) interacționează cu neurotensină-Tyr11 în situsul de legare a ligandului din tunelul b-propulsor al sortilinei. Deoarece structura sortilină cu pH acid nu are afinitate ligand, nu găsim interacțiuni ale catenei laterale Lys260(227) în această structură. Interacțiunea cu neurotensină Tyr11 va fi afectată de carbamilare și ar putea duce la o afinitate mai scăzută pentru neurotensină. Interleukina 6 (IL-6), un ligand de sortilină cunoscut,20 leagă sortilina prin coada sa C-terminală, care conține o arginină la poziția echivalentă a neurotensinei-Tyr11. Astfel, carbamilarea Lys260(227) ar putea crește probabil afinitatea pentru IL-6, un potențial contributor la calcificarea vasculară.

Studiile ulterioare de legare folosind spectroscopie de rezonanță cu plasmoni de suprafață și SortCo sau SortCarb au evidențiat legarea mai eficientă a IL-6 la SortCarb (KD ¼ 23 nM) în comparație cu Q25 cu SortCo nemodificat (KD ¼ 141 nM), sugerând sortilina carbamilată ca potențial IL -6 partener de legare (Figura 3b și c). Progranulina, un alt ligand de sortilină cunoscut,22 legat de SortCo, dar o legare de SortCarb nu a putut fi detectată (Figura suplimentară S7A și B). Atât SortCo, cât și SortCarb sunt legate de proteina asociată receptorului uman fuzionată cu o etichetă GST,23 dar nu numai de GST, susținând integritatea structurală Q26 a sortilinei indiferent de starea sa de carbamilare și demonstrând specificitatea cadrului nostru experimental (Figura suplimentară S7C- F).

Apoi, am evaluat dacă afinitatea modificată pentru IL-6 ar putea afecta căile de semnalizare implicate în calcificarea vasculară. În calcificarea hSMC-urilor, adăugarea IL-6 la SortCarb a promovat expresia ARNm ALPL și RUNX2 (Figura 3d și e), precum și activitatea TNAP (Figura 3f), în timp ce nu a avut niciun efect în combinație cu SortCo. Aceste date indică faptul că carbamilarea sortilinei crește capacitatea de legare a ligandului de IL-6, ceea ce determină creșterea calcificării celulelor musculare netede.

Carbamilarea sortilinei este asociată cu calcificarea vasculară încronicrinichiboalapacienți Pe baza datelor noastre cu care s-a descoperit că reziduurile de sortilină carbamilată se asociazăcronicrinichiboalași calcificarea, am studiat în continuarecronicrinichiboalaparticipanții la studiul CARVIDA, în care scanările tomografice computerizate au cuantificat CAC. La fel ca participanții la studiul CARE FOR Home, majoritatea participanților CARVIDA au avut 2 și 3 PTM, cu reziduurile de lizină 95 și 26 0 frecvent afectate (Figura suplimentară S8A). În comparație cu pacienții fără reziduuri carbamilate, pacienții cu 1 reziduuri de sortilină carbamil-lizină erau mai în vârstă (P ¼ 0.0{02), aveau eGFR mai scăzut (P ¼ 0,008), erau mai mari fumători frecvent (foști) (P ¼ 0,023) și au avut un volum CAC semnificativ mai mare (P <0,001; figura="" 4a="" și="" tabelul="" suplimentar="">

Ln-(CAC plus 1) la momentul inițial a corelat cu prezența și creșterea sortilinei carbamilate post-translaționale (Tabelul suplimentar S7). În plus, Ln-(CAC + 1) a fost, de asemenea, asociat cu sexul masculin, diabetul zaharat, medicamentele antidiabetice și hipolipemiante, vârsta mai mare, IL-6 seric și hemoglobina A1c și eGFR mai scăzut și lipoproteinele de înaltă densitate serice ( Tabelul suplimentar S7). Cu toate acestea, asocierea dintre reziduurile de sortilină carbamilată și Ln-(CAC + 1) a rămas semnificativă după ajustarea pentru toate variabilele menționate mai sus (P ¼ 0.029; Tabelul 3).

Efectele cistanche: tratarea bolilor de rinichi

Apoi, am evaluat dacă prezența reziduurilor carbamilate are un impact asupra progresiei CAC. Prezența sortilinei carbamilate (față de lipsa carbamilării) a crescut progresia CAC (P ¼ 0.047). Detaliat,cronicrinichiboalapacienții cu sortilină carbamilată (n ¼ 33) au prezentat o progresie semnificativ crescută a CAC pe o perioadă mediană de urmărire de 4,4 ani (Figura 4b), cu o creștere anuală a volumului median al CAC de 30.32 Q27 (interquartil). interval ¼ 84,0) (Figura 4C). În contrast,cronicrinichiboalapacienții fără carbamilarea sortilinei (n ¼ 8) au evidențiat o modificare anuală a volumului median al CAC de 1,63 (interval interquartil ¼ 8,54) și nicio progresie semnificativă a CAC în perioada de urmărire (Figura 4b și c). După ajustarea covariabilelor asociate cu progresia CAC (volumul de bază al CAC, vârsta, sexul, indicele de masă corporală, eGFR, diabetul zaharat, IL-6 seric, lipoproteinele de înaltă densitate serice și medicamentele hipolipemiante), starea de carbamilare a fost nu mai este asociat cu progresia CAC (P ¼ 0.286).

Pacienții cu reziduu de carbamil-lizină 260 au prezentat cea mai mare creștere a volumului CAC decât pacienții fără reziduuri carbamil-lizină, altele decât 260 (Figura suplimentară S8B).

În general, datele indică faptul că sortilina carbamilată post-translațională este asociată cu volumul CAC și cu progresia acestuia la pacienții cucronicrinichiboala.

DISCUŢIE

În diferite studii experimentale in vitro și in vivo și în 2 cohorte prospective independente, demonstrăm că pacienții cucronicrinichiboalaprezintă un model specific de reziduuri de lizină de sortilină carbamilată post-translațională în circulație, care pot fi detectate și în peretele vascular. În plus, carbamilarea sortilinei a fost asociată cu CAC încronicrinichiboalapacienți, indiferent de vârstă,rinichifuncția și alți factori de risc pentru calcificare. Din punct de vedere mecanic, am putea arăta că carbamilarea sortilinei crește capacitatea sa de a lega IL-6 și acționează direct asupra celulelor vasculare pentru a promova calcificarea vasculară (Figura 4d). Luat împreună, acest studiu a relevat un nou factor de risc netradițional pentru calcificare, care poate contribui la sarcina mare acardiovascularboli încronicrinichiboala.

Carbamilarea proteinelor poate fi mediată de cianat, care se dezvoltă în timpul descompunerii spontane a ureei sau este generat de oxidarea tiocianatului catalizat de mieloperoxidază la locurile de inflamație.24 Am arătat căcronic rinichiboalapacienţii cu niveluri mai mari de uree din cauza reduceriirinichiFuncția a prezentat mai multe reziduuri de carbamilare a sortilinei decât martorii sănătoși. Cu toate acestea, nu am găsit nicio asociere între nivelurile totale și activitatea mieloperoxidazei și carbamilării sortilinei, sugerând uremia ca factor principal pentru carbamilarea sortilinei încronicrinichiboala. În plus, datele noastre demonstrează că vârsta, NT-proBNP și un aport mai mic de antagoniști de aldosteron sunt asociate cu mai multe reziduuri carbamilate. Datele noastre sunt în concordanță cu rapoartele anterioare care au identificat îmbătrânirea ca un mediator semnificativ al carbamilării proteinelor.25 S-a demonstrat că medicamentele antihipertensive hidroclorotiazida și amlodipina afectează nivelurile de homocitrulină, un aminoacid legat de ciclul ureei și un produs derivat din carbamilare.26 Dacă aportul de antagoniști aldosteronului scade homocitrulina și, astfel, reduce reziduurile carbamilate încronicrinichiboalapacienți, este necunoscut. Drechsler și colab. a demonstrat o corelație între albumina serică carbamilată și NT proBNP, care a fost asociată cu insuficiența cardiacă în dependența de dializă.cronicrinichiboalaNu se știe dacă carbamilarea sortilinei poate servi și ca factor de risc pentru insuficiența cardiacă, dar calcificarea coronariană crescută cu potențial efecte nocive ulterioare asupra funcției cardiace ar putea explica asocierea dintre reziduurile de sortilină carbamilată și nivelurile de NT proBNP din studiul nostru.

Efectele suplimentului de cistanche: tratează bolile de rinichi și îmbunătățește imunitatea

Studii recente au identificat rolul sortilinei în patogeneza tulburărilor vasculare și metabolice, dar s-au concentrat în principal pe expresia tisulară a sortilinei, mai degrabă decât pe explorarea funcției formei solubile7. , 28–30 și din veziculele extracelulare secretate pline cu sortilină.9,31 Carbamilarea conduce la modificări ale proprietăților de sarcină, structurale și funcționale ale proteinelor, mediand pierderea funcției și răspunsurile celulare și moleculare potențial patofiziologice.5 Am stabilit pentru prima dată. timp un model specific de carbamilare a reziduului de lizină al sortilinei circulante încronicrinichiboala, folosind o abordare MS vizată și a prezis modificări funcționale și structurale prin modelare in silico. Propunem că carbamilarea lizinei va favoriza conformația pH-ului acid a sortilinei, afectând afinitatea ligandului dependent de pH a sortilinei. Studiile anterioare ale structurii cristaline au demonstrat că la pH 5,5, care reprezintă un mediu similar cu cel al endozomilor tardivi, sortilina suferă modificări conformaționale și formarea de dimeri, ceea ce face cunoscute locurile de legare indisponibile pentru legarea ligandului.32,33.

Lizina 260 formează o legătură de hidrogen cu o tirozină a neurotensinei în interiorul tunelului b-elicei, sugerând că alți liganzi care se leagă în mod similar cu neurotensinei ar fi, de asemenea, afectați. Investigația noastră a constatat o afinitate crescută a IL-6 pentru sortilina carbamilată, sugerând participarea la căile de semnalizare IL-6. Mai multe studii au sugerat că IL-6 poate contribui la calcificarea vasculară încronicrinichiboala.22,34,35 rol functional in patologia vasculara calcificata. Sortilina carbamilată solubilă a promovat calcificarea vasculară in vitro și ex vivo prin creșterea genelor țintă osteogene, a activității TNAP și a mineralizării matricei. Mai mult, adăugarea IL-6 la sortilina carbamilată a crescut și mai mult genele țintă osteogene și activitatea TNAP.

Carbamilarea a fost asociată cu alterarea matricei extracelulare36, stresul oxidativ25, disfuncțiile endoteliale37 și ateroscleroza38, toate implicate în inițierea și progresia calcificării. Deși Mori și colab. au raportat că carbamilarea proteinelor promovează calcificarea vasculară prin carbamilarea proteinelor mitocondriale6, nu au fost identificate proteine ​​țintă specifice. Un studiu recent a demonstrat că carbamilarea uromodulinei a dus la o pierdere a proprietăților sale anti-calcifice in vitro. 39 Ambele studii au folosit Western blot pentru a detecta carbamilarea în general. Am demonstrat că sortilina carbamilată in vitro imită modelul specific de modificare a lizinei in vivo găsit încronicrinichiboalapacienţii care utilizează SM. Astfel, studiul nostru oferă indicii asupra mecanismelor specifice de conectarecronicrinichiboala, carbamilarea proteinelor, IL-6 și calcificarea.

Anterior, nivelurile ridicate ale sortilinei serice au fost asociate atât cu calcificarea aortei abdominale, cât și cucardiovascularevents independent of traditional Framingham risk factors in a community-dwelling cohort of men aged >50 de ani.10 La pacienții cu dureri toracice cu risc scăzut sau mediu, nivelurile de sortilină nu s-au asociat cu severitatea bolii coronariene.40 În acest studiu, am putea arăta că pacienții cucronicrinichiboalaau niveluri de sortilină mai mari decât martorii cu normalrinichifuncţie. Nivelurile de Sortilin nu au crescut cu scăderearinichifuncţionează odată ce un pacient a avut ocronicrinichiboalacu eGFR<60 ml/min="" per="" 1.73="" m2.="" however,="" we="" observed="" an="" increase="" of="" carbamylated="" sortilin="" residues="" with="" decreased="">rinichifuncţie. În mod similar, Kalim și colab. nu a raportat nicio asociere între nivelurile de albumină totală și carbamilată încronicrinichiboalapacienţi.41 Carbamilarea sortilinei, rezultată din afectarearinichifuncția, ar putea crește în continuare calcificarea vasculară legată decronicrinichiboala-tulburări minerale asociate. Studiul nostru are mai multe puncte forte și limitări. Punctele forte includ analiza datelor obținute in vitro, ex vivo și la pacienți folosind diferite abordări experimentale. Caracterizarea atentă a pacienților cucronicrinichiboala, inclusiv chestionare standardizate pentru a evalua caracteristicile participanților, vizite de studiu în persoană efectuate de asistente de studiu instruite și măsurători ale multor valori de laborator și calcificare, este un punct forte al studiului. Cohorta mică poate părea să limiteze studiul nostru; cu toate acestea, am folosit independentcronicrinichiboalacohorte cu date de urmărire pentru calcificare pentru a valida starea de carbamilare a sortilinei prin SM țintită laborioasă. Descoperirile clinice au fost făcute în limba germanăcronicrinichiboalapacienți și pot limita astfel generalizarea constatărilor la alte țări sau etnii. În cele din urmă, deși designul studiului a permis ajustarea pentru mulți factori de confuzie importanți, confuzia reziduală, ca în orice studiu observațional, nu poate fi exclusă în totalitate.

Efectele cistanche: previne insuficiența renală

Concluzie

În concluzie, acesta este primul studiu care demonstrează aminoacizi specifici care sunt modificați post-translațional în sortilina circulantă. Datele noastre sugerează că prezența luicronicrinichiboalapromovează carbamilarea sortilinei circulante și că sortilina carbamilată prezintă proprietăți procalcifice, așa cum s-a demonstrat in vitro, ex vivo și prin prezența în țesutul calcificat. Carbamilarea sortilinei a fost asociată cu CAC, chiar și după ajustarea în funcție de vârstă,rinichifuncția și câțiva alți factori de risc, sugerând că prevenirea carbamilării sortilinei ar putea reduce riscul decardiovascularcalcificarea si astfelcardiovascularcomplicatii la pacientii cucronicrinichiboala. Astfel, rezultatele noastre indică sortilina carbamilată ca un contributor lacardiovascularpovara bolii încronicrinichiboalapacientii.

cistanche

REFERINȚE

Această sursă este de Vera Jankowski, IMCAR, Facultatea de Medicină, Universitatea RWTH Aachen, Aachen, Germania etc.