Partea 2: Reglarea epigenetică a genei circadiane Per1 contribuie la modificările legate de vârstă în memoria hipocampului

Contact: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Vă rugăm să faceți clic aici pentru partea 1

Knockdown-ul Per1 afectează pe termen lungmemoriela şoareci tineri.Apoi, pentru a testa dacă reglarea în sus a Per1 în hipocampul dorsal este necesară pe termen lungmemorieformarea, am infuzat ARNsi care vizează Per1 în hipocampul dorsal al șoarecilor tineri cu 48 de ore înainte de antrenament OLM cu 10-min. Infuzia de ARNsi Per1 a produs o reducere semnificativă a proteinei PER1 în hipocampul dorsal, măsurată la 2 ore după sesiunea finală de testare (Fig. 4d, Fig. 5 suplimentară). Această reducere relativ modestă a proteinei PER1 (~30 la sută) a produs o deteriorare severămemorieformare pentru OLM; șoarecii infuzați cu ARNsi Per1 nu au arătat o creștere semnificativă a DI între antrenament și testare și au afișat o preferință semnificativ mai mică pentru obiectul în mișcare în timpul testării decât șoarecii de control (Fig. 4e), fără niciun efect asupra explorării totale a obiectului la test (Fig. 4f) și nicio diferență de mișcare în timpul sesiunilor de obișnuire pre-antrenament (Fig. 8c suplimentară). Acest lucru demonstrează, pentru prima dată, că perturbarea locală a unei gene a ceasului circadian de bază în mod selectiv în hipocamp poate afectamemorieformare.

Supraexpresia Per1 se îmbunătățeștememoriela șoarecii în vârstă. In cele din urma,pentru a determina dacă supraexprimarea Per1 în hipocampul dorsal este suficientă pentru ameliorarea legată de vârstămemoriedeficiențe, am reglat local Per1 folosind două metode complementare. În primul rând, am folosit un lentivirus care exprimă Per1 de tip sălbatic cu o etichetă de epitop v5 (pLVX-v5Per1) (Fig. 5a, Fig. 6a suplimentară). Pentru a confirma că această plasmidă supraexprimă Per1, am transfectat celulele HT22 cu pLVX-v5Per1 sau pLVX-EV și am măsurat expresia ARNm Per1. Atât la 24, cât și la 48 de ore după transfecție, ARNm Per1 a fost crescut semnificativ în celulele transfectate cu pLVX-v5Per1 în raport cu celulele transfectate cu plasmida de control (Fig. 5b). Transfecția pLVX-v5Per1 a condus, de asemenea, la o creștere semnificativă a ARNm pentru Per2 (un membru al familiei de ceasuri Perioadei care interacționează cu Per1) la 24 de ore (Figura suplimentară 6b), deși această creștere a fost mult mai mică decât creșterea observată a Per1 (la 24 h, Per1: 466-creștere de ori peste EV, Per2: 1.6-creștere de ori peste EV). Supraexpresia Per1 nu a afectat însă transcrierea celei mai apropiate gene din aval Hes7 (Figura suplimentară 6c).

Pentru a determina dacă supraexpresia Per1 se îmbunătățeștememorieperformanță la șoarecii în vârstă, pLVX-v5Per1 a fost infuzat în hipocampul dorsal al șoarecilor 18-mo cu 2 săptămâni înainte de comportament. Șoarecii pLVX-v5Per1 au prezentat o îmbunătățire semnificativămemoriepentru OLM la test în raport cu controalele pLVX-EV (vector gol) (Fig. 5c). Doar șoarecii pLVX-v5Per1 au arătat o creștere semnificativă a preferinței pentru obiectul în mișcare în repaus în raport cu antrenamentul, fără diferențe de grup observate în explorarea totală la test (Fig. 5d) sau în mișcare în timpul obișnuirii (Figura suplimentară 8d).

În urma comportamentului, țesutul hipocampal de la un subset de animale a fost procesat pentru secvențierea ARN pentru a confirma prezența transcriptelor pLVX-EV și pLVX-v5Per1 în grupurile adecvate in vivo (Figura suplimentară 7a, b, f, g).

Pentru a completa această abordare, am folosit și sistemul CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM)33 pentru a conduce activarea transcripțională a Per1 în hipocampul dorsal. Acest sistem constă din trei componente lentivirale: o cataliticăCas9 inactiv (dCas9) fuzionat cu un domeniu de activare transcripțional VP64 cu o etichetă GFP (dCas9-VP{64-GFP), un ARN cu ghid unic (sgRNA) modificat care vizează Per1 cu doi aptameri ARN MS2 care pot recrutați a treia componentă, o proteină de fuziune MS2- activator transcripțional dublu (MS{2-p65-HSF1)(Fig. 5e). Animalele de control au primit un sgARN de control fără secvența de 20 de nucleotide necesară pentru a ținti sistemul SAM către Per1 (denumit ctrl sgRNA). Asamblarea acestor componente la promotorul Per1 permite celor trei domenii efectoare (VP64, p65 și HSF1) să conducă transcripția Per1. Pentru a confirma, eficacitatea Fig. 5 Supraexpresia Per1 în hipocampul dorsal ameliorează deficiențele legate de vârstă în localizarea obiectului.memorie. o Schemă a construcției lentivirus utilizată pentru a supraexprima v{{0}}etichetat Per1 (pLVX-v5Per1) în comparație cu controlul vector gol (pLVX-EV). b ARNm Per1 a fost crescut semnificativ la 24 și 48 de ore după transfecția pLVX-v5Per1 în celulele HT22 în comparație cu celulele transfectate cu EV (ANOVA bidirecțională: interacțiunea grupului x punct de timp (F(1,8)=52.8, p < {{20}}.0{{{40}}1),="" testele="" post-hoc="" ale="" sidak,="" ***p="">< 0.001,="" n="3," 3,="" 3,="" 3).="" c="" 18-moarecii="" cărora="" li="" sa="" administrat="" infuzii="" hipocampale="" de="" plvx-v5per1="" au="" prezentat="" o="" memorie="" semnificativ="" mai="" bună="" pentru="" olm="" decât="" șoarecii="" cărora="" li="" sa="" administrat="" virusul="" de="" control="" plvx-ev="" (anova="" bidirecțională:="" interacțiunea="" virus="" x="" sesiune,="" (f(1,29)="" {{34)="" }}.15,="" p="">< 0,05),="" testele="" post="" hoc="" ale="" sidak,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" n="16," 15,="" toți="" bărbații).="" d="" explorarea="" totală="" a="" fost="" similară="" pentru="" ambele="" grupuri="" la="" test="" (t(29)="0.57," p="0.57)." e="" schema="" sistemului="" crispr/dcas9="" synergistic="" activation="" mediator="" (sam)="" utilizat="" pentru="" a="" conduce="" transcripția="" per1.="" sus:="" componente="" individuale="" ale="" sam.="" jos:="" componente="" asamblate="" la="" promotorul="" per1,="" conducând="" transcripția="" per1.="" farnm="" per1="" a="" fost="" crescut="" semnificativ="" la="" 48="" de="" ore="" după="" transfecția="" componentelor="" crispr-sam="" în="" celulele="" ht22="" în="" comparație="" cu="" celulele="" transfectate="" cu="" sgrna="" de="" control="" (anova="" bidirecțională:="" interacțiunea="" grupului="" x="" punct="" de="" timp="" (f(1,8)="14.77)" ,="" p="">< 0,01),="" testele="" post-hoc="" ale="" sidak,="" **p="">< 0,001,="" n="3,3,3,3)." g="" 18-mo="" șoarecii="" cărora="" li="" sa="" administrat="" infuzii="" hipocampale="" ale="" sistemului="" crispr-sam="" cu="" sgrna="" țintit="" per1="" s-au="" dovedit="" semnificativ="" mai="">memoriepentru OLM în comparație cu șoarecii de control EV cu sgRNA de control (ANOVA bidirecțională: interacțiunea virus x sesiune (F(1,30)=5.83, p <0.05) ,="" testele="" post-hoc="" ale="" sidak,="" ***p="">< 0,001,="" n="17," 15,="" toți="" bărbați).="" h="" explorarea="" totală="" a="" fost="" similară="" pentru="" ambele="" grupuri="" la="" test="" (t(30)="0.41," p="0.68)." datele="" sunt="" prezentate="" ca="" medie="" ±="" sem="" în="" sistemul="" crispr-sam,="" am="" transfectat="" celulele="" ht22="" cu="" toate="" cele="" trei="" plasmide,="" am="" recoltat="" celulele="" 24="" sau="" 48="" de="" ore="" mai="" târziu="" și="" am="" măsurat="" expresia="" arnm="" per1.="" la="" 48="" de="" ore="" după="" transfecție,="" arnm="" per1="" a="" fost="" crescut="" semnificativ="" în="" grupul="" căruia="" i="" s-a="" administrat="" arnsg="" per1="" comparativ="" cu="" martorii="" (fig.="" 5f),="" confirmând="" că="" sistemul="" crispr-sam="" conduce="" în="" mod="" eficient="" expresia="" arnm="" per1.="" nu="" am="" observat="" nicio="" modificare="" a="" expresiei="" nici="" pentru="" arnm="" per2="" (figura="" suplimentară="" 6e)="" sau="" arnm="" hes7="" (fig.="" 6f="" suplimentară),="" ceea="" ce="" indică="" faptul="" că="" sistemul="" crispr-sam="" conduce="" la="" supraexprimarea="" selectivă="" a="" genei="" țintă,="">

În continuare, șoarecilor 18-mo li s-au administrat infuzii intra-hipocampale ale lentivirusurilor CRISPR-SAM (Figura suplimentară 6d) și au fost antrenați în OLM 2 săptămâni mai târziu. După cum sa observat cu supraexpresia noastră pLVX-v5Per1, supraexpresia Per1 mediată de CRISPR-SAM s-a îmbunătățit semnificativmemorieperformanța la șoarecii perfuzați cu sgRNA Per1 în raport cu animalele de control (Fig. 5g) fără a afecta explorarea totală (Fig. 5h) sau mișcarea în timpul obișnuirii (Fig. 8e suplimentară). Doar șoarecii cărora li s-a administrat sgRNA Per1 au arătat o creștere semnificativă a preferinței pentru obiectul în mișcare în repaus în raport cu antrenamentul, indicând că este intact.memoriepentru locațiile obiectelor (Fig. 5g). În urma comportamentului, țesutul hipocampal de la un subset de animale a fost procesat pentru secvențierea ARN pentru a confirma prezența transcriptelor CRISPR în grupurile adecvate in vivo (Figura suplimentară 7c-g). Împreună, aceste rezultate demonstrează că supraexprimarea Per1 în hipocampul dorsal este suficientă pentru a ameliora tulburările legate de vârstă în memoria locației pe termen lung a obiectelor. Per1 este, prin urmare, o genă cheie care este critică pentru formarea memoriei pe termen lung, este reglementată de HDAC3 și este afectată în creierul îmbătrânit.

Discuţie

Rezultatele noastre arată că ștergerea sau întreruperea histonei deacetilazei represive HDAC3 poate ameliora tulburările legate de vârstă atât pe termen lung.memorieși plasticitatea sinaptică. În plus, ștergerea HDAC3 restabilește expresia indusă de experiență a genei circadiane Per1 în hipocampul dorsal. Deoarece expresia hipocampului PER1 este critică pentru formarea memoriei pe termen lung (Fig. 4), iar supraexprimarea Per1 în hipocamp ameliorează tulburările de memorie legate de vârstă (Fig. 5), PER1 este un mecanism potențial prin care ștergerea HDAC3 se îmbunătățeștememorieși plasticitatea sinaptică la șoarecii în vârstă. Mai larg, perturbarea Per1 legată de vârstă ar putea conecta deficiențe legate de vârstă atât în ​​memoria pe termen lung, cât și în ritmicitatea circadiană, în funcție de structură.

O descoperire cheie din studiul actual a fost că tulburările legate de vârstă în LTP hipocampic ar putea fi ameliorate cu ștergerea sau întreruperea HDAC3. Acest lucru este în concordanță cu lucrările recente de la laboratorul Sajikumar care demonstrează că blocarea farmacologică a HDAC3 poate, de asemenea, ameliora tulburările legate de vârstă în LTP34 hipocampal asociativ. În mod interesant, am descoperit că feliile de la animale vechi HDAC3flox/flox și HDAC3(Y298H) nu au reușit să atingă același nivel de potențare ca feliile de la animale tinere HDAC3flox/flox sau HDAC3(Y298H) (Fig. 2c, f), sugerând că creierul îmbătrânit poate avea un plafon de plasticitate mai scăzut decât creierul tânăr. O posibilă explicație pentru această diferență de potențare este că pierderea legată de vârstă a contactelor sinaptice în CA122 ar putea scădea plafonul de plasticitate în hipocampul îmbătrânit, deoarece mai puține sinapse disponibile ar deveni saturate mai repede decât sinapsele relativ abundente în DH tânăr. Dacă acesta este cazul, consolidarea protocolului de stimulare sau furnizarea de perioade de stimulare distanțate35 nu ar trebui să sporească și mai mult LTP în hipocampul îmbătrânit, deoarece nu sunt disponibile sinapse suplimentare. Vor fi necesare lucrări suplimentare pentru a determina mecanismul care stă la baza acestei diferențe.

Rezultatele noastre de secvențiere ARN au demonstrat că doar un mic subset de gene se potrivește criteriilor de a fi restaurate în creierul îmbătrânit prin ștergerea HDAC3 (Fig. 3e). Astfel, mai degrabă decât recapitularea profilului de expresie genetică a creierului tânăr, ștergerea HDAC3 din creierul îmbătrânit a restabilit expresia indusă de experiență a câtorva gene cheie care sunt de importanță critică pentru formarea memoriei pe termen lung, inclusiv Per1. Per1 pare să fie reglat direct de HDAC3, deoarece ștergerea focală a HDAC3 a restabilit expresia Per1 indusă de experiență și HDAC3 este eliminat fizic din promotorul Per1 ca răspuns la antrenamentul OLM. În plus, expresia Per1 este necesară pentrumemorie, deoarece degradarea mediată de siRNA a proteinei PER1 în DH a afectat pe termen lungmemorieformarea la șoarecii tineri și supraexpresia s-a îmbunătățitmemoriepentru OLM la șoarecii în vârstă. În mod remarcabil, ambele sisteme lentivirale folosite pentru a supraexprima Per1 au transfectat doar un număr mic de celule în zona CA1b a hipocampului dorsal (Fig. 6a, d suplimentară), făcând necesar să se confirme prezența acestor constructe cu secvențierea ARN (vezi metodele). ). Deoarece lucrările anterioare au arătat că această regiune precisă a hipocampului dorsal este critică pentru OLM36, acest lucru demonstrează că chiar și o mică modificare focală a Per1 într-o structură relevantă pentru memorie poate afecta formarea memoriei pe termen lung. Aceasta extinde cercetările anterioare care arată că ștergerea nespecifică a Per1 în creier poate afecta formarea memoriei la șoarecii tineri6,28,29. Reprimarea anormală a Per1 mediată de HDAC3-în creierul îmbătrânit este, prin urmare, un eveniment cheie care ar putea duce la tulburări legate de vârstă atât în ​​formarea memoriei pe termen lung, cât și în ritmicitatea circadiană. Deși acest studiu demonstrează în mod clar că Per1 este o genă importantă prin care HDAC3 reglează memoria pe termen lung în creierul îmbătrânit, alte gene contribuie cel mai probabil la efectele de îmbunătățire a memoriei ale ștergerii HDAC3. Alte gene propuse pentru a media efectele HDAC3 asupra plasticității și memoriei sinaptice includ NF-κB34, FMRP37 și Nr4a226. În studiul actual, am identificat alte trei gene (Fig. 3f: Nr4a1, Egr1, Tsc22d3) care, la fel ca Per1, prezintă o expresie afectată în creierul îmbătrânit, care este îmbunătățită prin ștergerea HDAC3. În prezent, nu este clar modul în care aceste gene diferite contribuie în mod unic la efectele de îmbunătățire a memoriei ale ștergerii HDAC3. În special, toate aceste gene interacționează cu calea CBP/CREB, care este critică pentru formarea memoriei pe termen lung38,39 și este atât în ​​sus, cât și în aval de PER16,28. Deoarece PER1 este în amonte de fosforilarea CREB6, este posibil ca reprimarea Per1 mediată de HDAC3-să reducă fosforilarea CREB, afectând în cele din urmă transcripția genelor mediate de CREB precum Fmrp40,41 și membrii familiei genelor Nr4a Nr4a1 și Nr4a226. Înțelegerea dinamicii complexe dintre HDAC3, PER1 și acești alți actori moleculari va fi un obiectiv important al cercetărilor viitoare.

În studiul actual, am folosit două metode complementare pentru a supraexprima Per1 în creierul îmbătrânit: supraexprimarea unui construct de ADNc Per1 de lungime completă folosind pLVX-v5Per1 și activarea transcripțională a Per1 endogen folosind sistemul CRISPR-SAM. Deși supraexpresia mediată de pLVX a determinat o creștere mare a ARNm Per1 (Fig. 5b), aceasta a fost însoțită de o creștere a Per2, un alt membru al familiei Period (Figura suplimentară 6b). Expresia genei din aval Hes7, totuși, a fost neschimbată de pLVX-v5Per1 (Fig. 6c suplimentară). Sistemul CRISPR-SAM, pe de altă parte, a produs o creștere mai subtilă a ARNm Per1, care a evitat îmbunătățirile în afara țintă fie a expresiei Per2, fie a Hes7 (Figura suplimentară 6e-f). Pe măsură ce ambele abordări s-au îmbunătățit în mod similar pe termen lungmemoriela șoarecii în vârstă, este puțin probabil ca creșterea în afara țintă a Per2 observată cu pLVX-v5Per1 să fi fost cauza îmbunătățirii observate a memoriei pe termen lung.

Efecte circadiene pe termen lungmemoriese crede în mod tradițional că provin din dereglarea în SCN, care apoi conduce modificări în structurile periferice implicate în formarea memoriei, cum ar fi hipocampul dorsal. Se știe puțin despre rolul genelor individuale ale ceasului circadian în DH, în ciuda unei legături clare între ritmicitatea circadiană și formarea memoriei pe termen lung. Memoria este strâns legată de timpul zilei, deoarece cascadele de gene legate de plasticitate arată oscilații circadiene3,6 șimemoriepot fi dobândite mai uşor în anumite perioade ale ciclului circadian. De exemplu, condiționarea fricii de context este dobândită mai puternic în timpul zilei, când nivelurile de fosforilare MAPK atinge vârful3. În plus, este bine documentat că îmbătrânirea este însoțită de o defalcare a ritmurilor circadiene, probabil din cauza modificărilor ceasului circadian central, nucleul suprachiasmatic (SCN) (pentru revizuire1). Cum se leagă această întrerupere a ceasului circadian cu deficiențele legate de vârstă înmemorieeste o întrebare deschisă. Rezultatele noastre sugerează că HDAC3 limitează Per1 indus de experiență în hipocampul îmbătrânit, contribuind posibil la deteriorările observate în memoria pe termen lung. Reprimarea epigenetică a Per1 poate reprezenta, prin urmare, o interfață importantă între deficiențe legate de vârstă atât în ​​​​ritmicitatea circadiană, cât și în formarea memoriei pe termen lung.

Dintre genele de bază ale ceasului circadian canonic, Per1 este gata să afecteze dramatic hipocampul pe termen lung.memorie. Per1 pare să fie implicat predominant în căile de ieșire a SCN și joacă un rol cheie în ceasurile periferice în aval de SCN, cum ar fi hipocampul42. Mai mult, lucrările recente sugerează că Per1 poate „închide” formarea memoriei spațiale pe parcursul ciclului zi/noapte prin controlul fosforilării CREB6,28,29. Într-adevăr, reglarea ARNm Per1 a hipocampului a fost observată după învățarea contextului sau spațială în cel puțin alte trei studii ARN-seq, inclusiv munca la șobolani, ceea ce indică faptul că Per1 este de obicei suprareglat după învățare la nivelul speciilor20,43,44. Împreună cu rezultatele studiului actual, această lucrare indică faptul că expresia PER1 este extrem de importantă pentru formarea memoriei pe termen lung a hipocampului; reducerile PER1 care apar noaptea29 sau odată cu îmbătrânirea ar putea afecta hipocampulmemorie. Până în prezent,

cercetare care implică Per1 înmemorieformarea sa bazat exclusiv pe knockout-uri globale care perturbă expresia Per1 în ceasul circadian de bază și în alte regiuni, în plus față de structurile relevante pentru memorie, cum ar fi hipocampul6,28,29,45,46, făcând imposibilă determinarea dacă PER1 hipocampal este necesar în mod specific pentru formarea memoriei. Într-adevăr, ștergerea globală a Per1 afectează ritmicitatea circadiană în unele rapoarte42. Aici, arătăm pentru prima dată că reducerea expresiei PER1 direct în hipocampul dorsal poate afectamemoriela șoarecii tineri, în timp ce supraexprimarea locală a Per1 în hipocampul dorsal poate îmbunătăți memoria la șoarecii în vârstă. Deoarece deleția selectivă HDAC3 (care reglează Per1) în hipocampul dorsal nu a avut nici un efect asupra modelelor de activitate circadiană în studiul actual (Figura 4 suplimentară) și chiar și leziunile electrolitice ale hipocampului dorsal sunt insuficiente pentru a afecta ritmicitatea circadiană47, pare puțin probabil ca manipularea Per1 în hipocampul dorsal afectează funcția ceasului circadian central. Cu toate acestea, este posibil ca creșterile Per1 induse de experiență sau supraexprimarea Per1 mediată de virus să afecteze oscilația circadiană a altor jucători moleculari, cum ar fi alte gene ceas, în neuronii hipocampali, chiar și fără a afecta tiparele de activitate circadiană. Înțelegerea modului în care Per1 funcționează pentru a modifica formarea memoriei, inclusiv identificarea acestor potențiali parteneri care interacționează, va fi ținta lucrărilor viitoare.

Împreună, aceste rezultate demonstrează că gena ceasului circadian de bază Per1 joacă un rol cheie în localmemoriestructuri pentru a modifica formarea memoriei, un rol care este independent de funcția sa în SCN. În general, acest lucru provoacă ipoteza tradițională conform căreia se schimbă circadianulmemorieformarea este determinată de modificări ale ceasului circadian de bază și, în schimb, susține ipoteza că genele ceasului circadian joacă un rol mai autonom în celulele hipocampului, posibil prin formarea memoriei pe baza orei zilei6.

Metode

Șoareci. Soarecii adulți tineri aveau între 2 și 4 luni în momentul testării, iar șoarecii în vârstă aveau între 18 și 20 de luni. Toți șoarecii au fost C57BL/6J sau menținuți pe un fundal C57BL/6 (șoareci HDAC3 plus/plus și HDAC3flox/flox). Șoarecii au avut acces liber la hrană și apă, iar luminile au fost menținute pe un ciclu lumină/întuneric de 12 ore. Toate testele comportamentale au fost efectuate în timpul ciclului de lumină. Toate experimentele au fost efectuate conform orientărilor Institutului Național de Sănătate din SUA pentru îngrijirea și utilizarea animalelor și au fost aprobate de Comitetul Instituțional pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de la Universitatea din California, Irvine.

Interventie chirurgicala. Șoarecii au fost anesteziați cu izofluran (indus, 4 la sută; menținut 1,5–2,0 la sută) și plasați în stereotaxic. Acele de injectare au fost coborâte în hipocampul dorsal la o rată de 0,2 mm/15 s (AP, -2,0 mm; ML, ± 1,5 mm, DV, - 1,5 mm față de Bregma ). La două minute după atingerea adâncimii țintă, 1,0 ul de virus sau siARN au fost infuzați bilateral în DH la o viteză de 6 ul/h. Pentru perfuziile lentivirale CRISPR-SAM, un cocktail din cele trei virusuri a fost perfuzat la un volum final de 1,5 μL per emisferă în aceeași rată. Acele de injectare au rămas la locul lor timp de două minute după injectare pentru a permite virusului să se difuzeze. Injectoarele au fost apoi ridicate 0.1 mm și lăsate să stea încă un minut înainte de a fi îndepărtate cu o rată de 0.1 mm pe 15 s. Perfuziile virale au fost efectuate cu 2 săptămâni înainte de analiza comportamentală, în timp ce siRNA knockdown a fost efectuată cu 2 zile înainte de antrenament13. Pentru toate experimentele de injectare, animalele au fost repartizate aleatoriu la diferite condiții de injectare (cu excepția șoarecilor HDAC3 plus/plus și HDAC3flox/flox, care au fost toți injectați cu AAV-CaMKII-Cre). Pentru toate experimentele comportamentale, animalele din cadrul fiecărei afecțiuni virale au fost repartizate aleatoriu în cușcă/grupuri antrenate și toate condițiile (obiecte, cutii etc.) au fost contrabalansate între grupuri.

producție AAV. AAV2.1-CaMKII-Cre a fost achiziționat de la Penn Vector Core (titru: 1,81 × 1013 GC/ml). Pentru AAV2.1-HDAC3(Y298H)-v5, am amplificat HDAC3 de tip sălbatic din ADNc hipocampal și am donat produsul într-un pAAV-IRES-hrGFP modificat (Agilent) sub controlul promotorului CMV și al intronului -globinei. Eticheta 3×-FLAG, elementul IRES și hrGFP au fost îndepărtate din vector și înlocuite cu o etichetă V5, permițând o fuziune C-terminală cu HDAC3 (plasmida MW91). Pentru a crea mutația punctuală, am schimbat nucleotidele pentru a codifica un reziduu de histidină în locul tirozinei la aminoacidul 298 (plasmida MW92). Pentru controlul vector gol, secvența de codificare HDAC3 nu a fost prezentă, dar toate celelalte elemente rămân (plasmida MW87). AAV a fost realizat de Penn Vector Core și titrurile finale au fost determinate prin qPCR (AAV-HDAC3(Y298H): 6,48 × 1012 GC/ml; AAV-EV: 1,35 × 1013 GC/ml).

Producția de lentivirus. Pentru sistemul CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM), plasmidele lentivirale au fost achiziționate de la Addgene pentru dCas9- VP64-GFP (#61422-LVC) și MS2- Constructe P65-HSF{1_Hygro (#61426-LVC) (titruri Mai mari sau egale cu 8× 106 TU/ml). Pentru ARNsg Per1, am donat și am inserat o secvență de ghidare antisens corespunzătoare elementului CRE din promotorul Per1 (AGAGGGAGGTGACGTCAAAG) în coloana vertebrală de donare Addgene sgRNA (MS2) (#61427). SgRNA de control a fost identic, cu excepția faptului că nicio secvență ghid nu a fost donată în plasmidă. Lentivirusurile atât pentru sgRNA Per1 (titru: 6,8 × 107 IFU/ml) cât și pentru sgRNA de control (3,5 × 107 IFU/ml) au fost produse de Laboratorul Lentiviral USC School of Pharmacy.

Pentru constructul de supraexpresie pLVX-V5Per1, am amplificat Per1 de tip sălbatic de lungime completă din plasmida Addgene pCMV-Sport2-mPer1 (#16203) și am donat produsul într-un pLVX-EF1 -IRES-mCherry modificat coloana vertebrală (Takara, #631987). Elementele IRES și mCherry au fost îndepărtate și au fost înlocuite cu o etichetă V5, permițând o fuziune N-terminală cu PER1 (plasmida MW206). Pentru controlul vector gol (EV), secvența de codificare PER1 nu a fost prezentă, dar toate celelalte elemente au rămas (Plasmid MW93). Lentivirusurile pentru pLVX-v5Per1 (titru: 1,3 × 108 IFU/ml) și pLVX-EV (titru: 1,5 × 108 IFU/ml) au fost produse de Laboratorul Lentiviral USC School of Pharmacy. Toate constructele lentivirale au fost exprimate sub promotorul EF1.

Verificarea culturii celulare a pLVX-v5Per1 și CRISPR-SAM. Pentru a verifica că pLVX-v5Per1 produce supraexprimarea ARNm Per1, celulele HT22 de șoarece (Salk Institute, La Jolla, CA, #T09031) au fost transfectate cu pLVX-v5Per1 sau pLVX-EV (Fig. 5a) folosind Lipofectaine LTX (Invitrogen). În mod similar, pentru a verifica dacă sistemul CRISPR-SAM poate conduce eficient transcripția Per1, celulele HT22 au fost transfectate cu dCas9-VP64 (lenti MS{2-P{65_HSF{1_Blast a fost un cadou de la plasmida Feng Zhang Addgene #61425), MS2-P{65-HSF1 (lenti dCAS-VP{64_Blast a fost un cadou de la Feng Zhang, plasmida Addgene #61426) și fie Per1 sgRNA (Per1 sgRNA) sau sgRNA de control non-țintire (ctrl sgRNA) (coloana vertebrală lenti sgRNA (MS2)_zeo a fost un cadou de la Feng Zhang, plasmida Addgene #61427) folosind Lipofectamine LTX (Invitrogen). Celulele au fost recoltate după 24 sau 48 de ore, lizate și ARNm a fost izolat așa cum este descris mai sus. qRT-PCR a fost efectuată așa cum este descris mai sus utilizând primerii și sonda Per1, Per2 și Hes7 enumerate în Tabelul S4.

siARN. Pentru experimentul de reducere a Per1, ARN-urile interferente mici Accell SMARTpool (siRNAs; Dharmacon, GE) care vizează Per1 au fost diluate la o concentrație totală finală de 1 0 μM în ddH20 și infuzate în DH (1,0 ul/lateral). A fost utilizat ca control (concentrație totală, 10 μM) și a fost perfuzat în același mod. Pentru experimentele cu siRNA, șoarecii au fost manipulați și obișnuiți așa cum este descris mai sus și intervenția chirurgicală a fost efectuată a doua zi după ultima zi de obișnuire. Șoarecilor li s-a oferit o zi întreagă de recuperare după intervenție chirurgicală și au fost antrenați în ziua următoare (~ 48 de ore după operație) pentru a asigura doborârea maximă a țintei. Pentru a asigura declanșarea, șoarecii au fost sacrificați la aproximativ 1 oră după test și loviturile din hipocampul dorsal au fost procesate cu Western blot pentru a asigura distrugerea proteinei PER1.

Locația obiectului și recunoașterea obiectelormemoriesarcini. Pentru locația obiectelor și sarcinile de memorie de recunoaștere a obiectelor, șoarecii au fost manipulați timp de 2 minute/zi timp de 4 zile și apoi s-au obișnuit cu contextul timp de 5 minute/zi timp de șase zile consecutive în absența obiectelor. În timpul antrenamentului, șoarecii au fost expuși la două obiecte identice (pahare de 100 ml, cutii de condimente sau suporturi de lumânare din sticlă) și lăsați să exploreze timp de 10 minute. În timpul testului de retenție (24 de ore mai târziu pe termen lungmemoriesau 60 m mai târziu pentru memoria pe termen scurt), șoarecii au fost lăsați să exploreze timp de 5 minute. Pentru locația obiectuluimemorie, unul dintre cele două obiecte familiare a fost mutat într-o nouă locație. Pentru recunoașterea obiectelormemorie, locațiile obiectelor au rămas constante, dar unul dintre obiecte a fost înlocuit cu un nou articol. Obișnuirea pentru memoria de recunoaștere a obiectelor a început la cel puțin o săptămână după finalizarea testării OLM și au fost folosite un nou context și obiecte nefamiliare48. Explorarea a fost punctată atunci când capul mouse-ului s-a orientat spre obiect și a ajuns la 1 cm sau când nasul a atins obiectul. Timpul total de explorare a fost înregistrat (t) și preferința pentru elementul nou a fost exprimată ca indice de discriminare (DI=(tnovel -tfamiliar) / (tnovel plus tfamiliar) x 100 la sută ). Pentru sesiunile de antrenament, obiectul desemnat pentru a fi mutat la testare a fost folosit ca obiect nou pentru a permite compararea directă a DI de antrenament și testare. Șoarecii care au explorat ambele obiecte mai puțin de 2 s în timpul testării sau 3 s în timpul antrenamentului au fost eliminați din analiza ulterioară. Soarecii care au arătat o preferință pentru un obiect în timpul antrenamentului (DI > ± 20) au fost, de asemenea, îndepărtați. Sesiunile de obișnuință au fost analizate (pentru a determina distanța parcursă și viteza) folosind software-ul de analiză comportamentală ANY-maze (Stoelting Co). Toate obișnuirea, antrenamentul, testarea și notarea au fost efectuate de experimentatori orbiți de grupurile experimentale.

Context frica de a condiționa. Pentru condiționarea fricii contextuale, șoarecii au fost tratați mai întâi timp de 5 zile. În timpul achiziției, șoarecii au fost expuși la context timp de 2 minute și 28 s, urmat de un șoc de 2 s (0.75 mA), un protocol care produce de obicei o memorie robustă pe termen lung12,20. Șoarecii au rămas în context încă 30 de secunde înainte de a fi îndepărtați. Șoarecii au fost sacrificați la 60 m după antrenament, împreună cu controalele din cușcă care au fost manipulate, dar nu antrenate. Comportamentul la îngheț a fost măsurat folosind software-ul Ethovision 11 (Noldus)12.

Labirint plus ridicat. Labirintul plus a fost condus de un experimentator nevăzut la grupurile experimentale. La o săptămână după finalizarea ORM, un subset de șoareci au fost testați pe labirintul plus. Două brațe ale labirintului au fost deschise (30 × 5 cm) și două brațe au fost închise (30 × 5 × 15 cm), conectate printr-o platformă centrală (5 × 5 cm). Labirintul a fost ridicat la 40 cm deasupra podelei. Șoarecii au fost testați timp de 5 minute pe aparat, care a constat în plasarea fiecărui șoarece pe platforma centrală în fața unuia dintre brațele deschise. Între subiecți, labirintul a fost curățat cu 70% etanol. Procentul de timp petrecut în brațele închise și deschise a fost marcat folosind software-ul ANY-maze.

Analiza ritmului circadian. Șoarecii tineri ({{0}}lună) și în vârstă ({18-lună) HDAC3 plus/plus și HDAC3flox/flox au fost crescuți și găzduiți sub un ciclu de 12 ore lumină/întuneric (LD). La două săptămâni după perfuzia AAV-CaMKII-Cre (descrisă mai sus), șoarecii au fost transferați într-o cameră izolată de antrenare LD de 12 ore timp de 7 zile. Șoarecii au fost apoi transferați într-o cameră de analiză a activității protejate de lumină, unde activitatea locomotorie a fost analizată folosind detectoare de mișcare cu fascicul optic (Philips Respironics). Activitatea a fost monitorizată pe parcursul a 2 săptămâni de antrenare a ciclului LD în camera protejată de lumină înainte ca șoarecii să fie trecuți la întuneric constant (DD) pentru încă 3 săptămâni. Monitorizarea activității a continuat pe tot parcursul fazei DD pentru a determina dacă ștergerea HDAC3 în DH a afectat ritmurile circadiene endogene. Datele au fost colectate folosind Minimitter VitalView 5.0 și software-ul Clocklab (Actimetrics) a fost folosit pentru a determina debutul activității libere. Valorile Tau au fost calculate obținând panta acestui debut și calculând potrivirea celor mai mici pătrate cu software-ul Clocklab49,50.

Imunohistochimie. După terminarea comportamentului, șoarecii au fost eutanasiați prin dislocare cervicală, iar creierul lor a fost îndepărtat și congelat rapid în izopentan rece ca gheața. Au fost colectate felii de douăzeci de micrometri în întregul campus dorsal al șoldului, montate dezghețat pe lame și stocate la -80 grade. Lamele au fost fixate cu 4% paraformaldehidă (10-min), permeabilizate în 0.{01% Triton X-100 în 0,1 M PBS (5-min) și blocat timp de 1 oră cu 8% ser normal de capră (Jackson). Lamele au fost incubate peste noapte (4 grade) în anticorp de iepure la HDAC3 (1:250, Abcam, clona Y415, ab32369) sau V5 (1:1000, Abcam, ab9116) sau anticorp de pui la GFP (1:250, Aves Labs, #GFP1010). În ziua următoare, lamele au fost spălate și incubate timp de 1 oră la temperatura camerei cu Alexa 488 anti-iepură de capră (HDAC3 și V5; 1:1000, ThermoFisher, #A-11008) sau Alexa 488 anti-pui de capră (GFP). ; 1:1000, ThermoFisher, #A-11039) în întuneric. Lamele au fost apoi spălate cu PBST și incubate timp de 50 m în NeuroTrace 530/615 (1:50; ThermoFisher, #N21482), o colorație fluorescentă de nissl. Pentru a stinge autofluorescența nespecifică51, feliile au fost apoi spălate în PBS cu 0,01% Triton, clătite cu apă și incubate timp de 10-min în CuSO4 10 mM în tampon de acetat de amoniu 50 mM. Feliile au fost din nou clătite cu apă, spălate în PBS și acoperite cu mediu de montare VectaShield Antifade (Vector Laboratories).

Toate imaginile au fost achiziționate cu un scaner Olympus VS110 cu un obiectiv apocromatic de 20x (apertura numerică 0,75) cu software-ul de scanare VS110. Toate grupurile de tratament au fost reprezentate pe fiecare diapozitiv și toate imaginile de pe un diapozitiv au fost capturate cu același timp de expunere în condiții de nesaturare. Intensitatea imunomarcarii a fost cuantificată cu ImageJ prin eșantionarea densității optice a stratului celular din CA1 și scăderea unei mostre de fluorescență de fundal din aceeași imagine. Pentru toate experimentele AAV, animalele care nu au reușit să exprime virusul în zona CA1 a hipocampului dorsal au fost excluse din analize. Imagistica și cuantificarea au fost efectuate de experimentatori nevăzători la condițiile experimentale.

Western blot. Pentru a verifica declanșarea PER1, șoarecii siRNA Per1 și control siRNA au fost sacrificați la 2 ore după testare, iar creierele au fost congelate rapid. Creierele au fost secționate coronal și au fost colectate pumni DH de 1 mm din felii de 500 μm. Puncturile au fost omogenizate în tampon T-PER (Thermo Fisher) cu protează Halt și inhibitor de fosfatază (Thermo Fisher) folosind un omogenizator Dounce. Lizatele de proteine ​​au fost cuantificate folosind un test Bradford modificat (BioRad) și s-au încărcat 50 ug lizat proteic total în fiecare bandă a unui gel NuPAGE Bis-Tris de 7,5% (Thermo Fisher). Gelurile au funcționat timp de 50 de minute la 200 de volți și petele au fost transferate peste noapte la 15 V la 4 grade pe membrane de nitroceluloză (Novexi, LC2001). În ziua următoare, membranele au fost incubate în tampon de blocare timp de 1 oră (5% lapte degresat în soluție salină tamponată cu Tris cu 0,01% Tween 20), spălate (0,1% Tween 20 în TBS) și apoi incubate în anticorp primar (1:500, iepure anti-Per1, Thermo Fisher #PA1-524) în tampon primar de anticorpi (3% BSA în TBS cu 0,1% Tween) peste noapte la 4 grade. Membranele au fost apoi spălate și incubate în anticorp de șoarece conjugat cu HRP la iepure (1:10,000, Jackson Laboratories, specific lanțului ușor, #211-032-171) timp de 1 oră. Membranele au fost spălate și dezvoltate folosind substrat chimioluminiscent Pierce SuperSignal West Pico (Pierce, 34077). Au fost utilizate mai multe expuneri de film pentru a verifica liniaritatea. Petele au fost spălate și îndepărtate timp de 10 m cu Restore Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher #21059), spălate din nou și apoi re-sondate peste noapte (4 grade) cu un anticorp de iepure la GAPDH (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, SC25778). ). Petele de lungime completă PER1 și GAPDH sunt prezentate în Figura suplimentară 5. Densitățile optice relative au fost calculate din filmul scanat folosind ImageJ (Institutele Naționale de Sănătate din SUA) de către un experimentator nevăzut la condițiile experimentale. Toate valorile au fost normalizate la nivelurile de expresie GAPDH.

qRT-PCR. Țesutul a fost colectat din perforațiile DH (descrise mai sus) și congelat la -80 de grade până la procesare. ARN-ul a fost izolat utilizând un RNeasy Minikit (Qiagen, #74104) și cADN-ul a fost creat utilizând kitul Transcriptor First Strand cDNA Synthesis (Roche, 04379012001). Primerii și sondele au fost derivate din Roche Universal ProbeLibrary (Tabelul S4) și au fost utilizate pentru multiplexare în mașina Roche Light-Cycle 480 II (Roche). Toate valorile au fost normalizate la Gapdh. Analizele și statisticile au fost efectuate folosind algoritmii proprietari Roche și software-ul REST 2009 bazat pe metoda Pfaff52,53.

RNA sequencing. RNA was isolated from dorsal hippocampus punches as described above, using the RNeasy Minikit (Qiagen, 74104). RNA quality was assessed by Bioanalyzer and samples with an RNA integrity number >9 au fost incluse în analiza noastră. Bibliotecile de ADNc pentru fiecare grup au fost preparate conform Ghidului de preparare a probelor de ARN TruSeq (Illumina). Două sute cincizeci de nanograme de ARN total de la fiecare șoarece au fost purificate cu margele magnetice poli-T oligo-atașate și fragmentate la căldură. ADNc prima și a doua catenă au fost apoi sintetizate și purificate. După ce capetele au fost tocite, capătul 3′ a fost adenilat pentru a preveni concatenarea șablonului în timpul ligării adaptorului. Pentru fiecare grup, un set unic de adaptoare a fost adăugat la capetele ADNc-ului și bibliotecile au fost amplificate prin PCR. Calitatea bibliotecii a fost evaluată de Bioanalyzer și cuantificată folosind qRT-PCR cu o curbă standard preparată dintr-o bibliotecă de secvențiere comercială (Illumina). Probele au fost multiplexate, fiecare grup comportamental fiind reprezentat în fiecare celulă de flux a secvențatorului. 10 nM din fiecare bibliotecă au fost reuniți în patru biblioteci multiplex și secvențiați pe un instrument Illumina HiSeq 2500 în timpul unei secvențieri cu citire unică de 50 bp, condusă de Genomic High-Troughput Facility de la Universitatea din California, Irvine. Datele de secvențiere rezultate pentru fiecare bibliotecă au fost post-procesate pentru a produce fișiere FastQ. Datele au fost apoi demultiplexate și filtrate folosind software-ul Illumina CASAVA 1.8.2, precum și software-ul intern. Citirile de proastă calitate (eșecul testelor standard de calitate Illumina) și citirile de control aliniate cu succes la genomul de control PhiX au fost eliminate din analize. Calitatea secvențelor rămase a fost evaluată în continuare utilizând scorurile de calitate PHRED produse în timp real în timpul etapei de apelare de bază a rulării secvențierii (Figura suplimentară 3a).

Alinierea la genomul de referință și transcriptom. Citirile din fiecare experiment au fost aliniate separat la genomul de referință și la transcriptomul corespunzător folosind aliniere cu citire scurtă ELAND v2e (Illumina) și Bowtie24. Citirile aliniate în mod unic de ambele instrumente la exoni cunoscuți sau joncțiuni de îmbinare cu cel mult două nepotriviri pe orice fragment de 25 bp al citirii au fost incluse în transcriptom. Citirile aliniate în mod unic, dar cu mai mult de două nepotriviri pe orice fragment de 25 bp al citirii au fost eliminate din analize. În mod similar, citirile care se potrivesc cu mai multe locații din genomul de referință au fost eliminate din analiză. Procentul de citiri alocate genomului de referință și transcriptomului folosind acest protocol este raportat pentru fiecare grup de replici (Fig. 3b suplimentară). Acest lucru a dus la o medie de aproximativ 30 de milioane de citiri per probă.

Pentru a verifica prezența plasmidelor pLVX și CRISPR-SAM după perfuzia lentivirală, am rulat secvențierea ARN pe probe de hipocamp de la un subset de trei animale per grup în urma comportamentului. Deoarece numărul de celule infectate cu lentivirusuri in vivo a fost prea mic pentru a detecta în mod fiabil prezența transcriptelor adecvate folosind RT-qPCR (Figura suplimentară 6a, d), am folosit ARN-seq ca metodă mai sensibilă pentru a detecta prezența a acestor stenograme. O versiune actualizată a ansamblului genomului și a adnotării genomului a fost construită prin adăugarea secvențelor și adnotărilor constructelor plasmide la genomul original de șoarece mm10 și, respectiv, la adnotarea genomului de șoarece mm10. Folosind instrumentul de aliniere a citirilor TopHat din Tuxedo Suite54, citirile au fost mapate la genom și numai hit-urile care erau unice pentru transcrierile plasmidelor în comparație cu genomul de referință de șoarece endogen au fost considerate „citiri potrivite” la constructele plasmidei. Numărul acelor citiri potrivite a fost apoi cuantificat pentru fiecare construct pentru fiecare probă.

Expresia genică și analiza diferențială. Nivelurile de expresie genică au fost calculate direct din rezultatele de aliniere citite pentru fiecare replicare. Valorile standard RPKM55, citiri pe kilobază de model de exon per milion de citiri mapate) au fost extrase pentru fiecare genă acoperită de datele de secvențiere și fiecare replica utilizată în acest studiu.

Analizele transcripționale diferențiale au fost efectuate folosind Cyber ​​T56,57 în fiecare pereche de grupuri (homecage versus 60 m după antrenament) pentru a identifica genele reglate în sus sau în jos după OLM. În plus față de șoarecii HDAC3 plus/plus și HDAC3flox/flox în vârstă de 18-lună antrenați pentru studiul actual, datele de secvențiere a ARN-ului au procesat în mod identic de la șoareci de tip sălbatic C57 de {{1{0}}lună ( homecage și OLM instruit în același mod ca și studiul actual) dintr-un studiu anterior20 a fost folosit pentru analize diferențiale. Numărul de animale (replicate biologice) pentru fiecare grup a fost: Young HDAC plus / plus HC: 6, Young HDAC3 plus / plus OLM: 6, Old HDAC3 plus / plus HC: 6, Old HDAC3 plus / plus OLM: 6, Old HDAC3flox/flox HC: 8, Old HDAC3flox/flox OLM: 8. Nu s-au folosit replici tehnice. Pragul de valoare p utilizat pentru determinarea expresiei diferențiale este 0,05 pentru toate grupurile. Rata de descoperire falsă (FDR) măsurată prin valoarea q Benjamini & Hochberg (BH) a fost utilizată pentru a corecta testele multiple, cu un prag FDR de 0,15. Seturile de gene suprareglate după experiență (comparativ cu homecage) pentru aceste 3 grupuri (tip sălbatic tânăr, HDAC în vârstă plus/plus sau HDAC3flox/flox îmbătrânit) au fost intersectate pentru a determina genele comune pentru două sau mai multe grupuri. Îmbogățirea fiecărui grup pentru expresia specifică țesutului, termenii de ontologie genică58 și căile KEGG59,60 a fost evaluată folosind DAVID61, pe baza genelor exprimate diferențial după comportament. Vizualizarea datelor a fost efectuată folosind „matplotlib” pentru python și „ggplot” pentru R.

Imunoprecipitarea cromatinei. ChIP a fost efectuat pe perforații DH pe baza protocolului din kitul Millipore ChIP11,12,62. Țesutul a fost reticulat cu 1% formaldehidă (Sigma), lizat și sonicat, iar cromatina a fost imunoprecipitată peste noapte cu 2 ul de anti-H4K8Ac (Millipore #17-10099) sau 4 ul de anti-HDAC3 (Millipore #{{{) 13}}) sau o cantitate echivalentă de ser normal de iepure (control negativ H4K8Ac, Millipore) sau IgG anti-șoarece (control negativ HDAC3, Millipore). După spălare, cromatina a fost eluată din perle și reticulat invers în prezența proteinazei K înainte de purificarea pe coloană a ADN-ului. Secvențele de primer pentru promotorii fiecărei gene au fost proiectate de programul Primer 3 (Tabelul S4). Cinci ul de imunoprecipitat de intrare, IgG anti-H4K8Ac/IgG anti-HDAC3 sau IgG anti-iepure/șoarece de la fiecare animal au fost examinate în duplicat. Pentru a normaliza datele ChIP-qPCR, am folosit metoda de intrare procentuală. Eșantionul de intrare a fost ajustat la 100 la sută și ambele probe IP și IgG au fost calculate ca procent din această intrare folosind formula 100*AE ^ (intrare ajustată – Ct (IP)). Îmbogățirea pliurilor a fost apoi calculată ca raport dintre ChIP și IgG medie. O curbă standard în placă a determinat eficiența de amplificare (AE).

Pregătirea feliei și înregistrarea. Șoarecii tineri (aproximativ 3-luni) și îmbătrâniți (18-luni) au fost infuzați stereotaxic cu virusul. Pentru primul experiment, șoarecii tineri și bătrâni HDAC3 plus/plus și HDAC3flox/flox au fost perfuzați bilateral cu AAV-CaMKII-Cre în DH. Pentru al doilea experiment, șoarecii C57 tineri și bătrâni de tip sălbatic au fost perfuzați cu AAV-HDAC3 (Y298H) în DH a unei emisfere și controlul AAV-EV în cealaltă emisferă. La două săptămâni după perfuzie (pentru a permite expresia optimă a virusului)2, felii transversale de hipocamp (320 μm) au fost plasate într-o cameră de înregistrare a interfeței cu lichid cefalorahidian artificial preîncălzit (31 ± 1 grade) (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM). KH2P04, 1,5 mM MgS04, 2,5 mM CaCI2, 26 mM NaHC03 şi 10 mM D-glucoză). Feliile au fost perfuzate continuu cu o rată de 1,75-2 ml pe minut, în timp ce suprafața feliilor a fost expusă la cald, umidificat 95% O2/5% CO2. Înregistrările au început după cel puțin 2 ore de incubație.

Potențialele postsinaptice excitatorii de câmp (fEPSP) au fost înregistrate din stratul radiatum CA1b folosind o singură pipetă de sticlă (2–3MΩ) umplută cu 2 M NaCl. Impulsurile de stimulare (0.{05 Hz) au fost livrate proiecțiilor colaterale-comisurale Schaffer folosind un electrod de stimulare bipolar (sârmă de nicrom răsucit, 65 μm) poziționat în CA1c. Intensitatea curentului a fost ajustată pentru a obține 50% din răspunsul maxim fEPSP. După ce a fost stabilită o linie de bază stabilă, LTP a fost indus cu un singur tren de cinci rafale teta, în care fiecare rafală (patru impulsuri la 100 Hz) a fost livrată la 200 ms (adică, la frecvența teta). Intensitatea stimulării nu a fost crescută în timpul TBS. Datele au fost colectate și digitizate de NAC 2.0 Neurodata Acquisition System (Theta Burst).

Analize statistice. Analizele statistice au fost efectuate așa cum este indicat în text și legendele figurilor folosind Prism 6 (GraphPad). Abordările noastre analitice se bazează pe lucrările publicate anterior12,20,63,64. Nu au fost utilizate metode statistice pentru a predetermina dimensiunile eșantionului, dar dimensiunile eșantionului nostru sunt similare cu cele utilizate în general în domeniu, inclusiv cele raportate în publicațiile anterioare12,20,64,65. Distribuția datelor sa presupus a fi normală, cu o variație similară observată între grupuri, dar aceasta nu a fost testată în mod oficial. Când un experiment a avut două grupuri de comparat, au fost utilizate testele t Student cu două cozi. Atunci când s-au comparat doi factori (cum ar fi vârsta și genotipul sau sesiunea și grupul), datele au fost analizate cu ANOVA bidirecționale, urmate de testele post-hoc de comparații multiple ale Sidak. Toate analizele sunt cu două cozi, cu o valoare de 0,05 necesară pentru semnificație. Barele de eroare din toate figurile reprezintă SEM. Pentru toate experimentele, valorile ± 2SD din media grupului au fost considerate valori aberante și au fost eliminate din analize.

Disponibilitatea datelor. Datele care susțin concluziile acestui studiu sunt disponibile de la autorul corespunzător, la cerere rezonabilă. Datele de secvențiere a ARN au fost depuse în Gene Expression Omnibus al NCBI și sunt accesibile prin numărul de acces din seria GEO GSE94832.

Referințe

1. Deibel, SH, Zelinski, EL, Keeley, RJ, Kovalchuk, O. & McDonald, RJ Alterările epigenetice în nucleul suprachiasmatic și hipocamp contribuie la declinul cognitiv legat de vârstă. Oncotarget 6, 23181–23203 (2015).

2. Gerstner, JR & Yin, JC Ritmurile circadiene și formarea memoriei. Nat. Pr. Neurosci. 11, 577–588 (2010).

3. Eckel-Mahan, KL şi colab. Oscilația circadiană a activității MAPK a hipocampului și a cAmp: implicații pentru persistența memoriei. Nat. Neurosci. 11, 1074– 1082 (2008).

4. Chaudhury, D. & Colwell, CS Modularea circadiană a învățării și memoriei la șoarecii condiționate de frică. Comportament. Brain Res. 133, 95– 108 (2002).

5. Kondratova, AA & Kondratov, RV Ceasul circadian și patologia creierului îmbătrânit. Nat. Pr. Neurosci. 13, 325–335 (2012).

6. Rawashdeh, O., Jilg, A., Maronde, E., Fahrenkrug, J. & Stehle, JH Period1 pornește modularea circadiană a semnalizării relevante pentru memorie în hipocampul șoarecelui prin reglarea transferului nuclear al kinazei CREB pP90RSK. J. Neurochem. 138, 731–745 (2016).

7. Penner, MR, Roth, TL, Barnes, CA și Sweatt, JD O ipoteză epigenetică a disfuncției cognitive legate de îmbătrânire. Front Aging Neurosci. 2, 9 (2010).

8. Peleg, S. şi colab. Modificarea acetilării histonelor este asociată cu afectarea memoriei dependentă de vârstă la șoareci. Science 328, 753–756 (2010).

9. Snigdha, S. et al. Inhibarea H3K9me3 îmbunătățește memoria, promovează formarea coloanei vertebrale și crește nivelurile de BDNF în hipocampul îmbătrânit. J. Neurosci. 36, 3611–3622 (2016).

10. Spiegel, AM, Sewal, AS & Rapp, PR Contribuții epigenetice la îmbătrânirea cognitivă: dezlegarea duratei mentale și a duratei de viață. Învață Mem. 21, 569–574 (2014).

11. Malvaez, M. et al. HDAC3-inhibitorul selectiv sporește extincția comportamentului de căutare a cocainei într-un mod persistent. Proc. Natl Acad. Sci. SUA 110, 2647–2652 (2013).

12. Kwapis, JL şi colab. Contextul și teama auditivă sunt reglementate diferențial de activitatea HDAC3 în subnucleii laterali și bazali ai amigdalei. Neuropsychopharmacology 42, 1284– 1294 (2017).

13. McQuown, SC și colab. HDAC3 este un regulator negativ critic al formării memoriei pe termen lung. J. Neurosci. 31, 764–774 (2011).

14. Bieszczad, KM et al. Inhibarea histonei deacetilazei prin RGFP966 eliberează frânele plasticității corticale senzoriale și specificitatea formării memoriei.J. Neurosci. 35, 13124– 13132 (2015).

15. Lahm, A. şi colab. Dezvăluirea activității catalitice ascunse a histon deacetilazelor de clasa IIa de vertebrate. Proc. Natl Acad. Sci. SUA 104, 17335– 17340 (2007).

16. Sun, Z. şi colab. Funcția independentă de deacetilază a HDAC3 în transcripție și metabolism necesită corepresorul receptorului nuclear. Mol. Celula 52, 769–782 (2013).

17. Alaghband, Y. et al. Roluri distincte pentru domeniul deacetilază al HDAC3 în hipocamp și cortexul prefrontal medial în formarea și stingerea memoriei. Neurobiol. Învăța. Mem. 145, 94– 104 (2017).

18. Nott, A. şi colab. Histone deacetilaza 3 se asociază cu MeCP2 pentru a regla FOXO și comportamentul social. Nat. Neurosci. 19, 1497– 1505 (2016).

19. Norwood, J., Franklin, JM, Sharma, D. & D'Mello, SR Histone deacetilaza 3 este necesară pentru dezvoltarea corectă a creierului. J. Biol. Chim. 289, 34569–34582(2014).

20. Vogel-Ciernia, A. et al. Subunitatea de reglare a cromatinei specifică neuronului BAF53b este necesară pentru plasticitatea sinaptică și memorie. Nat. Neurosci. 16, 552–561 (2013).

21. Alberini, CM Factorii de transcripție în memoria de lungă durată și plasticitatea sinaptică. Physiol. Apoc. 89, 121– 145 (2009).

22. Barnes, CA Potențarea pe termen lung și îmbătrânirea creierului. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B 358, 765–772 (2003).

23. Speir, ML et al. Baza de date UCSC Genome Browser: actualizare 2016. Acizi nucleici Res. 44, D717–D725 (2016).

24. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. & Salzberg, SL Alinierea ultrarapidă și eficientă a memoriei a secvențelor scurte de ADN la genomul uman. Genom Biol. 10, R25 (2009).

25. Rowe, WB et al. Analizele exprimării hipocampului dezvăluie asocierea selectivă a căilor imediat-precoce, neuroenergetice și mielinogene cu afectarea cognitivă la șobolanii în vârstă. J. Neurosci. 27, 3098–3110 (2007).

26. McNulty, SE și colab. Roluri diferențiate pentru Nr4a1 și Nr4a2 în locația obiectului față de recunoașterea obiectelor în memoria pe termen lung. Învață Mem. 19, 588–592 (2012).

27. Vecsey, CG, Park, AJ, Khatib, N. & Abel, T. Efectele privării de somn și îmbătrânirii asupra memoriei pe termen lung și la distanță la șoareci. Învață Mem. 22, 197–202 (2015).

28. Rawashdeh, O. et al. PERIOD1 coordonează ritmurile hipocampului și procesarea memoriei cu timpul zilei. Hipocampus 24, 712–723 (2014).

29. Jilg, A. şi colab. Dinamica temporală a expresiei genei ceasului hipocampal la șoarece sprijină procesarea memoriei. Hipocampus 20, 377–388 (2010).

30. Eckel-Mahan, KL Oscilațiile circadiene din interiorul hipocampului susțin formarea și persistența memoriei. Front Mol. Neurosci. 5, 46 (2012).

31. Guzowski, JF, Setlow, B., Wagner, EK și McGaugh, JL Expresia genei dependentă de experiență în hipocampul șobolanului după învățarea spațială: o comparație a genelor imediate timpurii Arc, c-fos și zif268. J. Neurosci. 21, 5089–5098 (2001).

32. Kouzarides, T. Modificările cromatinei și funcția lor. Celula 128, 693–705 (2007).

33. Konermann, S. şi colab. Activarea transcripțională la scară genomică de către un complex CRISPR-Cas9 proiectat. Nature 517, 583–588 (2015).

34. Sharma, M., Shetty, MS, Arumugam, TV & Sajikumar, S. Inhibarea histonei deacetilazei 3 restabilește marcarea sinaptică și captarea în îmbătrânire prin activarea factorului nuclear kappa B. Sci. Rep. 5, 16616 (2015).

35. Kramar, EA și colab. Dovezi sinaptice pentru eficacitatea învățării distanțate. Proc. Natl Acad. Sci. SUA 109, 5121–5126 (2012).

36. Barrett, RM et al. Knockout-ul focal hipocampal al CBP afectează modificările specifice ale histonelor, potențarea pe termen lung și memoria pe termen lung. Neuropsychopharmacology 36, 1545– 1556 (2011).

37. Franklin, AV, Rusche, JR & McMahon, LL Potențarea crescută pe termen lung la sinapsele celulelor granulare dentate de cale medial-perforante induse de inhibarea selectivă a histonei deacetilazei 3 necesită proteina de retard mental X fragil. Neurobiol. Învăța. Mem. 114, 193– 197 (2014).

38. Silva, AJ, Kogan, JH, Frankland, PW & Kida, S. CREB și memorie. Annu. Pr. Neurosci. 21, 127– 148 (1998).

39. Kida, S. & Serita, T. Rolurile funcționale ale CREB ca regulator pozitiv în formarea și îmbunătățirea memoriei. Brain Res. Taur. 105, 17–24 (2014).

40. Smith, KT, Nicholls, RD & Reines, D. Gena care codifică proteina fragilă de legare a ARN-ului X este controlată de factorul respirator 2 nuclear și familia de factori de transcripție CREB. Acizi nucleici Res. 34, 1205– 1215 (2006).

41. Wang, H. şi colab. Rolurile CREB în reglarea FMRP de către receptorii glutamat metabotropi din grupul I din cortexul cingulat. Mol. Brain 5, 27 (2012).

42. Cermakian, N., Monaco, L., Pando, MP, Dierich, A. & Sassone-Corsi, P. Altered behavioral rhythms and clock gene expression in soares with a targeted mutation in the Period1 gene. EMBO J. 20, 3967–3974 (2001).

43. Halder, R. şi colab. Modificările de metilare a ADN-ului în genele de plasticitate însoțesc formarea și menținerea memoriei. Nat. Neurosci. 19, 102– 110 (2016).

44. Duke, CG, Kennedy, AJ, Gavin, CF, Day, JJ & Sweatt, JD Reorganizarea epigenomică dependentă de experiență în hipocamp. Învață Mem. 24, 278–288 (2017).

45. Sakai, T., Tamura, T., Kitamoto, T. & Kidokoro, Y. O genă ceas, punct, joacă un rol cheie în formarea memoriei pe termen lung la Drosophila. Proc. Natl Acad. Sci. SUA 101, 16058– 16063 (2004).

46. ​​Abarca, C., Albrecht, U. & Spanagel, R. Sensibilizarea și recompensa la cocaină sunt sub influența genelor și ritmului circadian. Proc. Natl Acad. Sci. SUA 99, 9026–9030 (2002).

47. Phan, TX, Chan, GC, Sindreu, CB, Eckel-Mahan, KL & Storm, DR Oscilația diurnă a activităților MAP (proteina activată de mitogen) kinazei și adenililciclazei din hipocamp depinde de nucleul suprachiasmatic. J. Neurosci. 31, 10640– 10647 (2011).

48. Vogel-Ciernia, A. & Wood, MA Examinarea locației obiectului și a memoriei de recunoaștere a obiectelor la șoareci. Curr. Protoc. Neurosci. 69, 1– 17 (2014).

49. Orozco-Solis, R. et al. Ceasul circadian din hipotalamusul ventromedial controlează consumul de energie ciclică. Cell Metab. 23, 467–478 (2016).

50. Eckel-Mahan, K. & Sassone-Corsi, P. Fenotiparea ritmurilor circadiene la șoareci. Curr. Protoc. Soarece Biol. 5, 271–281 (2015).

51. Schnell, SA, Staines, WA & Wessendorf, MW Reducerea autofluorescenței asemănătoare lipofuscinei în țesutul marcat fluorescent. J. Histochem. Citochim. 47, 719–730 (1999).

52. Pfaff, MW Un nou model matematic pentru cuantificarea relativă în RT-PCR în timp real. Acizi nucleici Res. 29, e45 (2001).

53. Pfaff, MW, Horgan, GW & Dempfle, L. Instrument software de exprimare relativă (REST) ​​pentru compararea grupurilor și analiza statistică a rezultatelor expresiei relative în PCR în timp real. Acizi nucleici Res. 30, e36 (2002).

54. Trapnell, C. şi colab. Analiza diferențială a expresiei genelor și a transcripției a experimentelor ARN-seq cu TopHat și Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562–578 (2012).

55. Mortazavi, A., Williams, BA, McCue, K., Schaeffer, L. & Wold, B. Cartografierea și cuantificarea transcriptomilor de mamifere prin ARN-Seq. Nat. Metodele 5, 621–628 (2008).

56. Kayala, MA & Baldi, P. Server web Cyber-T: analiză diferențială a datelor de mare debit. Acizi nucleici Res. 40, W553–W559 (2012).

57. Baldi, P. & Long, AD Un cadru bayesian pentru analiza datelor de expresie microarray: t-test regularizat și inferențe statistice ale modificărilor genelor. Bioinformatica 17, 509–519 (2001).