Partea 3: Efluxul de magneziu din celulele Drosophila Kenyon este esențial pentru memoria pe termen lung normală și îmbunătățită de dietă

pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com

Vă rugăm să faceți clic aici pentru partea 2

Apasa peCistanche beneficii și efecte secundare pentru memorie

a fost limitată la muștele adulte, sugerând că UEX are un rol mai susținut în fiziologia neuronală. În schimb, distrugerea expresiei uex în neuronii abdominali sau a{{0}}b{0 nu a afectat LTM. Activitatea neuronilor a0 b{{0 este necesară după antrenament pentru a consolida LTM apetitiv (Krashes și Waddell, 2008), în timp ce ieșirea KC abc și abs, împreună și separat, este necesare pentru exprimarea sa (Krashes și Waddell, 2008; Perisse et al., 2013). Prin urmare, observarea performanței normale a LTM la muștele cu pierdere a funcției uex în neuronii abdominali și a0b0 pledează împotriva unei deficiențe generale a funcției neuronale ab atunci când se manipulează uex.

Dietary Mg2 plus nu a putut îmbunătăți performanța LTM defectuoasă a muștelor care erau în mod constitutiv mutante uex sau găzduite de pierderea funcției uex restricționată de KC. Cu toate acestea, exprimarea uex în ab KC-urile muștelor mutante uex a restabilit capacitatea Mg2 plus de a îmbunătăți performanța. Prin urmare, ab KC-urile sunt locusul celular pentru Mg2 plus -amplificatmemorieîn muscă.

Poate că pare contraintuitiv faptul că efluxul de magneziu direcționat de UEX este necesar în KC pentru a susținememorie-efectele de îmbunătățire ale hrănirii cu Mg2 plus, atunci când Mg2 plus alimentar crește KC [Mg2 plus ]i . În această etapă, putem doar să speculăm de ce este cazul. Presupunem că creierul și ab KC, în special, trebuie să se adapteze într-un mod echilibrat la nivelurile mai ridicate de Mg2 intracelular și extracelular plus care rezultă din suplimentarea dietei. Imaginile noastre live ale KC [Mg2 plus ]i în creierele de tip sălbatic și mutante uex sugerează că efluxul direcționat de UEX este probabil să fie un factor esențial în menținerea homeostatică activă, și poate provocată de stimuli, a acestor niveluri ridicate.

Un număr de tipuri de celule de mamifere extrudă Mg2 plus într-o manieră dependentă de cAMP, la câteva minute după ce au fost expuse la stimularea b-adrenergică (Romani și Scarpa, 2000; Vormann și Günther, 1987; Jakob și colab., 1989; Romani și Scarpa, 1990b; Romani și Scarpa, 1990a; Vormann și Gu¨nther, 1987; Gu¨nther și colab., 1990; Howarth și colab., 1994). Prezența unui domeniu CNBH sugerează că UEX și CNNM-urile ar putea fi reglementate direct de cAMP. Am testat importanța CNBH prin introducerea unei substituții de aminoacizi R622K care ar trebui să blocheze legarea cAMP în UEX CNBH. Această mutație subtilă a abolit capacitatea transgenei uexR622K de a restabili performanța LTM muștelor mutante uex. De asemenea, am folosit CRISPR pentru a muta CNBH în locusul uex nativ. Deși ștergerea CNBH din CNNM4 a abolit Mg2 plus activitatea de eflux (Chen et al., 2018), muștele homozigote pentru leziunea uexT626NRR au fost viabile, demonstrând că păstrează un nivel suficient de funcție UEX. Cu toate acestea, aceste muște au prezentat tulburări imediate și pe termen lungmemorie. În plus, performanța muștelor uexT626NRR nu a putut fi îmbunătățită prin hrănire cu Mg2 plus. Aceste date demonstrează că un CNBH intact este un element critic almemorie-funcția UEX relevantă. Legarea proteinelor adaptoare de clatrină la CNNM4 CNBH a fost implicată în țintirea bazolaterală (Hirata și colab., 2014), sugerând că UEXT626NRR ar putea fi localizat inadecvat în KC. În plus, expresia KC a variantei mutante CNNM2 E122K, care păstrează funcția reziduală

dar are un defect de trafic (Arjona et al., 2014), nu a restabilit defectul uex LTM.

Deși a fost pus la îndoială dacă domeniile CNNM2/3 CNBH leagă nucleotidele ciclice (Chen et al., 2018), am constatat că FSK a evocat o creștere a ab KC [Mg2 plus ]i care a fost sensibilă la mutația uex și că UEX: :HA a fost localizat greșit în rut2080 adenilat ciclază (Han și colab., 1992) și dnc1 fosfodiesteraza (Dudai și colab., 1976) care învață muște mutante defecte. În timp ce eticheta UEX::HA a fost distribuită uniform în KC g, abc și abs la muștele de tip sălbatic, eticheta UEX::HA a fost diminuată în KC g și abs și a fost mai puternică în neuronii abc la mutanții rut2080 și dnc1. Manipulările cronice ale cAMP la mutanți sunt, prin urmare, în concordanță cu cAMP care afectează localizarea UEX, poate prin interacțiunea cu CNBH. În plus, localizarea UEX modificată poate contribui lamemoriedefecte ale muștelor rut2080 și dnc1.

Datele noastre fiziologice folosind Magnesium Green în cultura de celule de mamifere și reporterul MagIC codificat genetic în ab KC demonstrează că Fly UEX facilitează Mg2 plus efluxul. Stimularea creierului muștei cu FSK a evocat o creștere mai mare a ab KC [Mg2 plus ]i în creierele mutante uex decât în ​​controalele de tip sălbatic, ceea ce oferă prima dovadă că UEX limitează o creștere a [Mg2 plus ]i în Drosophila KC. Înregistrările noastre MagIC au dezvăluit, de asemenea, o oscilație lentă (centrată în jurul 0.015 Hz, aproximativ o dată pe minut) a ab KC [Mg2 plus ]i care depindea de UEX. Nu înțelegem încă funcția fiziologică a acestei fluctuații [Mg2 plus ]i, deși probabil reflectă o proprietate homeostatică a celulelor la nivel de sisteme. Activitatea oscilatorie biochimică joacă un rol crucial în multe aspecte ale fiziologiei celulare (Nova´k și Tyson, 2008). Cel mai important, fluctuația temporizată circadiană a [Mg2 plus ]i leagă metabolismul energetic celular dinamic de translația controlată de ceas prin calea mTOR (ținta mecanicistă a rapamicinei) sensibilă Mg2 plus (Feeney și colab., 2016). Prin urmare, este posibil ca oscilațiile lente de Mg2 plus să unească rolurile pentru cAMP, UEX, fluxul de energie (Plac¸ais et al., 2017) și traducerea dependentă de mTOR care stă la baza plasticității sinaptice relevante pentru LTM (Casadio și colab., 1999). ; Huber și colab., 2000; Beaumont și colab., 2001; Hou și Klann, 2004; Hoeffer și colab., 2008).

Contact pentru partajarea reactivilor și a resurselor

O listă completă de reactivi poate fi vizualizată în Tabelul cu resurse cheie.

Informații suplimentare și solicitări de resurse și reactivi trebuie adresate și vor fi îndeplinite de către persoana de contact principală, Scott Waddell (scott.waddell@cncb.ox.ac.uk).

Modelul experimental și detaliile subiectului

Tulpini de mușcă

Dacă nu se specifică altfel, muștele au fost crescute pe hrana standard din făină de porumb sub un ciclu de 12 ore lumină-întuneric la 60% umiditate și 25 °C. Muștele de testare și de control pentru experimentele GAL80ts au fost crescute la 18 °C. Muștele cu sex mixt în vârstă de 1–7-zi au fost folosite în experimente.

Canton-S a fost tulpina de tip sălbatic. Liniile de driver GAL4 utilizate în acest studiu sunt c739-GAL4 (McGuire și colab., 2001), c305a-GAL4 (Krashes și colab., 2007), NP7175-GAL4 (Tanaka și colab., 2007), 2004), 0770-GAL4 (Gohl și colab., 2011), MB247-GAL4 (Zars și colab., 2000), nSyb-GAL4 (Bloomington Drosophila Stock Centre, BDSC 51635), elav-GAL4 (BDSC, 8765) și uex-GAL4 (Kvon și colab., 2014); Centrul de Resurse pentru Drosophila din Viena, VDRC, VT23256-GAL4). Liniile UAS obținute de la centrul de stoc sunt UAS-CD8::GFP (BDSC, 5136), UAS-NmdarRNAi (BDSC, 25941) și UAS-uexRNAi (BDSC, 36116). Sunt descrise diferitele linii mutante și transgenice, uexMI01943 (Venken și colab., 2011; BDSC, 32805), uexNC1 (BDSC, 7167), rut2080 (Han și colab., 1992) și dnc1 (Dudai și colab., 1976) , tubP- GAL80ts (McGuire şi colab., 2003) şi PhsILMiT (BDSC, 24613). Liniile de excizie uexMI01943.ex1 și uexMI01943.ex2 Minos au fost generate utilizând procedura descrisă în Arc și colab., 1997. Schema de împerechere detaliată este prezentată în Figura 2 - suplimentul figura 2A. Potențiale linii de excizie au fost stabilite de la muștele individuale care prezintă fenotipul de culoare galbenă a corpului. ADN-ul genomic a fost extras din șase astfel de linii și ADN-ul care flanchează uexMI01943 MiMIC a fost amplificat prin PCR și secvențiat. Liniile uexMI01943.ex1 și uexMI01943.ex2 au fost identificate pentru a găzdui excizii precise, după ce au restabilit secvența genomică de tip sălbatic. Consultați Tabelul de resurse pentru PCR și secvențele primerilor de secvențiere. Schema detaliului secvenței uexMI01943 MiMIC și în excizii este prezentată în figura 2 - suplimentul figura 2B. Pentru a construi muște transgenice UAS-uex, o secvență de codificare uex de lungime completă (CDS) a fost donată prin RT-PCR. ARN-ul total a fost izolat din muștele de tip sălbatic folosind TRIZOL (Thermo Fisher, 15596018) și transcris invers în ADNc utilizând sistemul de sinteză a primului caten SuperScript III (Invitrogen, 18080400). Acest amestec total de ADNc a fost folosit ca șablon pentru a amplifica CDS-ul uex. Consultați Tabelul de resurse pentru secvențele de primer. Produsul PCR a fost digerat cu SacII şi Xhol şi apoi ligat în situsurile complementare ale pUAST (Brand şi Perrimon, 1993). CDS-ul uex donat pUAST a fost complet secvențial și verificat pentru a reprezenta 2505 bp a cadrului de citire a ADNc uex de tip sălbatic (rețineți că toate cele patru izoforme posibile de ARNm uex, FlyBase Release 6, codifică aceeași proteină de 834 aminoacizi). Muștele transgenice UAS-uex au fost generate comercial (Bestgene) prin transformare cu vectorul pUAST-uex. Am cartografiat inserția cromozomului UAS-uex a 10 linii transgenice independente și am testat comportamental trei linii, denumite UAS-uex3M, UAS-uex5M și UAS-uex8M, cu o inserție pe al treilea cromozom. Muștele UAS-uex3M au fost cele utilizate pe tot parcursul studiului și denumite UAS-uex în manuscris.

Muștele transgenice UAS-uexR622K au fost generate similar muștelor UAS-uex. O mutație missense a fost introdusă la codonul 622 al UEX în domeniul CNBH, mimând cea creată anterior în domeniul de legare a cAMP al subunității de reglare a proteinei kinazei A (Bubis și colab., 1988). Mutația schimbă codonul CGT care codifică Arg în AAA care codifică Lys. Mutația a fost introdusă în CDS-ul uex de tip sălbatic utilizând Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs, E2621S) așa cum este descris în „Metode îmbunătățite pentru mutageneza dirijată pe site folosind Gibson Assembly Master Mix” (Notă de aplicare NEB). Seturile de primeri utilizate sunt detaliate în Tabelul de resurse. Produsul ansamblului Gibson a fost amplificat în continuare prin PCR și produsul rezultat a fost donat în vectorul pUAST și secvențiat. Inserțiile transgenelor au fost mapate ca pentru UAS-uex și una dintre cele două inserții mapate la al treilea cromozom a fost utilizată în experimente de comportament.

Liniile de muște transgenice UAS-CNNM2, UAS-CNNM2E122K, UAS-CNNM2E357K, UAS-CNNM2S269W și UAS-CNNM2T568I au fost generate prin transformarea cu constructe pUAST care conțineau versiuni de tip sălbatic sau cu mutații punctiforme ale unui șoarece marcat cu CNNM2 ADNc: HA), descris în Arjona și colab., 2014. Versiunile de tip sălbatic sau mutante ale CNNM2 au fost amplificate din clonele originale mCNNM2::HA în plasmidele pCiNEO_IRES{_GFP (Arjona și colab., 2014). Primele sunt detaliate în Tabelul de resurse. Produsele PCR au fost digerate cu Xhol și Xbal și ligați în situsurile complementare în pUAST. Inserțiile fiecărui construct pe al treilea cromozom au fost identificate prin mapare așa cum este descris mai sus și au fost utilizate în experimentele de comportament. Rețineți că toate constructele de codificare CNNM2 utilizate în studiu sunt etichetate HA, deși notația este adesea omisă pentru concizie.

Liniile de muște transgenice UAS-MagFRET-1 au fost generate prin transformare cu construcții pJFRC-MUH care conțin MagFRET-1 CDS, care a fost sub-clonat din plasmida pCMVMagFRET{-1, descrisă în Lindenburg și colab. , 2013. Introducerile sunt detaliate în Tabelul de resurse. Produsele PCR au fost digerate cu Xhol și Xbal și ligați în situsurile complementare din pJFRC-MUH. Inserția constructului a fost mediată de sistemul de transgeneză specifică locului și locul de aterizare este attP2 (pe al treilea cromozom).

Liniile de muște transgenice UAS-MagIC și UAS-MARIO au fost generate prin transformare cu constructe pTW care conțin MagIC/MARIO CDS, care au fost sub-clonate din plasmidele MagIC/ pcDNA3 și MARIO/pcDNA3, furnizate cu amabilitate de T. Nagai: (Maeshima și al., 2018 și Koldenkova și colab., 2015). MagIC/MARIO CDS au fost mai întâi amplificate prin PCR din MARIO/pcDNA3 și, respectiv, MagIC/pcDNA3 și au fost donate în vectorul pENTR/D-TOPO. Primele sunt detaliate în Tabelul de resurse. Rețineți că primerul de sens MARIO a fost proiectat să se suprapună cu secvența pcDNA3 la locul de inserție al lui MARIO. MagIC/MARIO CDS au fost donate în continuare în vectorul de destinație Gateway pTW (Drosophila Gateway Vector Collection).

Locusul uexD editat CRISPR/Cas9 a fost generat comercial de GenetiVision. Schema de editare este prezentată în Figura 2 – suplimentul de figura 2C. Locusul uex se află în orientare inversă pe cromozomul 2R, acoperind o regiune de 49.141 bp între pozițiile 3.900.285 și 3.949.425 (FlyBase, Release 6). Următoarea descriere se referă la aceste coordonate din locusul uex. Pentru a genera uexD, două plasmide gARN și o plasmidă donor de ADN dublu catenar (dsDNA) au fost construite și injectate în embrioni nos-Cas9 (BDSC, 54591). După cum este indicat în Figura 2 - suplimentul din figura 2C și detaliat în Tabelul de resurse, gRNA1 din amonte se află în Exonul 6 și vizează secvența 30.930.30.952. GRNA2 corespunzător din aval se află între Exonul 7 și Exonul 8 între 33.988 și 34.010. Ambele gARN-uri au fost donate individual în pCFD3-dU63gRNA (Addgene, 49410). Locul de tăiere al gRNA1 ar trebui să fie între 30.946 și 30.947, în timp ce gRNA2 ar trebui să conducă la o tăiere între 33.993 și 33.994. Un braț de omologie din amonte de 795 bp (30.152,30.946) și un braț de omologie din aval de 977 pb (33.994,34.970) au fost donați în plasmida ADN donor. Un codon de terminare (STOP, în toate cele trei cadre de citire) a fost introdus între cele două brațe de omologie și urmat de o casetă GFP condusă de un promotor 3xP3. Coloana vertebrală a ADN-ului donatorului a fost proiectată de GenetiVision și secvența completă a donatorului pentru linia uexD este disponibilă la cerere. Editarea reușită a fost identificată prin exprimarea GFP în ochii muștei și confirmată prin PCR genomică și secvențiere. La muștele uexD, un fragment de 3047 bp de la 30.947 la 33.993 a fost înlocuit cu secvența dintre cele două brațe de omologie din plasmida donor, în principal semnalul STOP și caseta GFP. Alela uexD trunchiază ORF uex. Primerii utilizați pentru verificarea PCR genomică sunt detaliați în Tabelul de resurse. Transgena nos-Cas9 (pe cromozomul X) a fost îndepărtată prin încrucișare.

Muștele editate CRISPR/Cas9-uex::HA au fost generate de WellGenetics folosind sistemul ScarlessDsRed dezvoltat de laboratorul lui Kate O'Connor-Giles (plasmidă nepublicată, originală donată lui Addgene, #80822). O etichetă 6XHA a fost fuzionată în cadru la capătul carboxi-terminal al UEX prin inserarea secvenței de codificare 6XHA imediat înainte de codonul STOP nativ în locusul uex (Figura 3 - figura supliment 1A). Procesul a implicat două etape principale. În pasul 1, o etichetă 6XHA împreună cu un transpozon pBAC care conține o casetă DsRed au fost introduse în cadru cu codonul STOP al uex utilizând editarea genomului mediată de CRISPR/Cas9-prin reparare direcționată de omologie (HDR) folosind 1 gARN și un donor de plasmidă dsDNA. ARNg se află la 50 bp de codonul STOP uex și ar trebui să direcționeze o tăietură între 48.587 și 48.588. ARNg a fost donat într-o plasmidă pCFD3-dU63gARN. Un braț în amonte de 1.200 bp (47.438,48.637) și un braț în aval de 1.033 bp (48.641,49.673) au fost donați în plasmida ADN donor cu scheletul pUC57-Kan (2579 bp). Consultați Tabelul de resurse pentru secvențele de ARNg și primer. O mutație Protospacer Adjacent Motif (PAM) (TCC la TCG, 48.581,48.583) a fost introdusă la donator pentru a promova HDR. O etichetă 6XHA, urmată de un transposon pBAC care conține o casetă DsRed condusă de promotor 3XP3, a fost introdusă între cele două brațe de omologie. Un motiv de recunoaștere pBAC TTAA este încorporat în codonul STOP al 6XHA. Secvența completă a donatorului este disponibilă la cerere. Plasmidele donatoare și gARN au fost injectate în embrioni nos-Cas9 (NIG-FLY, CAS0002). Editarea cu succes a fost identificată prin exprimarea DsRed în ochii muștei și confirmată prin PCR genomică și secvențiere. Au fost identificate șase linii pozitive independente și patru au trecut validarea PCR. Dintre aceste patru linii, una mai a trecut validarea secvențierii și este linia intermediară reprezentată în Figura 3 - suplimentul figura 1A. Din această linie au fost stabilite patru stocuri izogenizate și echilibrate. În pasul 2, markerul de selecție DsRed a fost excizat prin transpunere PiggyBac (PBac) cu linia helper Tub-PBac (BDSC, 8285). Cinci linii viabile homozigote cu excizie reușită au fost validate prin PCR genomică și secvențiere. Unul desemnat uex::HA a fost folosit în experimentele din manuscris.

Pentru a construi muștele uexT626NRR editate CRISPR/Cas{{0}}, am proiectat și donat un gARN și am proiectat și comandat (Sigma) o oligo-deoxinucleotidă monocatenar (ssODN). Secvențele gARN și ssODN sunt detaliate în Tabelul de resurse. Așa cum am plănuit să facem o singură substituție de aminoacid R622K în domeniul UEX CNBH, donorul ssODN de 120 bp a fost centrat pe codonul R622 și poartă schimbarea codonului CGT la AAA (la 31.179,31.181) corespunzătoare lui R622K. Locul de tăiere așteptat al ARNg (între 31.192 și 31.193) este la doar 11 bp distanță de punctul de mutație așteptat. Pentru a spori probabilitatea HDR, care este scăzută folosind ssODN ca donator, am injectat comercial (GenetiVision) material de editare în 250 de embrioni lig4 KO vasa-Cas (Zimmer et al., 2016). Am obținut 37 de muște G0 viabile din embrionii injectați. Un total de 224 de muște G1 au fost supuse la PCR genomice cu o singură muscă și secvențiere pentru a detecta mutația așteptată. Primeri detaliate în Tabelul de resurse. Am identificat 59 de linii presupuse editate de la screeningul din prima rundă, iar dintre acestea 12 au fost confirmate. În ciuda utilizării lig4 KO vasa-Cas9, am detectat numai evenimente de îmbinare a capătului neomolog (NHEJ) în loc de mutații punctuale mediate de HDR. Din cele 12 linii editate, șase au fost letale homozigote, iar celelalte șase au fost viabile. În patru dintre liniile homozigote viabile, am găsit o înlocuire a lui G cu T la poziția 31.192 împreună cu o inserție în cadru de 6 bp a ATCTTC între 31.192 și 31.193. Această editare NHEJ corespunde T626 ! Modificarea NRR în secvența de proteine ​​a UEX (Figura 5A). Cromozomul X vasa-Cas9 a fost îndepărtat din aceste linii prin încrucișare și o linie denumită uexT626NRR a fost utilizată în experimentele de comportament din manuscris.

Detalii metode

Experimente comportamentale

Pentru experimentele comportamentale T-labirint, au fost folosite muște cu sex mixt de 1–7-zi. Mirosurile au fost 4-metilciclohexanol (MCH) și 3-octanol (OCT), diluate ~1:103 (în special, 9 ml MCH sau 7 ml OCT în 8 ml ulei mineral). Toate experimentele au fost efectuate la 23˚C și 55-65% umiditate relativă.

Apetitiv imediat și mai târziumemorieexperimentele au fost efectuate în esență așa cum este descris (Krashes și Waddell, 2008; Perisse și colab., 2013). Loturi de 100-120 de muște au fost înfometate timp de 21-23 de ore înainte de antrenament în fiole de 35 ml care conțineau ~ 2 ml 1% agar (ca sursă de apă) și o hârtie de filtru de 2 cm 4 cm. Hârtiile de zahăr (5 cm 7,5 cm) pentru antrenament au fost preparate prin înmuiere cu 4 ml de zaharoză 2 M și uscare peste noapte. Hârtiile de apă de aceeași dimensiune au fost înmuiate cu apă și lăsate peste noapte. Pentru antrenamentul apetitiv, muștele au fost transferate dintr-un tub de foame într-un tub de antrenament cu o hârtie uscată de „apă” și imediat atașate de brațul de antrenament al labirintului T și expuse la mirosul CS timp de 2 minute, urmate de 30 de secunde de aer curat. Muștele au fost apoi transferate într-un alt tub de antrenament cu hârtie de zahăr uscată, atașate la labirintul T și expuse mirosului CS plus timp de 2 minute. Imediatmemoriea fost testat prin transportarea muștelor la punctul de alegere T și permițându-le 2 minute pentru a alege între cele două fluxuri de miros. Pentru a testa 24 de orememorie, muștele au fost îndepărtate din tubul de antrenament și transferate în flacoane standard de făină de porumb pentru hrană timp de 1 oră, apoi transferate înapoi în flacoane de foame timp de 23 de ore până la testare. Indicele de performanță a fost calculat ca numărul de muște din CS plus brațul minus numărul din brațul CS, împărțit la numărul total de muște. MCH și OCT au fost utilizate alternativ ca CS plus sau CS și un singur eșantion, sau n, reprezintă indicele mediu de performanță din două grupuri antrenate reciproc.

Pentru testele de comportament după Mg2 plus hrănire, muștele de 1–2-zi au fost găzduite în flacoane cu Mg2 plus hrană suplimentată timp de 1–5 zile înainte de a fi înfometate pentru antrenament și testare apetitivă, așa cum este descris mai sus. Pentru a face 80 mM [Mg2 plus ] hrană, s-au adăugat 40 ml de soluție 1 M de MgCl2 la 460 ml de hrană lichidă normală pentru muște; Mâncarea 1 mM [Mg2 plus ] a fost făcută prin diluarea a 0,5 ml 1 M MgCl2 în 39,5 ml apă MilliQ și adăugarea acesteia la 460 ml hrană lichidă. Alimentele au fost împărțite și răcite pentru a se solidifica. Alimentele suplimentate cu MgSO4 și CaCl2 au fost preparate în același mod.

Aversiv imediat și 24 de orememorieexperimentele au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (Hirano și colab., 2013; Perisse și colab., 2016; Tully și Quinn, 1985). Grupuri de 100-120 de muște au fost antrenate fie cu un ciclu de antrenament aversiv, fie cu cinci cicluri distanțate la intervale de 15 minute între încercări (antrenament distanțat). Pentru aversivă imediatămemorie, muștele au fost testate după antrenament cu un ciclu. Aversiv 24 de orememoriea fost testat folosind două protocoale diferite. În protocolul facilitat de post, muștele au fost înfometate timp de 16 ore înainte de antrenamentul cu un singur ciclu (Hirano și colab., 2013). Pentru antrenamentul la distanță, muștele nu erau înfometate înainte de antrenament. Muștele au fost hrănite cu hrană normală pentru muște timp de 24 de ore după antrenamentul facilitat de post și la distanță, înainte de a fi testate pentrumemorieperformanţă. În timpul fiecărui ciclu de antrenament aversiv, muștele au fost expuse timp de 1 minut la un prim miros (CS plus) asociat cu douăsprezece șocuri electrice de 90 V la intervale de 5 s. După 45 s de aer curat, un al doilea miros (CS) a fost prezentat timp de 1 min. fără șoc. Indicele de performanță a fost calculat ca numărul de muște din brațul CS minus numărul din CS plus

braț, împărțit la numărul total de muște. MCH și OCT au fost utilizate alternativ ca CS plus sau CS și un singur eșantion, sau n, reprezintă indicele mediu de performanță din două grupuri antrenate reciproc.

Testele de acuitate senzorială (Figura 2 - sursă de date 1) au fost efectuate așa cum este descris (Keene și colab., 2004; Keene și colab., 2006; Schwaerzel și colab., 2003) cu modificări. Pentru a testa acuitatea olfactiva, muștelor neantrenate li s-a dat 2 minute pentru a alege între un miros diluat, așa cum este utilizat în condiționare și aerul barbotat prin ulei mineral în labirintul T. Un indice de evitare a fost calculat ca numărul de muște din brațul de aer minus numărul din brațul de miros, împărțit la numărul total de muște. Evitarea șocurilor electrice a fost efectuată și calculată în mod similar. Muștele neantrenate au ales timp de 1 minut între două tuburi care conțineau rețele electrice, dar doar unul era conectat la sursa de alimentare. Un indice de evitare a fost calculat ca numărul de muște din brațul neelectrificat minus numărul din brațul electrificat, împărțit la numărul total de muște. Pentru a evalua acuitatea zahărului, muștelor înfometate li s-a dat 2 minute pentru a alege între un braț al labirintului T care conținea o hârtie de zahăr uscată și celălalt care conținea o hârtie de filtru „apă” uscată. Ambele lucrări au fost pregătite ca la apetitivmemorieteste. Un indice de preferință a fost calculat ca numărul de muște din brațul de zahăr minus cel din celălalt braț, împărțit la numărul total de muște. Am descoperit că menținerea luminii aprinse în camera de comportament și fluxul de aer care trece prin tuburile de testare a îmbunătățit foarte mult indicele de preferință la muștele de tip sălbatic și, prin urmare, a aplicat acele condiții pentru toate testele de preferință pentru zahăr.

Anticorp anti-UEX și western blot

Un anticorp policlonal UEX a fost dezvoltat comercial de Eurogentec. Două peptide au fost sintetizate ca antigene: Peptida 1 H-CLPKLDDKFESKQSKP-OH (16aa) și Peptida 2 H-CVDNRTK TRRNRYKKA-NH2 (16aa) și injectate la iepuri. Numai Peptida 2 a indus un răspuns imun robust și a fost procesată în continuare. Serul final a fost purificat împotriva peptidei 2 și utilizat pentru analiza Western blot ca o diluție 1:2000.

Pentru fiecare probă în Western blot, proteinele au fost extrase din 20 capete de muște prin omogenizare completă în 120 ml de tampon de probă proteică care conține un amestec de 30 ml 2-mercaptoetanol (Bio-Rad), 270 ml 4 tampon de probă Laemmli (BioRad) și 900 ml apă fără nucleaze (Invitrogen). Probele au fost apoi fierte pe un bloc termic de 100 °C timp de 3 minute și centrifugate timp de 10 minute înainte de încărcare. Un volum de probă echivalent cu patru capete a fost încărcat în fiecare linie de gel SDS-PAGE. Proteinele au fost transferate pe membrana PVDF și blocate în lapte degresat 5% timp de 1 oră la 25°C cu agitare de 35 rpm. Membrana a fost apoi incubată în soluţie anti-UEX (1:2000 de iepure anti-UEX în lapte degresat 5%) peste noapte la 4°C cu agitare de 35 rpm. Membrana a fost spălată rapid de trei ori, urmată de spălări de 3 10 min în soluție TBST (100 ml de soluție TBS 10, BioRad, diluată în 900 ml de apă MilliQ, cu 0,1 procente Tween 20) și apoi incubată cu HRP conjugat soluție secundară de anticorpi (1:5000 de capră anti-iepure în 5% lapte degresat) timp de 1-2 ore la 25°C cu agitare de 35 rpm. Membrana a fost din nou spălată rapid de trei ori, urmată de spălări de 3 10 min în TBST. Benzile de proteine ​​au fost vizualizate folosind substratul Pierce ECL Western blot (Life technologies, 32134). Membrana a fost apoi stripată utilizând soluția Millipore ReBlot Plus Mild (Merck, 2502), blocată din nou în lapte degresat 5% și testată cu anticorp primar anti-Tubulină de șoarece (1:2000, Sigma, T6199) și anti-capră conjugat HRP corespunzător. anticorp secundar de șoarece (1:5000) urmând protocolul detaliat mai sus.

Imunocolorarea

Imunocolorarea a fost efectuată așa cum este descris (Wu și Luo, 2006). Creierele de la muștele adulte de 1- până la 5-zi au fost disecate în PBS și fixate timp de 20 minute în PBS cu 4% paraformaldehidă la temperatura camerei. Au fost apoi spălate de două ori pentru scurt timp în 0,5 procente PBT (2,5 ml Triton-X1{00 în 497,5 ml PBS) și trei spălări de 20 de minute. Creierele au fost apoi blocate timp de 30 de minute la temperatura camerei în PBT care conține 5% ser normal de capră și apoi incubate cu anticorpi primari și secundari cu rotație ușoară (35 rpm) la 4 °C timp de 1 sau 2 zile. Anticorpii primari au fost iepure anti-GFP (1:250; Invitrogen A11122) și iepure anti-HA (1:250, NEB 3724T). Anticorpul secundar de capră conjugat cu Alexa 488 (1:250; Invitrogen, A11034) a fost anticorpul secundar. Înainte și după incubarea secundară a anticorpilor, creierul a fost supus la două spălări rapide urmate de trei spălări de 20 de minute în PBT 0,5%. Creierele colorate au fost montate pe lame de sticlă în Vectashield (Vector Labs H1000) și au fost fotografiate folosind un microscop confocal Leica TCS SP5 la o mărire de 40 (HCX PL APO 40, obiectiv de imersie în ulei 1,3 CS, Leica). Stivele de imagini au fost colectate la rezoluție 1024 1024 cu pași de 1 mm și procesate folosind Fiji (Schindelin și colab., 2012). Pentru cuantificarea în Figura 3G și H, ROI dreptunghiulare de aproximativ 40 25 mm pentru glob sau ROI rotunde cu un diametru de 15 mm pentru ab, a'b' și EB au fost desenate manual pe o singură secțiune a unei scanări z-stack a creierului muștei. ROI-urile corespunzătoare au fost, de asemenea, trasate pe protocerebrumul medial superior (SMP) ca regiune de control de fundal, iar fluorescența medie a fost calculată folosind ImageJ. Intensitatea ROI a lobilor MB și a EB a fost normalizată la cea a intensității SMP respective. Pentru un singur punct de date a fost utilizată o medie între creierul stâng și cel drept. Pentru cuantificare în figurile 7C și D, ROI-urile sunt indicate în figuri, iar intensitatea ROI a fost calculată în mod similar cu rezultatele din Figura 3H. În figura 7C, a fost trasată o linie prin partea cea mai largă a vârfului lobului a. Profilul de intensitate al acestei linii a fost obținut prin ImageJ. Treizeci de puncte de date din mijlocul unui astfel de profil care se întinde pe o linie de aproximativ 15 mm au fost extrase pentru fiecare profil de linie. Profilul a fost normalizat în continuare la valoarea medie a primelor cinci puncte de date (F0) și calculat ca (F F0)/F0. Au fost reprezentate grafic valorile medii ale acestor profiluri normalizate de la diferite creiere (Figura 7C, panoul din mijloc). Profilurile din stânga și din dreapta ale creierului au fost calculate și sunt afișate separat. În Figura 7D, intensitățile relative de la diferite ROI reprezentând diferite regiuni sunt adăugate împreună pentru a genera o măsură de intensitate totală pentru MB.

Construcția de expresie a ADNcului CNNM4 uman utilizat pentru a investiga Mg2 plus efluxul în cultura celulară este cea descrisă anterior (Yamazaki și colab., 2013). Un construct care exprimă Drosophila uex a fost generat prin inserarea unei etichete FLAG în fața codonului STOP al CDS uex. ADNc-urile CNNM4 și uex marcate cu FLAG au fost ulterior inserate în eticheta pCMV-4A (Agilent) pentru exprimare în celulele HEK293. Celulele HEK293 au fost cultivate în mediu Eagle modificat de Dulbecco (Nissui) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS) și antibiotice. Plasmidele de expresie au fost transfectate cu Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Pentru imunocolorare, celulele au fost fixate cu 3,7% formaldehidă în PBS timp de 20 min și apoi permeabilizate cu 0,2% Triton X-100 în PBS timp de 5 minute, ambele la temperatura camerei. Apoi au fost blocați cu PBS care conține 3% FBS și 10% albumină serică bovină (tampon de blocare) timp de 1 oră la temperatura camerei. Celulele au fost apoi incubate peste noapte la 4°C cu anticorp anti-FLAG de iepure (F7425, Sigma-Aldrich) diluat în tampon de blocare, spălate 3 cu PBS și incubate timp de 1 oră la temperatura camerei cu Alexa 488-anti-conjugat. IgG de iepure (Invitrogen) și rodamină-faloidină (pentru vizualizarea F-actinei, Invitrogen) diluate în tampon de blocare. După trei spălări cu PBS, lamele au fost montate pe lame și au fost fotografiate cu un microscop confocal (FluoView FV1000; Olympus).

Imagistica Mg2 plus cu Magnesium Green a fost efectuată așa cum este descris (Yamazaki și colab., 2013), cu ușoare modificări. Pentru a evita scăderea potențială a [Mg2 plus ]i cu proteinele exprimate, celulele HEK293 transfectate au fost cultivate în mediu de creștere suplimentat cu 40 mM MgCl2 până la imagistica. Celulele au fost apoi incubate cu tampon de încărcare Mg2 plus (78,1 mM NaCI, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 40 mM MgCl2, 5,5 mM glucoză și 5,5 mM HEPES-KOH [pH 7,4]), inclusiv 2 mM Magneziu Green-AM (Invitrogen), timp de 30 min la 37˚C. Celulele au fost apoi clătite o dată cu tampon de încărcare și vizualizate cu un microscop Olympus IX81 echipat cu o cameră CMOS ORCA-Flash 4.0 (Hamamatsu) și o lampă cu mercur SHI-1300L (Olympus). Fluorescența a fost măsurată la fiecare 20 de secunde (excitație la 470–490 nm și emisie la 505–545 nm) sub controlul software-ului Metamorph (Dispozitive moleculare). Tamponul a fost apoi schimbat în Mg2 plus tampon liber (MgCl2 din tamponul de încărcare a fost înlocuit cu 60 mM NaCI). Datele sunt prezentate ca grafice cu linii (media a 10 celule). După imagistica, celulele au fost fixate cu PBS care conține 3,7% formaldehidă și supuse la microscopie de imunofluorescență pentru a confirma expresia proteinei.

Mg2 bazate pe FRET plus măsurători de concentrație în creierele de muște fixe

Muște de una până la două zile cu genotipul c739; UAS-MagFRET-1 au fost găzduite în flacoane cu 1 mM sau 80 mM [Mg2 plus ] hrană timp de 4 zile înainte de a fi colectate. Creierele de muște au fost disecate în PBS și fixate timp de 20 min în PBS cu 4% paraformaldehidă la temperatura camerei. Au fost apoi spălate de două ori pentru scurt timp în PBT 0,5 procente (2,5 ml Triton-X100 în 497,5 ml PBS) și trei spălări de 10 min. Creierele au fost apoi montate pe lame de sticlă în Vectashield (Vector Labs H1000) și fotografiate utilizând un câmp larg Scientifica Slicescope cu un obiectiv de imersie în apă de 40, 0,8 NA și o cameră sCMOS Andor Zyla cu software-ul Andor Solis (v4.27). Pentru a obține raportul FRET care indică concentrația Mg2 plus a neuronului ab, serii de timp au fost achiziționate alternativ între canalul cerulean și canalul citrin la 3 Hz cu 512 512 pixeli și 16 biți. Lungimea de undă de excitație pentru ambele canale este de 436 nm, în timp ce filtrul de emisie pentru cerulean este de 460–500 nm și cel pentru citrin este de 520–550 nm. Achiziția în serie începe de la canalul cerulean și durează 5 s, apoi trece la canalul citrin și durează încă 5 s, iar acest ciclu se repetă încă de două ori. Prin urmare, a fost obținut un total de 30 s (90 de cadre) stiva de imagini pentru fiecare creier. Ulterior, stivele de imagini au fost analizate folosind ImageJ și scripturi Matlab personalizate. Pe scurt, ROI-urile dreptunghiulare (Figura 1E, panoul din stânga) au fost desenate manual pe lobii ab (unul pe un lob și unul pe lobul b pentru fiecare emisferă) și în afara lobilor ab (câte unul pentru fiecare emisferă) ca control de fundal. Intensitatea fluorescenței din canalul cerulean a fost calculată împărțind fiecare ROI vertical sau orizontal la ROI de fundal și mediat între cele două emisfere pentru fiecare lob și mediat pe cele 15 cadre pentru fiecare ciclu. Acela din canalul citrin s-a obtinut la fel. Un raport FRET a fost obținut din intensitățile de mai sus, mediat în continuare între cele trei cicluri de achiziție, prezentate ca un punct de date în Figura 1E (panoul din dreapta).

Mg2 confocal plus imagistica în creierul explantului de muște

Creierele de explant care exprimă UAS-MagIC condus de c739-GAL4 au fost plasate în partea de jos a unui vas cu microgodeuri cu fund de sticlă de 35 mm (nr. piesa P35G-1.5–14 C, MatTek Corporation), sub extracelular Soluție tampon salină (103 mM NaCI, 3 mM KCl, 5 mM N-Tris, 10 mM trehaloză, 10 mM glucoză, 7 mM zaharoză, 26 mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4, 1,5 mM CaCl2, 4 mM MgO27, osmolaritate 4 mM [mgO27] pH 7,3]) după disecția în tampon fără calciu (Barnstedt și colab., 2016). Pentru a determina sensibilitatea Mg2 plus a UAS-MagIC, precum și răspunsul UAS-MagIC la alte substanțe chimice, cum ar fi EDTA, EGTA și CaCl2 (Figura 8B), creierele au fost incubate în soluție tampon salină cu 20 mg/ml digitonină pentru 6 minute înainte de imagistica (Koldenkova et al., 2015). Pentru a investiga fluctuația Mg2 plus ca răspuns la aplicarea Forskolinei (FSK) (Figura 8C–I), creierele au fost puse în soluție tampon salină fără digitonină sau incubare. În ambele situații, soluția salină se referă la tamponul (fie cu sau fără digitonină) în care este scufundat creierul.

Imaginile au fost efectuate într-un microscop confocal LSM780 (Zeiss) cu un obiectiv de 20 de aer folosind software-ul ZEN 2011. Partea Venus a MagIC a fost excitată cu un laser de 488 nm și emisia sa a fost colectată în intervalul 520-560 nm. mCherry a fost excitat cu un laser de 561 nm și emisia sa a fost colectată în intervalul 600-640 nm. Serii temporale au fost achiziționate la 0,5 Hz cu 512 512 pixeli și 16 biți. După 60 de secunde de măsurare Venus/mCherry inițială, 2-20 ml de soluție salină sau altă soluție chimică relevantă au fost adăugate prin intermediul unei micropipete în vas cu captură constantă a imaginii. Efectele agenților aplicați asupra emisiei Venus/mCherry au fost apoi înregistrate timp de 15-20 de minute.

Ulterior, stivele de imagini au fost analizate folosind ImageJ și scripturi Python personalizate. Pe scurt, ROI dreptunghiulare au fost desenate manual pe neuronii ab (unul pentru fiecare emisferă, Figura 8A), iar un alt ROI de aceeași dimensiune a fost desenat în mijloc, dar în afara MB-urilor ca control de fundal. Intensitatea fluorescenței din canalul Venus (sau mCherry) a fost calculată prin scăderea ROI de fundal din ROI-ul caliciului, respectiv, și mediat între cele două emisfere. Aceasta este denumită „Rel. Intensitatea (au)” în Figura 8D și E. Raportul dintre intensitatea Venus și mCherry a fost calculat ca „Raportul MagIC” în Figura 8B și C și Figura 8F și G. Pentru Figura 8H, intensitatea pentru cele două canale a fost calculată separat. În acest caz, „Rel. Intensitatea (DF/F0)” se referă la intensitatea relativă a fluorescenței normalizată la intensitatea medie din perioada de referință F0, calculată ca (FF{0)/F{{9} }. Intensitatea relativă DF/F0 a lui Venus a fost utilizată pentru a calcula PSD (Figura 8I) prin funcția python psd (sub matplotlib.pyplot), care a adoptat metoda parogramei medii a lui Welch (Bendat și colab., 2000).

Transcriere inversă și PCR cantitativă în timp real

Pentru fiecare probă, 120 de muște au fost congelate în azot lichid și capetele lor au fost omogenizate complet în reactiv TRIzol (Invitrogen). ARN-ul total a fost extras folosind un kit Direct-zol RNA MiniPrep (R2050) urmând instrucțiunile producătorului. ADNc a fost sintetizat folosind sistemul de sinteză SuperScript III First-Strand (Invitrogen). Au fost pregătite cinci probe independente pentru fiecare tratament sau genotip diferit. PCR cantitativă a fost efectuată în trei exemplare pentru fiecare probă de ADNc pe un instrument LightCycler 480 (Roche) utilizând SYBR Green I Master Mix (Roche). Curbele de topire au fost analizate după amplificare și ampliconii au fost vizualizați prin electroforeză pe gel de agaroză pentru a confirma specificitatea primerului. Nivelurile relative de transcriere au fost calculate prin metoda 2-DDCt (Livak și Schmittgen, 2001), iar media geometrică a valorilor Ct a trei gene de referință (Gapdh, Tbp și Ef1a 100E) a fost utilizată pentru normalizare. Primele sunt detaliate în Tabelul de resurse.

PCR inversă

PCR inversă a fost utilizată pentru a mapa poziția de inserție MiMIC în muștele uexMI01943. ADN-ul genomic a fost preparat din 15 muște adulte. ADN echivalent cu două muște a fost apoi digerat într-o reacție de restricție de 25 ml cu Mbo I și 10 ml de produs au fost ligați peste noapte la 4°C peste noapte pentru a circulariza fragmentele; Pentru PCR inversă s-au folosit 5 ml de produs de ligatură. Produsul PCR a fost purificat folosind reacția Exo/SAP (Thermo Fisher, 78201) înainte de a fi secvențiat. Secvența a fost comparată cu genomul D. melanogaster (FlyBase, Release 6) de către BLAST și s-a potrivit uniform cu regiunea 3,882,886,3,882,641 pe 2R, în concordanță cu inserția uexMI01943 raportată pe FlyBase. Primele sunt detaliate în Tabelul de resurse.

Predicția și alinierea domeniului proteic

Alinierea secvenței de proteine ​​a fost efectuată folosind Geneious R10.2.2. Predicția domeniului proteic a fost efectuată cu InterPro (Finn și colab., 2017; Jones și colab., 2014) și Phyre2 (Kelley și colab., 2015). Alinierea domeniului proteic și a structurii a fost efectuată folosind TM-align (Zhang și Skolnick, 2005). Vizualizarea structurii proteinei a fost redată în Chimera 1.11.2 (Pettersen și colab., 2004).

Cuantificare si analize statistice

Datele de comportament au fost analizate folosind Excel și Prism 6. Datele de imagine au fost analizate folosind ImageJ și scripturi MATLAB sau Python personalizate. Testele t cu două cozi nepereche au fost utilizate pentru compararea a două grupuri, iar ANOVA unidirecțional urmată de un test post-hoc al lui Tukey a fost utilizat pentru compararea mai multor grupuri. Pragul de semnificație statistică a fost stabilit la p<>

Mulțumiri

Mulțumim lui FJ Arjona și JGJ Hoenderop pentru clonele murine CNNM2 și comentariile la manuscris. Suntem recunoscători lui T Nagai pentru clonele MagIC și MARIO și Bloomington Stock Center și VDRC pentru muște. Mulțumim lui P Cognigni, Y Huang, R Brain, R Szoke-Kovacs și M Goodwin pentru sprijinul tehnic și altor membri ai grupului Waddell pentru discuții. Mulțumim lui N Halidi, C Monico și Unitatea Micron Advanced Bioimaging (susținută de Wellcome Strategic Awards 091911/B/10/Z și 107457/Z/15/Z) pentru sprijinul și asistența acordată în această activitate. EM a fost finanțat de o bursă pe termen lung EMBO (ALTF 184-2109). KDJ recunoaște sprijinul din partea Rhodes Trust. SW a fost finanțat de un Wellcome Principal Research Fellowship (200846/Z/16/Z) și de un Grant ERC Advanced (789274).