Partea Ⅰ Dezvoltarea unui test imunologic cu flux lateral de nanoparticule de europiu pentru detectarea NGAL în urină și diagnosticarea leziunii renale acute

Abstract

1. Fundal

AKI este legată de rezultate adverse severe și de mortalitate la pacienții cu boala cu coronavirus 2019 (COVID-19), așa că diagnosticarea și intervenția precoce sunt imperative. Lipocalina asociată cu gelatinaza neutrofilă (NGAL) este unul dintre cei mai promițători biomarkeri pentru detectarea leziunii renale acute (AKI), dar metodele actuale de detectare sunt inadecvate, așa că sunt necesare metode mai rapide, mai convenabile și mai precise pentru a detecta NGAL pentru diagnosticul precoce. de AKI. Aici, am stabilit un imunotest cu flux lateral (LFIA) rapid, fiabil și precis, bazat pe nanoparticule de europiu (EU-NPS) pentru detectarea NGAL în probele de urină umană.

2. Metode

S-a folosit un test imunofluorescent sandwich cu dublu anticorp folosind nanoparticule dopate cu europiu și au fost generați anticorpi monoclonali (MAb) NGAL ca etichete prin optimizarea parametrilor de fuziune electrică. Au fost utilizate optzeci și trei de probe de urină pentru a evalua eficiența aplicării clinice a acestei metode.

3. Rezultate

Intervalul cantitativ de detecție a NGAL în AKI a fost de {{0}} ng/mL, iar sensibilizarea de detecție a fost de 0,36 ng/mL. Coeficientul de variație (CV) al intra-testului și al inter-testului a fost de 2,57-4,98 la sută și, respectiv, de 4,11-7,83 la sută. Între timp, coeficientul de corelație dintre imunotestele cu fluorescență laterală pe bază de nanoparticule de europiu (EU-NPS-LFIA) și analizorul ARCHITECT a fost semnificativ (R2=0.9829, n=83, p < 0,01).

4. Concluzii

Astfel, a fost stabilită o operațiune mai rapidă și mai ușoară a testului cantitativ al NGAL pentru AKI, care este foarte important și semnificativ pentru diagnosticarea precoce a AKI, sugerând că testul poate oferi o avertizare timpurie a rezultatului bolii.

Cuvinte cheie

lipocalină asociată gelatinazei neutrofile (NGAL), anticorp monoclonal, imunotest cu flux lateral, leziune renală acută (AKI),Efectele lui Cistanche.

Click aici pentru a aflacare sunt beneficiile Cistanche

Introducere

Boala Coronavirus 2019 (COVID{-19) s-a răspândit pe scară largă la scară mondială, cu dezastre grave [1]. Leziunea renală acută (IRA) are o rată mai mare de morbiditate și mortalitate în complicațiile comune ale bolilor critice și a numărat aproximativ 5-7 procente din pacienții spitalizați din lume[2].- Mai multe studii au evaluat dezvoltarea AKI ca fiind mai mult strâns legată de rezultate mai proaste și ratele de mortalitate ale COVID-19, descriind incidența AKI care variază pe scară largă de la 0,5 la 36,6% la pacienții cu COVID{-19[3]. Detectarea precoce și tratamentele precise ale AKI pot implementa strategii preventive mai bune și pot preveni deteriorarea funcției renale și insuficiența renală, limitând eficient progresia pacienților spitalizați cu COVID-19[4]. Printre aceștia, lipocalina asociată cu gelatinaza neutrofilă (NGAL) a fost recunoscută ca fiind unul dintre candidații biomarkeri promițători pentru detectarea AKI. NGAL este o glicoproteină de 25 kDa asociată cu gelatinaza din neutrofile și există de obicei la un nivel mai scăzut în țesuturile umane, cum ar fi stomacul, colonul și rinichii, dar expresia sa este crescută dramatic în ser și urină atunci când rinichiul a fost cu leziuni ischemice sau nefrotoxice. [5].

Testele imunologice cu flux lateral (LFIA) au fost considerate teste de screening dorite datorită simplității lor, analizei in situ și ușurinței în lucru[6]. LFIA cu microparticule fluorescente a fost deja utilizată pentru detectarea diferiților agenți patogeni microbieni și a mai multor markeri de inflamație[7, 8]. Mai multe nanoparticule noi au fost aplicate în general pentru a îmbunătăți sensibilitatea LFIA, inclusiv nanoparticule de carbon, puncte cuantice, coloranți fluorescenți, nanoetichete magnetice și nanoparticule de europiu (EU-NPS)[9]. EU-NPS, în calitate de purtători, poate îmbunătăți 100-contrastul de sensibilitate cu nanoparticulele de aur coloidal marcate în LFIA[10]. EU-NPS are o durată lungă de viață a fluorescenței și este, de asemenea, disponibil cu o dimensiune medie a particulelor de 75-100 nm, deplasarea mare Stokes, care este de obicei peste 200 nm, este favorabilă pentru evitarea interferenței luminii împrăștiate cauzate de măsurarea luminii de excitație. EU-NPS au o bandă largă de excitare, astfel încât este benefică creșterea energiei de excitare, a vârfului de emisie ascuțit, a fundalului scăzut și a rezoluției înalte, utilizate recent în imunotestele de tip sandwich de diagnosticare medicală[11].

Aici, am stabilit o nouă metodă cu EU-NPS ca etichete ale LFIA pentru măsurarea rapidă, sensibilă și timpurie a NGAL în urină, pe baza a doi anticorpi monoclonali (MAb) 1G1 și 2F4, care sunt descoperiți de laboratorul nostru. Metoda este un test imunofluorescent sandwich cu anticorpi dublu folosind EU-NPS și conjugatul MAbs ca marcaje. mAb 1G1 a fost conjugat cu EU-NPS și mAb 2F4 a fost folosit pentru a captura complexul de antigen EU-NPS-1G1- în linia T. Rezultatele noastre au arătat că EU-NPS-LFIA ar putea fi utilizat pentru detectarea precoce a NGAL în urină și să permită îmbunătățirea tratamentului pacienților cu AKI.

Cistanche tubulosa

Metode

1. Exprimarea și purificarea NGAL

Secvența genei NGAL umană de la Genbank (NP{{0}}.2) a fost sintetizată de Institutul de Genomică din Beijing (BGI) și a adăugat enzimele de restricție HindIII și XhoI la ambele capete. Plasmidele au fost digerate cu HindIII şi Xhol şi apoi donate în vectorul pSecTag2A. Plasmidele construite au fost secvențiate pentru a confirma fără mutație și apoi transformate în celule de ovar de hamster chinezesc (CHO) de către LipofectamineTM2000. După 8 zile, supernatantul celular a fost colectat după filtrarea filtrului de 0,45 μm. Proteina NGAL-6xHis exprimată a fost purificată cu coloană de acid nitrilotriacetic de nichel (Ni-NTA), iar diferitele fracții au fost colectate și evaluate prin electroforeză pe gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă (SDS-PAGE). Kitul de cuantificare a proteinelor pentru acid bicinchoninic (BCA) a măsurat concentrația de proteine.

Proteina recombinată purificată a fost supusă la 12% SDS-PAGE, apoi a fost adsorbită pe o membrană de fluorură de poliviniliden (PVDF). După ce membrana a fost blocată în tampon tris cu soluție 1% Tween-20 (TBST) care conține 5% lapte degresat la temperatura camerei (RT) timp de 2 ore, incubată cu anti-6×His tag conjugat cu HRP anticorp (1:5000) la întuneric timp de 1 oră la RT, vizualizat cu benzidină după spălat cu TBST și vizualizat prin sistemul de detectare Bio-Rad Western blot (DNR Bio-Imaging Systems Ltd., Israel).

2. Generarea și purificarea MAb-urilor

La prima imunizare, șoarecii femele BALB/c (vârsta de 6 săptămâni, un total de 10) au fost imunizați cu 50 µg NGAL-6×proteina recombinantă His emulsionată în doză egală de adjuvant Freund complet și imunizate accesorii au fost realizate cu proteine ​​emulsionate în adjuvant Freund incomplet. Două injecții hipodermice pe spatele șoarecilor și injecții intraperitoneale ulterioare la distanță de 21 de zile. Probele de ser au fost colectate la o săptămână după a treia injecție, iar titrul antiserului a fost determinat cu un test imunosorbent indirect legat de enzime (ELISA)[12]. Cu trei zile înainte de fuziune, șoarecii au efectuat imunizare de rapel cu 50 ug de NGAL-6xHis diluat cu 0,9% NaCl.

Celulele imune ale splinei de șoarece izolate și celulele de mielom SP2/0 s-au amestecat într-un raport de 3:1 pentru a fuziona într-o cameră de fuziune LF498-3 cu electrod de platină (BEX Co., Ltd, Japonia), așa cum este descris în literatură[13]. Pe scurt, celula mixtă a fost spălată de două ori cu 10 mL tampon de electrofuziune (0,3 M manitol, 0,1 mM CaCl2, {0,1 mM MgCl2, pH 7.2) și resuspendate la o concentrație de 2 × 107 celule/mL. Fuziunea a fost finalizată folosind o tensiune de curent alternativ de 50 V la 0,8 MHz timp de 20 s, o tensiune de impuls de curent continuu de 450 V de 2 repetări timp de 0,5 s, iar post-fuziunea a fost de 50 V la 0,8 MHz pentru 7 s. În cele din urmă, suspensia celulară tratată electric a fost mutată din camera de fuziune în 4,5 ml de RPMI 1640 preîncălzit (20 la sută ser fetal bovin) timp de 30 de minute la 37 de grade, apoi cultivată în 96-plăci de godeuri și incubată cu 5 procente. CO2 la 37 de grade. După 24 de ore, hipoxantină-aminopterina-timidină (HAT) a fost suplimentată în fiecare godeu. Supernatanții culturii celulare au fost analizați prin ELISA după 9 zile de fuziune și numărul calculat de clone de hibridom a fost. Șoarecii BALB/c care au fost injectați cu ulei de parafină în prealabil au fost inoculați cu 1 x 106 celule de hibridom NGAL, ascita a fost purificată prin coloană cu proteină A.

3. Identificarea MAbs

Subclasele de anticorpi de imunoglobuline au fost analizate folosind trusa de identificare a subclasei de anticorpi. ELISA indirect a analizat MAb-urile specifice utilizând NGAL{{0}}×proteina His și PCT- 6×proteina lui recombinată purificată. Interacțiunea dintre antigen și anticorpi a fost determinată cu sistemul BIAcore T200 (GE Healthcare, Stockholm, Suedia) în tampon HBS-EP (0,005% surfactant P20, 10 mM Hepes, pH 7,4, 3 mM EDTA, 150). mM NaCI). Antigenul NGAL a fost adsorbit pe cipurile biosenzorului CM5 atingând 400-480 de unități de răspuns (RU) printr-un kit de cuplare cu amine. Anticorpii (2F4 și 1G1) au fost diluați în tampon HBS-EP au fost trecuți lent peste cip cu 50 µL/min, respectiv, timp de 5 minute, iar ulterior tamponul HBS-EP a fost injectat peste cip pentru a monitoriza faza de disociere timp de 4 minute. . Cipurile senzorului au fost regenerate cu soluție de glicină (pH 3,0) după faza de disociere. Pentru fiecare analit trecut peste cip, răspunsurile specifice din canalul de flux de antigen ar putea scădea răspunsuri nespecifice din canalul de flux de control. Curbele de legare de saturație ajustate au fost reprezentate grafic pe baza concentrațiilor de analit pentru răspunsurile de legare la echilibru pentru a calcula KD.

MAb-urile anti-NGAL purificate au fost analizate în 12% SDS-PAGE în condiții nereducătoare și reducătoare. Pe scurt, proba a fost amestecată cu 5 x tampon nereducător sau 5 x tampon de încărcare cu proteine ​​și încărcat pe 12% SDS-PAGE. Specificitatea MAb anti-NGAL a fost determinată prin Western Blot. Proteinele NGAL au fost făcute la 12% SDS-PAGE, apoi au fost adsorbite pe o membrană PVDF care a fost activată prin înmuiere în metanol timp de 15 s și apoi supuse condițiilor de electroforeză la 100 V timp de 2 ore. După blocarea în tampon Tris-HCl cu 1% soluție Tween-20 (TBST) care conține 5% lapte degresat la temperatura camerei timp de 2 ore, membrana a fost incubată cu MAb anti-NGAL de șoarece ca anticorpi primari la 4 grade. A doua zi, membrana a fost spălată cu TBST și incubată cu IgG HRP conjugată anti-șoarece la întuneric timp de 1,5 ore la RT. În cele din urmă, membrana a fost vizualizată de sistemul de detectare Western blot a chemiluminiscenței îmbunătățite (ECL).

4. Teste imunosorbente legate de enzime competitive (ELISA)

Două MAb au fost testate pentru capacitatea de a recunoaște epitopi unici pe NGAL prin cELISA. MAb a fost conjugat cu HRP utilizând kitul de etichetare a anticorpilor HRP (Shanghai YSRIBIO industrial co., LTD), a cărui concentrație de lucru a fost testată prin ELISA direct. {{{0}}godeuri Plăcile de microtitrare au fost acoperite cu 2 µg/mL de antigen NGAL peste noapte la 4 grade, apoi MAb nemarcat (0,2 µg/godeu, 2 µg/godeu) a fost legat competitiv cu raportul de diluție optim de MAb marcat cu HRP și incubat timp de 1 oră la 37 de grade. Reacția enzimatică a apărut cu peroxid de hidrogen prin substratul 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidină (TMB) și a fost oprită de acid sulfuric 2 M în toate godeurile. Absorbanța (OD450 nm) a fost determinată de un cititor de microplăci Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Inc). Efectele de blocare ale MAb au fost calculate utilizând următoarea ecuație: 100×[1-OD_{450 nm}de (HRP-MAb plus MAb)/OD450 nm de HRP-MAb]. Doi MAb au recunoscut epitopi diferiți dacă s-au observat efecte de blocare în mai mult de 40 la sută.

Extract de Cistanche

5. Conjugarea EU-NPS

Anticorpii monoclonali anti-NGAL 1G1 și 2F4 au fost conjugați covalent la EU-NPS cu procedura standard a Bangs Laboratories. Pe scurt, 100 µL EUNPS au fost adăugate la 900 µL 0.{05 M MES (pH 7.{{ 32}}) și dispersat prin ultrasunete, a vibrat timp de 15 min la RT în prezența {{4{0}}.08 M N-hidroxisulfosuccinimide (NHS) și 0,05 M 1-({{19 }}Clorhidrat de dimetilaminopropil)-3-etil carbodiimidă (EDC). EUNPS activat a fost spălat cu tampon de cuplare (0,05 mM H3BO3, 0,04 mM Na2B4O7, pH 7,5) şi a reacţionat cu 0,3 mg anticorp timp de 2,5 ore la RT. Compusul conjugat cu europiu a fost incubat în 1000 µL tampon de blocare (10% BSA, 20% tween-20, 0,05 M Tris-HCl) timp de 1 oră, adăugat la 1000 µL soluții stoc (10% BSA, 20% trehaloză, 20% procente tween-20, 0,05 M Tris-HCl) pentru a se păstra la 4 grade .

6. Dezvoltarea LFIA

Benzile LFIA au constat dintr-o membrană de nitroceluloză, un tampon de conjugat, un tampon de probă și un tampon absorbant. Membranele din fibră de sticlă au fost înmuiate în tampon de blocare (20 procente trehaloză, 10 procente BSA, 20 procente tween-20, 0,05 M Tris, 3,2 mM EDTA.Na2, pH 8,6) timp de 1,5 ore. Concentrația de 1 mg/mL MAb (2F4 sau 1G1) a fost acoperită pe linia de testare (TL) a membranei de nitroceluloză și IgG de capră anti-șoarece 1 mg/mL a fost acoperită pe aceeași membrană NC la o distanță de 4 mm până la formează o linie de control al calității (CL), volumul de pulverizare al instrumentului dozator a fost setat la 1 uL/cm. Membrana și covorașul din fibră de sticlă au fost uscate timp de 48 de ore la 45 de grade înainte de a fi testate. Diferitele particule de conjugat EU-NPS-1G1 și EU-NPS{-2F4 au fost acoperite pe tamponul de conjugat, iar semnalul de fluorescență a fost măsurat cu un analizor imunofluorescent (Guangzhou Labsim Biotech Co., Ltd).

7. Recoltarea probelor de urină și pacienți

Un total de 83 de probe de urină umană de la pacienții cu AKI au fost recoltate de la Spitalul Afiliat al Universității de Medicină Jilin. Îndrumările etice au fost respectate cu strictețe în experiment și au fost furnizate de Spitalul Afiliat al Universității Medicale din Jilin (nr.2018-LW029). Toți subiecții au primit consimțământul informat oral și scris în limba chineză pentru studiul probelor de urină. Toate experimentele au fost realizate prin Declarația Principiilor Etice de la Helsinki. Vârsta medie a pacienților de 62 de ani a variat între 20 și 80 de ani care nu au fost infectați cu COVID-19, iar stadiul 1-3 AKI a fost clasificat în funcție de criteriile AKI pentru îmbunătățirea rezultatelor globale ale bolii renale[14]. Probele de urină au fost colectate pentru analiza NGAL cu până la 12 ore înainte de diagnosticarea AKI și la intervale frecvente după operație la diferite momente de timp (12, 24, 48 ore). Pentru a minimiza potențialii factori de confuzie, probele de urină au fost analizate rapid la laboratorul de chimie clinică, inclusiv biochimia urinei (concentrații totale de proteine ​​< 1 g/dL, uree < 12 g/dL, glucoză < 1 g/dL, creatinina urinară < 1 g/dL , albumină < 2,5 g/dL, pH 4.5-9.0) și efectuată în duplicat. În 30 de minute de la colectarea probei, acestea au fost centrifugate la 3000 rpm la 4 grade timp de 15 minute. Un minim de 100 µL de supernatant a fost distribuit în recipiente sterile și depozitat la grade -80 pentru analize ulterioare, pentru a evita ciclurile repetate de îngheț-dezgheț.

Măsurarea nivelurilor NGAL a fost efectuată utilizând un kit de reactiv NGAL de urină ARCHITECT (Lisnamuck, Longford, Co. Longford, Irlanda) utilizând un format sandwich necompetitiv cu detectare a semnalului chemiluminiscent. NGAL urinar a fost recunoscut de un anticorp antifungic care a fost atașat covalent la particule paramagnetice în reactiv de microparticule și conjugatul unui al doilea anticorp anti-NGAL asociat cu acridiniu. Urmând instrucțiunile producătorului, testul de calibrare a fost efectuat în intervalul de 0- 1500 ng/mL și a fost măsurată concentrația de NGAL.

8. Testarea și analiza probelor clinice

Concentrațiile în serie ale antigenului standard NGAL (10, 50, 100, 200, 400, 800, 1500, 2000 și 3000 ng/mL) au fost preparate folosind FBS pentru a întări reacțiile specifice de bioconjugat, fiecare concentrație a făcut trei replici. După ce probele clinice au fost adăugate pe tampoanele de probă, rezultatele intensității fluorescenței pe linia T (HT) și pe linia C (HC) au fost înregistrate de către cititor. Detectarea cantitativă a fost completată de raportul HT/HC pentru a elimina în mod eficient diferențele de benzi (T și C) și efectele matricei standard ale probelor matematice[15]. Curba standard a fost trasată în raport cu fiecare concentrație de NGAL și raportul HT/HC.

9. Analiză statistică

Analiza de regresie Passing-Bablok și diagrama BlandAltman au fost efectuate prin analiza varianței (ANOVA) a software-ului MedCalc și SPSS 17.0. Toate datele au fost prezentate ca valori medii cu abatere standard (media ± SD).

Pastile de Cistanche

Referințe

1. Zheng X, Zhao Y, Yang L: Acute Kidney Injury in COVID-19: The Chinese Experience. Seminarii în nefrologie 2020, 40(5):430–442.

2. Mandelbaum T, Scott D, Lee J, Mark R, Malhotra A, Waikar S, Howell M, Talmor D: Rezultatul pacienților în stare critică cu leziune renală acută folosind criteriile rețelei de leziuni renale acute. Critical care medicine 2011, 39(12): 2659–2664.

3. Al-Hwiesh A, Mohammed A, Elnokeety M, Al-Hwiesh A, Al-Audah N, Esam S, Abdul-Rahman I: Tratarea cu succes a trei pacienți cu leziuni renale acute secundare COVID-19 prin dializă peritoneală : Raport de caz și revizuire a literaturii. Peritoneal dialysis international 2020, 40(5):496–498.

4. Shabaka A, Rovirosa-Bigot S, Guerrero Márquez C, Alonso Riaño M, Fernández-Juárez G: Acute kidney injury and nefrotic syndrome secondary to COVID-19-associated focal segmental glomerulosclerosis. Nefrologia 2021.

5. Gabbard W, Milbrandt E, Kellum J: NGAL: un instrument emergent pentru prezicerea severității AKI este ușor de detectat printr-un test clinic. Critical Care 2010, 14(4): 318.

6. Zuk R, Ginsberg V, Houts T, Rabbie J, Merrick H, Ullman E, Fischer M, Sizto C, Stiso S, Litman D: Imunocromatografie enzimatică – un imunotest cantitativ care nu necesită instrumentare. Clinical chemistry 1985, 31(7): 1144–1150.

7. Juntunen E, Myyryläinen T, Salminen T, Soukka T, Pettersson K: Performanța nanoparticulelor fluorescente de europiu (III) și a reporterilor de aur coloidal în testul de afinitate bio-flux lateral. Biochimie analitică 2012, 428(1):31–38.

8. Swanson C, D'Andrea A: Test cu flux lateral cu colorant în infraroșu apropiat pentru detectarea multiplex. Clinical chemistry 2013, 59(4):641–648.

9. Chen Y, Fu Q, Xie J, Wang H, Tang Y: Dezvoltarea unui test cuantic de înaltă sensibilitate pe bază de puncte fluorescente de stingere a fluxului lateral pentru detectarea zearalenonei. Analytical bioanalytical chemistry 2019, 411(10): 2169–2175.

10. Zhang F, Zou M, Chen Y, Li J, Wang Y, Qi X, Xue Q: benzi imunocromatografice marcate cu lantanide pentru detectarea rapidă a Pantoea stewartii subsp. Stewart. Biosenzori bioelectronice 2014, 51:29–35.

11. Nankoberanyi S, Mbogo G, LeClair N, Conrad M, Tumwebaze P, Tukwasibwe S, Kamya M, Tappero J, Nsobya S, Rosenthal P: Validarea testului de microsfere fluorescente de reacție de detectare a ligazei pentru detectarea mediei de rezistență la polimorfismul Plasmodium falciparum în Uganda. Malaria Journal 2014, 13:95.

12. Xu H, Dong Y, Guo J, Jiang X, Liu J, Xu S, Wang H: producția de anticorpi monoclonali și dezvoltarea unui test imunosorbant indirect competitiv legat de enzime pentru screeningul toxinei T-2 din lapte. Toxicon 2018, 156:1–6.

Moli Yin1 , Yuanwang Nie2 , Hao Liu2 , Lei Liu1 , Lu Tang1 , Yuan Dong2 , Chuanmin Hu1 și Huiyan Wang1

1 Jilin Collaborative Inovation Center for Antibody Engineering, Jilin Medical University, 132013 Jilin, PR China.

2 Academia de Laborator, Universitatea de Medicină Jilin, 132013 Jilin, PR China.