PARTEA Ⅱ: Infecția cu SARS-CoV-2 la modelul de hamster sirian provoacă inflamație, precum și dereglarea interferonului de tip I atât în ​​țesuturile respiratorii, cât și în cele non-respiratorii, inclusiv inima și rinichii

pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com

Magen Ellen Francis, Una Goncin și colab.

CLICK AICI PENTRU PARTEA Ⅰ

Abstract

COVID-19(boala coronavirus 2019) cauzată deSARS-CoV-2(sindromul respirator acut sever coronavirus 2) infecția este o boală care afectează mai multe sisteme de organe. Un model care surprinde toate simptomele clinice aleCOVID-19, precum și boala transportatorului lung, este necesară. Am investigat răspunsurile gazdei asociate cu infecția în mai multe sisteme majore de organe, inclusiv tractul respirator, inima șirinichidupăSARS-CoV-2infecție la hamsterii sirieni. Am găsit creșteri semnificative ale citokinelor inflamatorii (IL-6, IL{-1beta și TNF) și interferonii de tip II, în timp ce interferonii de tip I au fost inhibați. Examinarea țesutului extrapulmonar a indicat inflamație la nivelulrinichi, ficatul și inima cărora le lipsea, de asemenea, reglarea pozitivă a interferonului de tip I. Din punct de vedere histologic, inima avea semne de miocardită și microtrombi în timp cerinichia avut inflamație tubulară. Aceste rezultate oferă o perspectivă asupra bolii multiorganice cu care se confruntă persoanele cuCOVID-19si eventual boala prelungita la persoanele cu sechele post-acute deSARS-CoV-2(PASC). coronavirus 2) infecția poate afecta mai multe sisteme de organe, inclusiv tractul respirator, tractul urinar, sistemul neurologic și sistemul cardiovascular. Pentru a studia în mod corespunzător această boală și a evalua terapia, un model care surprinde toate simptomele clinice aleCOVID-19este necesară. Se știe că daunele care apar după infecția virală se datorează adesea răspunsurilor imune proprii ale gazdei. Prin urmare, aici am investigat modul în care răspunsurile imune ale gazdei sunt reglate în mai multe sisteme majore de organe, inclusiv tractul respirator, inima șirinichidupăSARS-CoV-2infecție la hamsterii sirieni. Am găsit creșteri semnificative ale citokinelor inflamatorii (IL-6, IL{-1beta și TNF), precum și ale citokinelor antivirale, numite interferoni de tip I. Interesant, interferonii de tip I ai răspunsului antiviral au fost inhibați în tractul respirator. Examinarea țesutului extrapulmonar a indicat inflamație la nivelulrinichi, ficatul și inima cărora le lipsea, de asemenea, reglarea pozitivă a interferonului de tip I. Din punct de vedere histologic, inima avea semne de miocardită și microtrombi în timp cerinichia avut inflamație tubulară. Aceste rezultate oferă o perspectivă asupra bolii multiorganice cu care se confruntă persoanele cuCOVID-19si eventual boala prelungita la persoanele cu sechele post-acute deSARS-CoV-2(PASC).

Click to Cistanche foloseste pentru functia renala

Infecția cu SARS-CoV-2 are ca rezultat o inflamație semnificativă sau o reglare imună a inimii, ganglionilor limfatici și a splinei, precum și semnături de eozinofile în intestinul gros

Markerii imunitari ai inflamației, imunitatea adaptivă și răspunsurile antivirale au fost, de asemenea, evaluați în țesuturile non-respiratorii, alături de histopatologia țesuturilor. Am investigat ganglionul limfatic mediastinal, inima,rinichi, splina, ficat și intestinul gros pentru reglarea țintelor imune clasificate ca mai sus în funcție de IFN de tip I, Răspuns IFN de tip II/General și Mediatori înnăscuți/Adaptivi (Fig 6), precum și pentru imunopatologie (Figurile 7 și S4). Dacă evaluarea inițială a histopatologiei a sugerat implicarea unor mecanisme imune specifice (S4 Fig), s-a efectuat scanarea de înaltă rezoluție pentru a obține o mai mare profunzime de informații (Fig 7). Ganglionii limfatici mediastinali nu au putut fi recuperați în ziua 15. Semnificațiile corespunzătoare pentru expresia genei pot fi găsite în Tabelul S2. Răspunsurile IFN de tip I și de tip II în toate organele extrapulmonare, cu excepția ficatului, au avut profiluri de reglare similare cu cele ale plămânilor și cornetelor nazale (Fig 6). Reglarea genelor a fost caracterizată prin scăderea răspunsurilor de tip I și creșteri ale răspunsurilor de tip II. STAT2 a scăzut semnificativ în ganglionul limfatic mediastinal,rinichi, splina și intestinul gros. Inima a avut scăderi semnificative și susținute ale IRF1, în timp ce intestinul gros a avut scăderi ale IFN-beta (Fig 6). În schimb, s-au observat creșteri marcate ale IFN-gamma în ganglionul limfatic mediastinal șirinichiiar într-o măsură mai mică în inimă şi splină. CXCL10, chemoatractantul celulelor T, a fost crescut la niveluri ridicate în splină, ficat și ganglionul limfatic mediastinal, unde reglarea a fost bifazică în ganglionul limfatic (Fig 6). Reglarea genelor mediatoare înnăscute/adaptative în splină și ganglioni limfatici a fost observată pentru toate țintele imune examinate, cu excepția TGF-beta, IL-5R și CCR3 care nu au fost reglementate eficient. Mai exact, reglarea semnificativă a CD3, CD4, CD8A, IL-2, IL-21, IL-10, IL-4, IL-5, IL{{13 }}, iar IL-12 a fost observată în aceste organe imune secundare. Reglarea mediatorilor imunitari înnăscuți/adaptativi a fost deosebit de interesantă în inimă, unde IL-2, IL{-10, IL{-4 și IL{-5 au fost crescute de 100 de ori față de valoarea inițială . Cea mai mare reglare a citokinelor inflamatorii a fost detectată în inimă, urmată de rinichi, ficat și ganglionul limfatic mediastinal. În inimă, IL-12 a fost crescut semnificativ devreme și, împreună cu TNF, a rămas crescut în ziua 15 pi. IL-6 și IL{-1beta au fost, de asemenea, induse tranzitoriu în țesutul cardiac în zilele 5 și 8 (Fig 6). Modificări semnificative ale inimii au fost observate prin analiza histologică (S4 Fig). Imagistica de înaltă rezoluție a găsit dovezi de microtrombi (Fig 7A, săgeți albe), precum și miocardită (Fig 7B, săgeți albe) în inimă. CD14, IL-1beta și TNF au fost suprareglate devreme în rinichi, dar au scăzut în ziua 8 până la 12 pi (fig. 6), ceea ce a coincis cu infiltrarea celulelor inflamatorii în rinichi și, posibil, cu leziuni renale acute sau cu leziuni tubulare (indicat). de săgețile albe, Fig 7C). Expresia IL-6 a fost susținută în ficat, unde IL-1beta a fost, de asemenea, crescută la momente tardive. Ganglionul limfatic mediastinal a avut o creștere bifazică a IL-12 cu creșteri tranzitorii ale IL{-6 și TNF la niveluri de ori de 12, 8 și, respectiv, 11. Intestinul gros a avut o reglare semnificativă a IL-5, IL{-5R și CCR3 cu infiltrare de eozinofile (Figura 7D), dar o reglare minimă a oricăror alți mediatori înnăscuți/adaptativi. Pentru a însoți analiza organelor extra-pulmonare, am analizat chimia sângelui animalelor de-a lungul timpului pentru a evalua disfuncția organelor (S5 Fig). Am analizat glucoza, albumina, fosfataza alcalină, alanin transferaza, azotul ureic din sânge, bilirubina totală și proteinele totale ca semn al funcției hepatice[27]. Calciul, potasiul, albumina, amilaza, azotul ureic din sânge și proteinele totale au fost analizate pentru a evalua rinichiul[27]. Sănătatea gastrointestinală a fost evaluată prin fosfatază de sodiu, potasiu și alcalină[27]. Funcția cardiacă a fost măsurată folosind sodiu, potasiu și alanin transferaza [27]. Supreglarea globulinei a fost evaluată ca un semn de stimulare antigenică[27]. Dintre cele 14 molecule investigate, doar amilaza și glucoza au fost semnificativ crescute la animalele infectate în comparație cu martori, atingând un vârf la 1700 U/L și, respectiv, 280 mg/dL, în ziua 8 pi. În plus, modificările concentrației de potasiu ([K plus ]) au fost cele mai notabile și au părut în cea mai mare parte a fi legate de timp pe perioada studiului, deoarece majoritatea indivizilor au avut o creștere [K plus ], cea mai mare modificare observată în ziua 15. Creșterea în albumină a fost de asemenea notabilă, dar uşoară la multe dintre animale. Concentrația totală de proteine ​​a crescut ușor la majoritatea subiecților, dar modificarea este relativ ușoară și probabil nesemnificativă din punct de vedere clinic. Alți markeri hepatici au atins vârful mai târziu în cursul timpului, inclusiv glucoza (280 mg/dL) în ziua 8, fosfatază alcalină (ALP) în ziua 12 (3 U/L) și azotul ureic din sânge (BUN) (22 mg/dl) în ziua 15. Alanin transferaza (ALT), deși a atins un vârf în ziua 2, a fost ridicată în ziua 12, la puțin sub 100 U/L, sugerând o posibilă afectare a ficatului. Markerii renali au atins, de asemenea, vârful mai târziu, în ziua 8 pentru amilază (1700 U/L) și în ziua 15 pentru potasiu și BUN (12 și, respectiv, 22 mg/dl). BUN, cu câteva excepții, a avut o posibilă creștere a concentrației dependentă de timp. În schimb, calciul a atins vârful în ziua 2 la 2,6 mg/dl, dar a scăzut în intervalele de referință. Markerii sănătății gastrointestinale și cardiace, cum ar fi sodiul, au arătat o reglare minimă, în timp ce [K plus ] a crescut relativ liniar pe parcursul timpului infecțios, atingând vârful în ziua 15 (12 mg/dl). ALP (marker gastrointestinal) a fost ridicat în zilele 5 și 8 la 3u/L și ALT (marker cardiac) a fost crescut la hamsterii infectați față de hamsterii neinfectați în zilele 2, 8 și 12 la 75-100 U/L, dar diferențele nu au fost semnificative. În cele din urmă, globulina a atins vârful în ziua 2 la 0,6 g/dL și a scăzut relativ liniar de-a lungul timpului. Luate împreună, analiza de sânge indică o anumită dereglare în organele extrapulmonare, precum și stimulare antigenică ca răspuns laSARS-CoV-2.

Fig. 6. Infecția cu SARS-Cov-2 la hamsteri duce la creșterea genelor inflamatorii și legate de mediatorul imun în anumite organe extrapulmonare, indicând posibil miocardită, evoluție imună adaptativă și infiltrarea eozinofilelor în intestinul gros.qRT-PCR a fost efectuat pe ARN extras din ganglionul limfatic mediastinal (M), inimă, rinichi, splină, ficat și intestinul gros dinSARS-CoV-2hamsteri inoculați. Probele au fost evaluate pentru răspunsul la interferon de tip I (IFN-beta, STAT2, IRF1, IRF3, TLR3), legat de răspunsul la interferon de tip II (IFN-gamma, IRF2, STAT1, CXCL10) și înnăscut/ mediator adaptiv (CD3, CD4, CD8, CD19, IL-2, TGF-beta, IL-21, IL-10, IL{-4, IL-5, Genele IL-5R, IL{-13, IL{-12, CD14, CCR3, PKR, CCL20, CCL22, IL{-1beta, IL-6, TNF) utilizând primeri PCR specifici pentru secvențele de hamster (Tabelul 1). Schimbarea plierii a fost calculată prin ΔΔCt față de valoarea inițială (Ziua 0) cu BACT ca genă de întreținere. N este 3 pentru toate punctele de timp.

Discuţie

IniţialSARS-CoV-2Se credea că infecția cauzează în principal boli respiratorii, dar acum este clar căCOVID-19este o boală cu mai multe fețe care afectează mai multe sisteme de organe[25,26]. Pentru a obține o mai bună înțelegere a originii bolii și a multitudinii de simptome clinice experimentate la oameni, am investigat imunopatologia în tractul respirator, precum și a organelor non-respiratorii în timpulSARS-CoV-2infecție la hamsterii sirieni. Infecția cu 105 TCID50 deSARS-CoV-2a dus la o boală clinică uşoară până la moderată. Virusul infecțios a fost conținut în principal în tractul respirator, deși ARN viral a fost prezent în toate țesuturile evaluate. Profilul răspunsului gazdei în tractul respirator a identificat inhibarea răspunsului IFN de tip I cu o creștere concomitentă a IFN-urilor de tip II, citokinelor inflamatorii, citokinelor înnăscute și adaptive. Investigarea organelor extra-pulmonare a găsit, de asemenea, un profil similar pentru semnalizarea IFN de tip I și II; cu toate acestea, a fost identificată și reglarea imună specifică țesutului. Mai exact, expresia semnificativă a mediatorilor înnăscuți și adaptativi a fost identificată în inimă și splină. Din moment ce tratamentul antiviral în timpulSARS-CoV-2infecția este eficientă doar pe o fereastră scurtă[28], severăCOVID-19este considerat a fi o consecință a unui răspuns imun dereglat[29]. Înțelegerea patogenezei imune este esențială pentru identificarea țintelor terapeutice și tratarea simptomelor acute non-respiratorii asociate cuCOVID-19inclusiv palpitații sau migrene ale inimii și afecțiuni de lungă durată în faza de recuperare, cum ar fi sechelele post-acute aleSARS-CoV-2infecție (PASC), denumită și lung-COVID[30].

Fig 7. Organele extrapulmonare selectate au patologie distinctă după infecția cu SARS-CoV-2 cu semne de microtrombi și miocardită în inimă, leziuni tubulare în rinichi și infiltrație de eozinofile în intestinul gros.Inima, rinichii și intestinul gros au fost colectate de la fiecare animal la necropsie și fixate în formol 10% înainte de încorporarea blocului de parafină. Țesuturile au fost colorate cu H&E. Țesuturile cardiace au prezentat microtrombi (săgeți albe) în mai multe zile (A), precum și miocardită în ziua 8 (săgeată albă) (B). Rinichiul a avut leziune acută/leziune tubulară (săgeți albe) (C). Intestinul gros a avut infiltrație de eozinofile (săgeți albe) (D). Țesuturile colorate au fost vizualizate și fotografiate folosind scanerul de diapozitive Aperio ScanScope XT. Imaginile prezentate sunt reprezentative pentru 3 animale per grup, per punct de timp.

Locul primar al infecției care influențează transmiterea pentruSARS-CoV-2la oameni este tractul respirator. Prin urmare, obiectivul inițial al investigației noastre a fost tractul respirator, inclusiv răspunsurile imune asociate și imunopatologia. Aici am demonstrat atât infecția căilor respiratorii superioare, cât și inferioare și boala asociată în urma infecției cu SARS-CoV-2 la hamsterii sirieni. Infecția virală în plămâni a condus la o patologie severă caracterizată prin infiltrarea celulelor inflamatorii care duce la bronhopneumonie în ziua 5 pi și hemoragie în ziua 8. Aceste constatări au fost în concordanță cu infecția SARS-CoV-2 în studiile anterioare cu hamsterii sirieni[19, 20,31,32] și modele animale mai mari, inclusiv macaci rhesus[33], precum și pneumonie severă identificată la unele persoane umaneCOVID-19pacienţi[34-36]. Consistența datelor sprijină utilizarea hamsterului pentru modelareSARS-CoV-2infecție boala respiratorie umană și imunopatologia asociată. Am observat, de asemenea, că unii hamsteri au experimentat o pierdere mai mare în greutate, care a fost corelată cu o încărcătură virală mai mare. Greutatea diferențială s-ar putea să se fi datorat instinctului natural al hamsterilor de a ascunde mâncarea în obraji, inoculării ineficiente sau că există proprietăți inerente ale gazdei care pot duce la pierderea diferențială în greutate și replicarea virală în acest stoc animal. Deoarece toate animalele au fost verificate pentru păstrarea alimentelor în gură și toate animalele au fost pozitive pentruSARS-CoV-2virus, nu credem că acest rezultat este o reflectare a erorilor de cântărire sau a inoculării slabe. Sunt necesare mai multe lucrări pentru a determina dacă există diferențe genetice în rândul hamsterilor sirieni din râul Charles. Înțelegerea purității stocului de animale va oferi informații importante pentru utilizarea acestor animale în studiile terapeutice SARS-CoV-2 și dacă este posibil să se folosească aceste cunoștințe pentru dezvoltarea unui hamster mai sever.SARS-CoV-2model. În studiul nostru, am identificat, de asemenea, suprareglarea genelor inflamatorii cheie, cum ar fi IL-6 și TNF în plămâni și cornetele nazale, confirmând modelarea imună anterioară la hamsteri[32,37]. Aceste constatări sunt importante deoarece acești markeri inflamatori s-au dovedit a fi predictori ai bolilor severe prin evaluarea sângelui la oameni[38-42]. O analiză mai aprofundată a răspunsului gazdei la SARS-CoV-2 în țesuturile respiratorii ale hamsterilor a fost efectuată folosind analiza de secvențiere a transcriptomului[43,44]. Hoagland și colegii au evaluat plămâniiSARS-CoV-2a infectat hamsteri pentru reglarea genei imune a gazdei și a constatat o suprareglare proeminentă a IL-6, TNF și IL-1beta[43] în concordanță cu rezultatele noastre PCR. Într-un alt studiu, analiza de secvențiere a celulelor unice a dezvăluit un răspuns proeminent al celulelor T, inclusiv reglarea în sus a IFN-gamma și IL-2[44], doi markeri pe care am observat că sunt, de asemenea, foarte exprimați în plămâni. În plus, analizele noastre ale plămânilor au evidențiat reglarea în creștere a markerilor celulelor T CD3, CD4 și CD8A. Este important că analiza qRT-PCR pe care am raportat-o ​​în studiul nostru este în acord cu aceste alte studii, validând astfel utilizarea qRT-PCR ca metodă de evaluare rapidă a eficacității vaccinurilor și a terapiei evaluate la hamsterul SARS-CoV{{ 13}} model. Fișierele noastre qRT-PCR oferă biomarkeri țintiți care pot fi utilizați cu ușurință. Studiul și interpretarea noastră au fost limitate doar de prezența analizei patogenezei. Studiile viitoare ar trebui să utilizeze panoul nostru de ținte imune pentru utilizare în studii de vaccin și terapeutice.

Răspunsul antiviral este esențial pentru controlul inițial al unui virus prin distrugerea activă a replicării virale și stimularea imună pentru a limita răspândirea la alte celule. După identificarea prezenței unui virus sau a antigenelor virale, inducerea interferonilor este esențială pentru stabilirea unei stări antimicrobiene în interiorul celulelor în care echilibrul dintre interferoni și alte citokine înnăscute este esențial pentru o acțiune eficientă[45]. Recent, inhibarea interferonilor de tip I (IFN-alfa și IFN-beta) a fost asociată cu boală severă laCOVID-19sugerând că virusul este capabil să blocheze imunitatea antivirală, ceea ce duce la o patogeneză crescută [14,46,47]. În studiul nostru, am descoperit că hamsterii infectați cuSARS-CoV-2au un răspuns prototip IFN de tip II. Spre deosebire de acesta, răspunsul de tip IIFN este reglat în jos, așa cum este demonstrat de scăderea expresiei genei IFN-beta și creșterea expresiei genei IRF2, un antagonist de tip I. Numeroase studii au demonstrat că răspunsurile IFN de tip I sunt afectate în urma infecției cu SARS-CoV-2 in vitro[14,48-51]. Dereglarea IFN pe care o raportăm aici nu a fost încă analizată în țesutul respirator al oamenilor cu graveCOVID-19, dar analizele imune sistemice ale sângelui au indicat rezultate similare[14,46,47,52]. Deși mecanismele care inhibă răspunsurile interferonului de tip I nu au fost pe deplin elucidate, factorii virali și gazdă au fost implicați în această dereglare[53,54].

Dereglarea răspunsului la interferon este o strategie folosită de viruși pentru a sustrage imunitatea gazdei. Investigațiile anterioare ale răspunsului gazdei la infecția cu SARS-CoV (sindromul respirator acut sever coronavirus 1) și MERS-CoV (coronavirusul sindromului respirator din Orientul Mijlociu) sugerează că mai multe coronavirusuri folosesc această strategie[55-59]. Studiul din 2020 al lui Xia și colab. a determinat că această dereglare utilizată de coronavirusurile extrem de patogeni se extinde laSARS-CoV-2demonstrând că toate aceste trei beta-coronavirusuri reduc calea interferonului de tip I. În mod specific, NSP1, NSP6 și NSP13[50] interferează cu traducerea IFN-beta, fie prin blocarea ribozomului gazdă în cazul NSP1[60], fie prin țintirea proteinelor din amonte necesare pentru inducerea IFN-beta în cazul NSP13[61]. AlteSARS-CoV-2proteinele virale au fost, de asemenea, implicate în reglarea scăderii interferonului[62]. ORF3b și ORF9b vizează ambele în mod specific un complex proteic de semnalizare antiviral mitocondrial pentru a inhiba semnalizarea IFN de tip I [63,64]. Factorii gazdă care afecteazăSARS-CoV-2rezultatele infecției includ vârsta și sexul; în plus, comorbiditățile au fost, de asemenea, implicate în dereglarea interferonului[65]. Un studiu din 2020 de Trouillet-Assent et al.examinedCOVID-19rezultatele pacientului într-o cohortă care include indivizi care exprimă sistemic IFN de tip I și indivizi care au avut niveluri semnificativ mai scăzute atât de IFN-alfa, cât și de beta. Ei au descoperit că pacienții fără expresie de interferon de tip I au fost mai în vârstă și mai probabil să fie bărbați, comparativ cu cei care au exprimat IFN de tip I[66. Într-un studiu similar, au fost identificate niveluri sistemice semnificativ mai mari de IFN-alfa2 la femele în comparație cu niveluri la bărbați|67]. În studiul nostru recent, am descoperit că dihorii masculi adulți în vârstă au avut un răspuns întârziat cu interferon de tip I în comparație cu femelele adulte, masculii lipsind inducerea genelor antivirale esențiale, inclusiv OASL, MIX1 și IDG15, care a coincis cu creșterea poverii virale[68] .În studiul nostru prezent folosind modelul de hamster, toate animalele noastre au fost masculi, ceea ce sugerează că este necesară investigarea prejudecăților sexuale pentru a obține o înțelegere completă a dereglării interferonului de tip I observat. În acest moment, nu se știe de ce sau cum influențează factorii gazdă răspunsurile la interferonSARS-CoV-2. Un studiu realizat de Bastard et al. a identificat prezența autoanticorpilor împotriva interferonilor de tip I la bărbați cu severăCOVID-19[69]. Aceasta oferă o posibilă explicație a mecanismelor imune implicate în scăderea răspunsurilor la interferon de tip I la un subgrup de pacienți umani. Mecanismul pentru răspunsurile reduse la interferon din studiul nostru de față, în care toți hamsterii erau animale masculi adulți, așteaptă investigații suplimentare. Mai mult, luați împreună, profilul imunitar pe care l-am identificat împreună cu patologia tractului respirator sugerează că hamsterii sunt un model ideal pentru a explora aceste mecanisme și a testa terapii precum interferonii de tip I[48,49,70] sau interferonul lambda [Z1, Z2], ambele au demonstrat eficacitate în tratareCOVID-19pacienți [Z3-75], dar sunt necesare mai multe cercetări.

COVID-19este o boală care implică patogeneza atât a organelor respiratorii, cât și a celor non-respiratorii[25,26, totuși se înțelege puțin despre răspunsul gazdei în afara tractului respirator. În studiul nostru, am identificat ARNv în mai multe țesuturi din afara tractului respirator, inclusiv ganglionul limfatic mediastinal, inima, rinichiul, ficatul, splina și intestinul gros. Prezența ARN viral poate fi un indicator al replicării virusului viu și al infecției tisulare, dar poate fi prezentă și fără un virus viu. Nu am găsit virus viu semnificativ în afara tractului respirator, ceea ce sugerează că are loc o infecție minimă a organelor extrapulmonare. Cu toate acestea, prezența ARN viral poate fi semnificativă pentru boala clinică și mecanismele asociate. Prezența ARN viral ar putea fi rezultatul unui virus în sânge care este transportat sistemic sau al antigenului viral care a fost transportat de celulele prezentatoare de antigen către țesuturi importante din punct de vedere imunologic, cum ar fi splina și ganglionul limfatic mediastinal. Prezența ARN viral poate juca un rol în răspunsurile imune și patogeneza asociată în aceste țesuturi. Prin urmare, am continuat să investigăm răspunsurile gazdei legate de imunitate în țesuturile care au fost pozitive pentru ARN viral. Deși am găsit o reglare ascendentă a genelor inflamatorii și a interferonului de tip II în toate țesuturile non-pulmonare, cel mai izbitor răspuns a fost creșterea citokinelor imunomodulatoare din inimă. În interiorul inimii, analiza noastră a identificat creșterea citokinelor, inclusiv IL-10, IL-2, IL-4, IL{-5, IL-5R, IL{ {12}}, CD14 și CCR3 în care unele transcrieri de ARNm de citokine au fost crescute de 100-ori. Deși citokine selectate aici pot fi produse de diferite subseturi de celule T, absența TGF-beta sugerează că prezența celulelor T-reglatoare este mai puțin probabilă. În plus, absența IL-13 scade probabilitatea unui răspuns TH2. În afară de limfocitele T, creșterea expresiei genelor IL-10, TNF și IL-6 ar putea fi atribuită monocitelor sau macrofagelor[76]. Acest lucru este susținut în continuare de creșterea CD14[76]. Expresia IL-5, IL{-5R, IL-4 și CCR3 sugerează, de asemenea, prezența eozinofilelor[77]. Un număr mare de studii clinice au detectat acum implicarea cardiacă înCOVID-19[78-84]. De fapt, se estimează că aproximativ 30 la sută dintre persoanele care și-au revenitCOVID-19au un anumit tip de leziune cardiacă85]. Un studiu german de 100COVID-19pacienții au descoperit că inflamația miocardică era frecventă chiar și la câteva luni după recuperarea de laSARS-CoV-2infectie[84]. În cadrul cohortei testate, 78% dintre pacienți au prezentat simptome legate de inimă, indiferent de gradul lor deCOVID-19severitate[84]. Monocitele se numără printre tipurile de celule cunoscute că se infiltrează în inima în inflamația miocardică, producând IL-10, IL-1beta, IL-6 și TNF [86], precum și IL-12[87,88], toate acestea fiind suprareglate în inimă post-SARS-CoV-2inoculare în studiul nostru de față. În plus, un alt subset de probleme cardiace legate deCOVID-19a fost atribuită eozinofilelor care au ca rezultat miocardită eozinofilă[89]. Se știe că alți virusuri cauzează miocardită eozinofilă după infecție[90-93]. Această patologie rezultă de obicei din cauza virusului care infectează țesuturile inimii, de exemplu, cu infecția cu Coxsackievirus B3[94]. Miocardita eozinofilă a fost diagnosticată înCOVID-19pacienți, după care autopsia țesutului cardiac a prezentat infiltrație de celule inflamatorii, inclusiv limfocite, macrofage și, în mod proeminent, eozinofile[89]. În acest caz, creșterea eozinofilelor și a inflamației generale în inimă a fost găsită în ciuda lipsei virusului viu în inimă la momentul morții[95]. Am găsit dovezi în studiul nostru privind miocardita eozinofilă în histopatologie și, de asemenea, semnătura citokinelor găsite în inimă. În studiul nostru, este posibil ca eozinofilele să conducă la cardiomiopatie mediată inflamatorie prin reglarea în sus a IL-4, care a fost crescută în ceea ce privește expresia genelor în inimile hamsterilor în ziua 8 după inocularea SARS-CoV-2. O creștere a potasiului și creșteri ușoare ale alaninei transferazei în plasma hamsterilor infectați ar putea, de asemenea, să fi susținut dereglarea cardiacă. Având în vedere acest lucru, mecanismele care reglementează leziunile cardiace legate de COVID-19 nu sunt încă cunoscute. Având în vedere prevalența implicării cardiace înCOVID-19pacienților, este nevoie de mai multe cercetări pentru a înțelege mecanismele bolii. Aici am furnizat dovezi că hamsterii pot fi utili pentru înțelegerea mecanismelor definitorii ale leziunilor cardiace în timpulSARS-CoV-2infectie si evaluarea terapeutica pentru aceasta patologie.

Din punct de vedere imunologic, analizele noastre la nivelul splinei și ganglionilor limfatici mediastinali sugerează inducerea imunității adaptative. Ganglionul limfatic mediastinal a identificat o reglare bifazică notabilă în genele legate de celulele T, cu o reglare în sus a expresiei genelor CD3, CD4, IL{3}, IL{4}, I{5}, IL{ {6}}, IL-5 și IL-13 în zilele 2 și 15. Acest profil sugerează prezentarea precoce a antigenului în ganglionul limfatic de drenare la scurt timp după infecția pulmonară cu celulele dendritice, care ar fi susținută pe zi. 2 suprareglarea producției de IL-12 în ganglionul limfatic [96,97]. Migrarea celulelor dendritice care duce la activarea celulelor T culminează în cele din urmă cu IL-2 care stimulează creșterea și proliferarea celulelor T[98]. Nivelurile de globuline din sânge în ziua a 2-a după infecție la hamsterii infectați susțin, de asemenea, stimularea antigenică timpurie. Reglarea în sus a IL-4, IL{-5 și IL{-13 sugerează un răspuns distorsionat TH2[99]. Studiile timpurii au demonstrat că este asimptomatică sau uşoarăCOVID-19cazurile cu o înclinare imunitară către un TH2 sistemic caracterizat prin creșteri ale IL-4 și IL-10[100].IL-10, o citokină de reglementare, a fost, de asemenea, suprareglată în ziua 2 în studiul nostru. Datele noastre sugerează că celulele T activate sunt recrutate în țesuturile cu o infecție virală vie, cum ar fi turbinatele nazale, unde am observat o creștere a genelor legate de celulele T în ziua 5 după inoculare. Reglarea secundară a genelor în ganglionul limfatic în ziua 15 sugerează, de asemenea, o expansiune a subgrupurilor de celule T. În absența unui virus infecțios în acest moment, aceasta ar putea fi o creștere a subseturi de celule T care contribuie direct la dezvoltarea unui răspuns de memorie. Deoarece celulele T cu memorie centrală produc și IL-2[101], datele noastre care arată o creștere a IL-2 în ziua 15 după inoculare pot indica memoria celulelor T. IL-21 a fost cea mai reglată genă legată de celulele T în ziua 15. IL-21 este produsă în principal de celulele T-foliculare helper, un subset care ajută celulele B din centrul germinativ[102], în special deformarea B. celulele spre maturarea afinității și dezvoltarea memoriei. Markerul celulei B CD19 a fost, de asemenea, crescut în ganglionul limfatic, expresia genei de vârf a avut loc în ziua 15. Un studiu din 2021 de Lakshmanappa și colab. evaluatSARS-CoV-2infecția la macaci rhesus, dezvăluind un răspuns robust al celulelor T în ganglionul limfatic mediastinal cu creșteri specifice ale CD4, precum și markerii celulelor T helper foliculare CD28 și CXCR5[103]. Este posibil ca expresia crescută a genei celulelor T observată în studiul nostru să indice și un răspuns al centrului germinal. Un răspuns sistemic crescut al celulelor T a fost observat și la pacienții cu SARS-CoV-2 care își revin și dezvoltă memoria pe termen lung [97,104]. O analiză mai profundă cu markeri măriți ai reacțiilor centrului germinal pentru evaluarea ganglionilor limfatici ar fi benefică pentru studiile de vaccin.

Activitatea crescută a ganglionilor limfatici ar putea indica, de asemenea, patogeneza. Ganglionul limfatic a fost singurul organ non-respirator unde a fost detectat virusul viu. Infecția virală vie a ganglionului limfatic, precum și a splinei, a fost observată la oameni care au cedatSARS-CoV-2[105].Într-un studiu realizat de Kaneko și colab., mostre de ganglioni limfatici umani și spline de la persoane decedateCOVID-19pacienților le lipseau celulele BCL6 plus B, precum și centrele germinale întregi în general. Autorii au emis ipoteza că aceasta a fost cauza unui răspuns umoral slab laSARS-CoV-2[106]. Deoarece am identificat un răspuns robust de anticorpi neutralizanți care a fost detectat în ziua 8 post-infecție, care a coincis cu o scădere a excreției virale, este mai probabil ca virusul viu găsit în ganglionii limfatici din studiul nostru să fi indicat răspunsurile funcționale ale celulelor B și reactii ale centrului germinal.

Splina a prezentat, de asemenea, răspunsuri imune proeminente, caracterizate prin creșteri ale expresiei genelor în mod liniar din ziua 8 până în ziua 15. Această suprareglare tardivă se corelează cu implicarea tipică a splinei cu răspunsul imun la agenții patogeni care ar apărea după activarea în nodurile de drenaj locale[107]. Splina, un organ limfoid, activează și celulele T și B ca răspuns la antigenul viral. Expresia genică ridicată a CD3, CD4, IL-2 și I-21 sugerează celulele T-foliculare ca precum și activitatea celulelor B dependentă de centrul germinal, așa cum am văzut în ganglionul limfatic[108]. În plus, răspunsul în splină poate fi o consecință a viremiei, în care celulele dendritice plasmacitoide (pDC) sunt implicate în recunoașterea antigenului viral prin TLR7 și TLR9 pentru activarea celulelor T CD8 plus și a celulelor Natural Killer T(NKT). Ambele tipuri de celule funcționează în curățarea celulelor infectate viral după activarea în splină de către IFN-beta și IL-12 [109], care au fost crescute în modelul nostru, împreună cu CD8.IL-12 , IL-10 și CD14 au fost suprareglate în splina hamsterilor infectați, indicând potențial activitatea fagocitară a macrofagelor[110,111]. De asemenea, celulele limfoide înnăscute (ILC) din splina susțin repararea țesutului ca răspuns la leziuni și produc IL-5 și IL-13[112]. Luate împreună, acest răspuns ulterior în spline indică funcția de reciclare a splinei, precum și o potențială activare a limfocitelor pentru răspunsurile de memorie pe termen lung.

Intestinul gros a prezentat o reglare minimă a citokinelor evaluate, cu excepția notabilă a I-5, IL{-5R și CCR3. Exprimarea tuturor acestor trei gene a crescut semnificativ în zilele 2 până la 15, cu o schimbare a pliului de vârf de 74 pentru IL-5, comparativ cu valoarea inițială în ziua 8. IL-5 este secretată predominant de tipul 2 T -celule helper și eozinofile[113]. Având în vedere nivelurile mai scăzute de expresie a genelor ale altor gene înrudite cu Th2, cum ar fi IL-4 și IL{{-13, și creșterea markerilor de eozinofili cunoscuți IL{-5R și CCR3, este probabil IL{{ {18}} este produsă în principal de eozinofile, care pot fi observate în analiza noastră histologică a intestinului gros. Eozinofilele joacă un rol direct în apărarea antivirală, așa cum este demonstrat de RNazele din granulele lor și au fost asociate cu eliminarea altor virusuri respiratorii[114,115]. Un număr mare de eozinofile se găsesc și în tractul gastrointestinal[116]. În studiul nostru, intestinul gros al hamsterilor infectați nu a prezentat viruși vii. Intestinul gros a fost, însă, pozitiv pentruSARS-CoV-2ARN viral în zilele 2 și 5 după inoculare, o constatare în concordanță cu Sia și colab., care au observat și ARNv în colon în absența unui răspuns inflamator[20]. Până la 20 la sută dinCOVID-19pacienții raportează simptome gastrointestinale, cum ar fi diareea[39,117], virușii fiind vărsați în fecale[118]. Acest lucru ar putea fi explicat prin scăderea eozinofilelor care au fost raportate în cazurile severeCOVID-19[119-121]. Creșterea expresiei genei IL-5 de către eozinofile ar putea contribui la starea antivirală a intestinului gros, prevenind astfel infecția. Sunt necesare investigații suplimentare pentru a confirma tipul exact de celulă care duce la acest răspuns IL-5 crescut.

În studiul nostru am investigat, de asemenea, chimia sângeluiSARS-CoV-2hamsteri sirieni infectați. Am determinat un interval de referință folosind hamsteri neinfectați din sursa noastră animală și am comparat citirile cu intervalele de referință publicate pentru hamsteri, în special hamsteri sirieni[122]. Unii factori preanalitici care pot afecta chimia sângelui animalelor noastre înainte de infecție care trebuie luați în considerare pentru analiză includ nivelul de stres pe care îl pot suferi animalele, precum și anestezicul cu izofluran utilizat atunci când se extrage sânge, care poate modifica chimia sângelui. S-a demonstrat că nivelurile de glucoză, ALT, ALP și fosfor anorganic au fost semnificativ mai mari la șobolani sub izofluran și alte anestezice care nu sunt indicate aici[123]. În studiul nostru asupra hamsterilor infectați cu SARS-CoV-2, unul dintre Cele mai notabile modificări după infecție au inclus concentrațiile de potasiu care au crescut în timp. Potasiul, care este o bază, acționează ca un tampon pentru a schimba cu hidrogen(H')(acid) atunci când un pacient este într-o stare acidă. Deoarece acidoza sângelui poate fi cauzată de modificări ale funcției respiratorii, nu este surprinzător faptul că hamsterii care au prezentat semne de pneumonie/detresă respiratorie (sugerând o creștere a dioxidului de carbon (CO2) fiind reținut (sau expulzat mai puțin) și mai puțin oxigen ( O2) luat din cauza scăderii funcției alveolare) ar intra într-o stare acidă care duce la creșterea potasiului în sânge. În ceea ce privește nivelurile mai scăzute de albumină în comparație cu intervalul nostru de referință, ar fi fost de așteptat ca albumina să crească ca răspuns la expresia citokinelor inflamatorii. Este posibil ca nivelurile mai scăzute de albumină să se fi datorat utilizării izofluranului, care a fost demonstrat anterior[122-124]. În ceea ce privește glucoza de-a lungul timpului, majoritatea animalelor infectate au avut o creștere a concentrației de glucoză sugerând stres indus de cortizol, excitare indusă de epinefrină sau dereglare în producția de insulină sau interacțiunea secreție/receptor. În rezumat, cea mai interesantă constatare a acestei analize a fost sugestia nivelurilor scăzute de oxigen asociate cu nivelurile crescute de potasiu. Aceste rezultate sugerează că monitorizarea potasiului poate fi utilizată pentru a identifica pneumonia în timpul perioadei de viață aCOVID-19studii pe animale. În continuare, această activitate poate fi folosită și pentru a construi valori de referință pentru modelul de infecție cu SARS-CoV-2 hamsterului sirian și poate fi utilizată pentru screening-ul în viață al medicamentelor.

Studiul nostru oferă perspective importante asupraSARS-CoV-2infectie siCOVID-19reglarea bolii. Modelele preclinice sunt piatra de temelie a cercetării biomedicale, oferind capacitatea de a izola experimental mecanismele bolii și, de asemenea, de a evalua potențialele contramăsuri medicale, inclusiv medicamentele imunomodulatoare, antiviralele și vaccinurile. La fel deSARS-CoV-2A apărut pentru prima dată, am avut o înțelegere limitată a mecanismelor patogenezei, nicio terapie sau profilactică identificată și nici un model preclinic pe care să îl folosim pentru descoperirea contramăsurilor medicale. Din momentul apariției virale, s-au făcut salturi uriașe în special în dezvoltarea modelelor preclinice, dar înțelegerea noastră aCOVID-19iar numeroasele sale manifestări sunt încă limitate. Studiul nostru a confirmat tropismul viral și patologia respiratorie identificată anterior la noiSARS-COV-2studiile hamsterilor, dar a reușit să ne extindă înțelegerea reglării imune și a patogenezei în tractul respirator și nu numai.

Referințe

1. Zhuang Pinghui JW. Pneumonia Wuhan: cum s-a desfășurat căutarea sursei bolii misterioase South China Morning Post 2020. Disponibil de la: https://www.scmp.com/news/china/society/article/ 3046233/Wuhan-pneumonia-how-search -sursa-mister-boala-desfasurata.

2. Cucinotta D, Vanelli M. OMS DeclaraCOVID-19o pandemie. Acta Biomed. 2020; 91(1):157–60. Epub 2020/03/20. https://doi.org/10.23750/abm.v91i1.9397 PMID: 32191675.

3. Petrosillo N, Viceconte G, Ergonul O, Ippolito G, Petersen E.COVID-19, SARS și MERS: sunt strâns legate? Clin Microbiol Infect. 2020; 26(6):729–34. Epub 2020/04/03. https://doi.org/10.1016/j. cmi.2020.03.026 PMID: 32234451; PubMed Central PMCID: PMC7176926.

4. Medicină JHU. Centrul de resurse Coronavirus 2021. Disponibil la: https://coronavirus.jhu.edu/.

5. Marshall M. Mizeria durabilă a transportatorilor lungi cu coronavirus. Natură. 2020; 585(7825):339–41. Epub 2020/09/16. https://doi.org/10.1038/d41586-020-02598-6 PMID: 32929257.

6. Gupta A, Madhavan MV, Sehgal K, Nair N, Mahajan S, Sehrawat TS și colab. Manifestări extrapulmonare aleCOVID-19. Nat Med. 2020; 26(7):1017–32. Epub 2020/07/12. https://doi.org/10.1038/s41591- 020-0968-3 PMID: 32651579.

7. Nikolich-Zugich J, Knox KS, Rios CT, Natt B, Bhattacharya D, Fain MJ.SARS-CoV-2șiCOVID-19la adulții în vârstă: la ce ne putem aștepta în ceea ce privește patogeneza, răspunsurile imune și rezultatele. Geroștiință. 2020; 42(2):505–14. Epub 2020/04/11. https://doi.org/10.1007/s11357-020-00186-0 PMID: 32274617; PubMed Central PMCID: PMC7145538.

8. CARE. Informații pentru furnizorii de asistență medicală pediatrică 2021. Disponibil la: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/pediatric-hcp.html.

9. Fu Y, Cheng Y, Wu Y. ÎnțelegereaSARS-CoV-2-Răspunsuri inflamatorii mediate: de la mecanisme la instrumente terapeutice potențiale. Virol Sin. 2020; 35(3):266–71. Epub 2020/03/04. https://doi.org/ 10.1007/s12250-020-00207-4 PMID: 32125642; PubMed Central PMCID: PMC7090474.

Notă:cele de mai sus nu sunt o listă completă de referință