Partea 1: Cistanozidul de Cistanche Herba ameliorează daunele reproductive masculine induse de hipoxie prin suprimarea stresului oxidativ

Mai multe informații contact: Tinatina.xiang@wecistanche.com

Fengqi Yan1*, Xiaoliang Dou1*, Guangfeng Zhu1*, Mingyuan Xia1, Yahui Liu3, Xiaozi Liu3, Guojun Wu2, He Wang1, Bo Zhang1, Qiuju Shao4, Yong Wang1

1Departamentul de Urologie, Spitalul Tang Du, Universitatea de Medicină Militară a Patra, Xi'an 710038, Shaanxi, China;

2 Spitalul de Urologie și Nefrologie, Spitalul Popular Xi'an, Xian 710100, Shaanxi, China;

3Institutul de Științe Medicale de Bază, Universitatea de Medicină Militară a Patra, Xi'an 710032, Shaanxi, China;

4Departamentul de Radioterapie, Spitalul Tang Du, Universitatea de Medicină Militară a Patra, Xi'an 710038, Shaanxi, China. *Cotizatori egali. Primit 1 septembrie 2020;

Acceptat 18 ianuarie 2021; Epub 15 mai 2021; Publicat 30 mai 2021

Abstract: Creșterea dovezilor arată că hipoxia este o cauză ainfertilitate masculină, iar hipoxia poate fi legată destresul oxidativ(OS). Cistanozida (Cis) este un compus glicozidic feniletanoid care poate fi extras dinCistanches Herbași posedă diverse funcții biologice. Acest studiu și-a propus să investigheze efectele protectoare ale Cis asupra daunelor de reproducere induse prin hipoxie și să exploreze mecanismele specifice subiacente. Au fost construite modele experimentale de hipoxie celulară și animală, iar efectele protectoare ale diferitelor subtipuri de Cis asupra sistemului reproducător masculin au fost evaluate atât in vitro, cât și in vivo. Rezultatele au indicat că hipoxia a redus semnificativ viabilitatea celulelor GC-1 prin oprirea ciclului celular și activarea apoptozei, care au fost asociate cu creșterea OS. Mai mult, Cis a arătat efecte antioxidante puternice atât in vitro, cât și in vivo, restabilind în mod semnificativ activitățile enzimelor antioxidante și reducând nivelurile speciilor reactive de oxigen (ROS), crescând în același timp viabilitatea celulară și scăzând apoptoza. Important, subtipurile Cis (Cis-A. Cis-B, Cis-C și Cis-H) studiate aici au arătat toate anumite efecte antioxidante, dintre care efectele Cis-B au fost cele mai semnificative. Acest studiu demonstrează că Cis atenuează semnificativ efectele nocive ale OS indus de hipoxie prin afectarea activităților enzimelor antioxidante în testicule și celulele GC-1.

Cuvinte cheie: Cistanozidă, hipoxie hipobară, infertilitate masculină, stres oxidativ, protecție a reproducerii

Introducere

În prezent, aproximativ 48,5 milioane (15 la sută) de cupluri de vârstă reproductivă din întreaga lume sunt afectate de infertilitate [1], printre care 40-50 procente din cazuri sunt atribuiteinfertilitate masculină[2], o afecțiune care este puternic asociată cu factorii de mediu și stilul de viață. Dovezile sugerează că susceptibilitatea testiculului de mamifer la presiunea scăzută a oxigenului este un factor cauzator al unor forme deinfertilitate masculină[3]. După cum sa demonstrat în studiile anterioare, spermatogeneza este afectată și redusă la expunerea lahipoxie hipobară [4-7].

Pentru a explora mecanismul de bază, studiile au arătat că expunerea lahipoxie hipobarăcrește speciile reactive de oxigen (ROS) pro-

ducție [8, 9].ROS joacă un rol important în sistemul reproducător masculin. La niveluri scăzute, ele sunt necesare pentru capacitatea spermatozoizilor, reacția acro-somică și fuziunea spermatozoizilor-0ocitelor [10]. Cu toate acestea, ROS excesiv poate induce leziuni ale ADN-ului nuclear/mitocondrial al spermatozoizilor și ale membranei plasmaticeleziuni peroxidative, care la rândul lor sunt factori etiologici majori pentru riscul crescut de infertilitate masculină [11,12]. Astfel, acumularea de ROS indusă de hipoxie ar putea fi una dintre cauzele infertilității masculine.

Cistanches Herba, o plantă medicinală parazită perenă, este larg răspândită în zonele aride [13]și utilizată pe scară largă datorită activităților sale farmacologice [14-17]. Dintre toate con-inuturile eficiente aleCistanches Herba, PhG-urile au fost considerate ca fiind principala componentă activă. Până în prezent, 34 de PhG au fost izolate din plantele Cistanches [13]. Cistanoside (Cis), un PhG activ izolat din Cistanches Herba, a primit atenție pentru efectele sale antioxidante.

Având în vedere efectele antioxidante ale Cis și rolul ROS în hipoxie indusăinfertilitate masculină, Cis este considerat un potențial candidat medicament pentru tratamentul hipoxiei induseinfertilitate masculină. Cu toate acestea, puține rapoarte au abordat efectele antioxidante ale Cis extras din Cistanches Herba în tratamentul hipoxiei induse.infertilitate masculinăsau căile de semnalizare implicate. În acest studiu, au fost construite modele experimentale de hipoxie in vitro și in vivo și au fost evaluate componentele efectelor diferitelor Cis.

Materiale și metode

Cultură celulară și reactiv

Linia celulară de spermatogonie de șoarece GC-1spg (GC{-1) a fost achiziționată de la American Type Culture Collection (ATCC) și cultivată în DMEM (Invitrogen, SUA) suplimentată cu 10% ser fetal bovin, 1% S-a achiziționat L-glutamina (100 mM), penicilină (100 U/mL) și streptomicina (100 ug/ml) la 37 de grade într-un incubator umidificat cu 5% CO, Cis (Cis-A, B, C, H). de la Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (China).

Test de viabilitate celulară

Viabilitatea celulară a fost testată prin testul kitului de numărare a celulelor{{0}} (CCK-8). Pe scurt, celulele GC-1 au fost însămânțate în 96-plăci de godeuri la 1,5×103 per godeu și cultivate la 37 de grade timp de 24 de ore. Apoi, celulele au fost tratate cu diferite concentrații (20 la sută, 15 la sută, 10 la sută, 5 la sută) de oxigen sau diferite concentrații (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) de Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-). C, Cis-H) pentru timpul necesar. Apoi, supernatantul a fost aruncat și viabilitatea celulelor a fost detectată folosind un kit CCK-8 (Dojindo Japonia). Absorbanța fiecărui godeu a fost măsurată la 450 nm folosind un cititor de microplăci (BioRad USA). În cele din urmă, viabilitățile celulelor au fost calculate conform următoarei formule: Viabilitate celulară=(grup ODexperimental - grup ODblank)/ (grup ODcontrol - grup ODblank) × 100 la sută. Analiza Western blot Celulele sau țesuturile recoltate au fost omogenizate în tampon RIPA pentru a extrage proteine ​​(RIPA Beyotime China; Cocktail Roche Switzerland). Au fost colectați supernatanți, iar concentrația de proteine ​​a fost testată prin metoda BCA (Beyotime). Aproximativ 40 ug din proteinele extrase din fiecare probă au fost separate prin SDS-PAGE și electrotransferate pe membrană de filtru de nitroceluloză (NC) (Beyotime China). Membranele filtrului NC au fost blocate cu lapte degresat 5% timp de 1,5 ore și incubate cu anticorpi specifici (anti-PARP 1:1000, anti-Caspaze-3 1:1000, anti-Bcl{-2 1:1000, anti- Bax 1:1000, anti-GAPDH 1:1000; toți anticorpii au fost achiziționați de la Cell Signaling Technology, SUA) peste noapte la 4 grade. Apoi, toate membranele NC au fost incubate cu anticorpul secundar conjugat cu peroxidază de hrean timp de 1,5 ore la temperatura camerei și au fost fotografiate cu un sistem de imagistică (Tannon, China).

Detectarea ciclului celular

A fost efectuat un test de citometrie în flux (FCM) pentru a analiza ciclul celular. Celulele au fost tratate în diferite condiții timp de 72 de ore și recoltate. Celulele au fost apoi spălate cu PBS, fixate în etanol 75% și colorate cu iodură de propidiu (PI). Pentru fiecare probă, 1 x 104 celule au fost colectate și analizate prin citometrie în flux (FACS Calibur, BD Biosciences). Apoi, s-a calculat proporția de celule de fază G1/S/G2 și indicele de proliferare [Fază (S plus G2)/Fază (G1 plus S plus G2) × 100 la sută].

Colorare Ki-67

Celulele au fost cultivate într-un vas confocal și tratate cu hipoxie sau diferite subtipuri de Cis timp de 72 de ore. După fixarea tuturor celulelor cu 4% paraformaldehidă, acestea au fost incubate cu anticorpul anti-Ki-67 (1:200, Tehnologia de semnalizare celulară). Apoi, toate celulele au fost incubate cu un anticorp IgG anti-iepure conjugat CY-3-corespunzător (1:200, Boster, China) și soluție DAPI (1,0 ug/mL, Beyotime). Fluorescența a fost observată cu un microscop confocal Fluoview FV1000 (Olympus, Japonia).

Detectarea ROS

FCM a fost introdus pentru a măsura nivelurile intracelulare de ROS folosind DCFH-DA. Celulele suspendate au fost însămânțate în 6-plăci de godeuri și supuse diferitelor tratamente. După 72 de ore de tratament, celulele au fost suspendate în DMEM fără ser cu 10 μM DCFH-DA (Beyotime). Conținutul de ROS a fost apoi determinat prin sortarea celulelor activate de fluorescență pe un sistem de citometrie în flux Beckman Coulter cu o lungime de undă de excitare de 488 nm și lungime de undă de emisie de 525 nm [18].

Determinarea peroxidării lipidelor (LPO)

Testul substanțelor reactive cu acid tiobarbituric (TBARS) a fost efectuat pentru a detecta LPO. Toate etapele operaționale au fost efectuate în conformitate cu instrucțiunile (Sigma USA). Concentrațiile au fost calculate folosind un coeficient de extincție molar de 1,56 x 105/(M-cm), care a fost obținut utilizând malondialdehida ca standard. Rezultatele sunt exprimate ca nmol de echivalenți MDA/mg de proteină.

Determinarea activităților enzimatice

Activitățile enzimatice au fost testate folosind truse de testare, inclusiv glutation reductază (GR), glutation peroxidază (GPx) și superoxid dismutază (SOD). Toate etapele operaționale au fost efectuate în conformitate cu instrucțiunile furnizate (Institutul de Bioinginerie Nan Jing Jian Cheng China).

Animale și protocol experimental

Șobolanii Wistar masculi maturi (180-220 g, 8 ani) au fost obținuți de la centrul pentru animale al Universității de Medicină Militară a Patra, Xi'an, China. Permisul de utilizare a animalelor a fost obținut de la Comitetul de etică universitar (Număr de referință: 20190506). Experimentul pe animale a fost realizat conform ghidurilor universitare pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator.

Toți șobolanii au fost lăsați să se adapteze timp de aproximativ 1 săptămână înainte de începerea experimentului. După aclimatizare, șobolanii au fost distribuiți aleatoriu în 6 grupuri cu câte 5 animale în fiecare grup. Șobolanii din grupul de control au fost crescuți la presiune normală (PO.: 20 la sută; presiunea aerului: 101,3 kPa), în timp ce șobolanii din grupurile model și tratate cu Cis au fost crescuți într-o cameră de oxigen de joasă presiune (presiune internă de 61,6 kPa). , echivalent cu o înălțime de 4000 de metri deasupra nivelului mării; PO: 14,55 la sută ) pentru a simula un mediu hipoxic de mare altitudine. Toți șobolanii au avut acces liber la hrană și apă în cuști de plastic la 22 ±2 grade și condiții de umiditate cu un ciclu automat de 12-h lumină/întuneric. Șobolanii din modelul și grupurile tratate cu Cis au rămas în condiții hipobare, dar au fost transferați în condiții normobare la fiecare 96 de ore, moment în care li s-a furnizat hrană și apă, iar cuștile au fost curățate. Durata tranziției de la hipobaric la hipobaric a fost de aproximativ 2 ore. Toate grupurile de tratament au fost tratate cu Cis corespunzător (8 mg/kg/zi) prin gavaj oral timp de 8 săptămâni, în timp ce șobolanii martor și model au fost tratați cu un volum egal de apă.

După 8 săptămâni, șobolanii au fost sacrificați sub anestezie. Testiculele, epididimul și veziculele seminale au fost separate și cântărite, iar indicele de organ a fost calculat conform următoarei formule: (greutatea organului/greutatea animalului)

t) ×100 la sută . Ulterior, spermatozoizii din epididim au fost colectați și au fost testate motilitatea și activitatea enzimatică acrozomului. În mod similar, țesuturile testiculare au fost colectate pentru studii histopatologice și detectarea activității ROS, LPO și a enzimelor antioxidante.

Evaluarea ratei spermatozoizilor vii

Epididimul a fost incizat cu foarfece chirurgicale, iar suspensia de spermă a fost preparată în soluție salină normală. Pentru a evalua rata de spermatozoizi vii, 5 uL de suspensie de spermatozoizi au fost amestecati cu grija cu un volum egal de colorant de eozina-Y. Spermatozoizii au fost apoi numărați la microscop cu lumină. Ratele de spermatozoizi vii au fost evaluate prin calcularea atât a spermatozoizilor colorați (sperma morți) cât și a spermatozoizilor necolorați (sperma vii).

Determinarea activității enzimatice acrozomului spermatozoid

Testul activității enzimatice acrozomului spermatozoizilor a fost utilizat pentru a evalua enzimele acrozomului spermatozoizilor [19]. Rezultatele din fiecare grup au fost calculate folosind următoarea formulă: Activitatea enzimatică acrozomală (μIU)=(grup ODExperiment - grup ODBlank)/(247,5 × 10) × 106.

analize statistice

Toate datele cantitative sunt exprimate ca medie ± SD și au fost analizate utilizând software-ul SPSS 22.0. Testul t al Independent Student a fost folosit pentru a compara datele dintre două grupuri. „P<0.05>< 0.01="" were="" considered="" statistically="" significant="">

Rezultate

Efectele hipoxiei asupra celulelor GC-1

Pentru a determina efectele hipoxiei asupra celulelor germinale, am examinat mai întâi modificările în viabilitatea celulelor după tratamentul cu hipoxie cu diferite concentrații de oxigen (20 la sută, 15 la sută, 10 la sută, 5 la sută) timp de 1, 3, 5 și 7 zile. , respectiv. Rezultatele testului CCK-8 au arătat că, în comparație cu grupul de control (concentrație de oxigen de 20 la sută), celulele expuse la hipoxie au prezentat o scădere semnificativă a viabilității (P<0.01; figure="" 1a).="" moreover,="" their="" survival="" rate="" was="" inversely="" proportional="" to="" the="" oxygen="" concentration="" and="" further="" decreased="" with="" induction="" time.="" to="" avoid="" an="" excessive="" cytotoxic="" effect,="" a="" 10%="" oxygen="" concentration="" and="" 3-day="" induction="" time="" were="" selected="" as="" the="" hypoxic="" model="" criteria="" for="" subsequent="" in="" vitro="">

Ulterior, au fost efectuate colorarea FCM și imunofluorescență pentru a evalua în continuare alterarea proliferării celulelor GC-1 sub tratament cu hipoxie. Rezultatele au arătat că hipoxia ar putea induce oprirea celulelor GC-1 în faza G1, reducând astfel intrarea celulelor în faza S și inhibând replicarea ADN-ului. Astfel, hipoxia a redus semnificativ indicele de proliferare al celulelor GC-1 (P<0.01; figure="" 1b).="" positive="" ki-67="" staining="" is="" another="" specific="" biomarker="" of="" proliferating="" cells.="" therefore,="" we="" also="" examined="" the="" ratio="" of="" ki-67-positive="" cells="" with="" or="" without="" hypoxia="" treatment.="" compared="" with="" the="" control="" group,="" hypoxia="" treatment="" remarkably="" reduced="" ki-67-positive="" cells,="" as="" shown="" in="" figure="">

În continuare, ne-am propus să investigăm modul de inhibare a viabilității celulelor GC-1 indusă de hipoxie. După cum se raportează în literatură, nivelul ROS a crescut pe măsură ce șobolanii au fost expuși la un mediu hipobaric hipobaric [8,20]. Prin urmare, nivelurile ROS endogene din celulele GC-1 au fost măsurate folosind testul FCM. Rezultatele au arătat niveluri mai mari de ROS în hipoxie în comparație cu grupul de oxigen normal (P< 0.01;="" figure="" 1d).="" accumulated="" ros="" cause="" marked="" dna="" impairment,="" which="" in="" turn="" causes="" cell="" apoptosis="" pathway="" activation="" and="" might="" be="" the="" major="" etiological="" factor="" for="" the="" increased="" risk="" of="" male="" infertility="" [21,22].="" next,="" we="" detected="" the="" apoptotic="" activation="" effect="" of="" hypoxia="" on="" gc-1="" cells="" by="" tunelstaining.="" as="" shown="" in="" figure="" 1e,="" treatment="" with="" hypoxia="" resulted="" in="" an="" increase="" in="" tunel="" fluorescence="" compared="" with="" the="" control="" group,="" indicating="" an="" increase="" in="" apoptosis="" in="" the="" model="">

Deoarece deteriorarea celulelor induse de ROS este de obicei cauzată de sistemul de operare, am testat în continuare sistemul de operare al celulelor GC-1. După cum este prezentat în Figura 1F, nivelurile LPO ale celulelor GC-1 din grupul model au fost semnificativ

a crescut în comparație cu nivelurile LPO ale celulelor GC-1 din grupul de control. Aceste constatări sugerează că leziunea celulelor GC-1 indusă de hipoxie ar putea fi legată de OS, care este indusă de acumularea de ROS.

Efectele Cis asupra viabilității celulelor GC-1 induse de hipoxie in vitro.

Pentru a investiga dacă Cis poate preveni efectele inhibitoare ale hipoxiei asupra viabilității celulelor GC{{0}}, a fost efectuat un test CCK-8. Celulele GC-1 au fost tratate cu diferite subtipuri (Cis-A, B, C, H) și intervale de concentrație （0,02 μM, 0,2 μM, 2 μM) de Cis timp de 72 de ore. grupul model cu grupul DMSO a arătat că DMSO nu a promovat direct viabilitatea celulelor GC-1 (Figura 2A). Cu toate acestea, viabilitatea celulelor a fost restabilită semnificativ (P< 0.05)="" with="" cis="" treatments.="" compared="" with="" the="" model="" group,="" cis-a,="" cis-b,="" cis-c,="" and="" cis-h="" all="" showed="" certain="" protective="" effects="" on="" hypoxia-induced="" damage="" to="" gc-1="" cell="" viability,="" and="" cis-b="" showed="" the="" most="" significant="" effect(figure="" 2a).="" the="" protective="" effects="" of="" cis="" at="" 0.2="" μm="" were="" significantly="" higher="" than="" the="" protective="" effects="" of="" cis="" at="" 0.02="" μm,="" while="" the="" difference="" between="" 2="" μm="" and="" 0.2="" um="" was="" not="" obvious,="" indicating="" that="" the="" restored="" gc-1="" cell="" viability="" induced="" by="" cis="" demonstrated="" a="" dose-dependent="" increase="" in="" the="" concentration="" range="" from="" 0.02-0.2="" μm="" （figure="" 2a）.="" therefore,="" according="" to="" the="" experimental="" needs,="" 0.2="" m="" cis="" was="" selected="" as="" the="" optimal="" concentration="" in="" the="" following="" in="" vitro="" experiments.="" to="" further="" confirm="" whether="" germ="" cells="" were="" indeed="" protected="" by="" cis,="" fcm,="" and="" ki-67="" staining="" were="" performed="" to="" assess="" the="" alteration="" of="" the="" proliferation="" of="" gc-1="" cells="" after="" treatment="" with="" cis.="" upon="" cis="" treatment,="" the="" proportion="" of="" gc-1="" cells="" in="" the="" g1="" phase="" was="" reduced.="" in="" contrast,="" more="" cells="" entered="" s-phase,="" suggesting="" that="" cis-treatment="" could="" increase="" the="" germ="" cell="" proliferation=""><0.01; figure="" 2b).="" the="" statistics="" for="" the="" gc-1="" cell="" cycle="" are="" shown="" in="" figure="" 2bb.="" the="" ki-67="" staining="" results="" also="" showed="" that="" cis-a,="" cis-b,="" cis-cand="" cis-h="" treatment="" significantly="" improved="" the="" ki-67-positive="" cell="" ratio="" of="" hypoxia-induced="" gc-1="" cells="" in="" vitro(figure="">

Mecanismul Cis protejează celulele germinale de hipoxie in vitro.

Pentru a investiga dacă efectele protectoare ale Cis asupra celulelor GC-1 au fost legate de eliminarea ROS excesiv, colorantul fluorescent DCFH-DA a fost utilizat pentru a detecta nivelurile de ROS în fiecare grup. După cum se arată în figurile 3A, 3B, tratamentul cu DMSO nu a schimbat conținutul intracelular de ROS sau nivelul LPO în comparație cu grupul model. Cu toate acestea, nivelurile de ROS din celulele GC-1 au fost reduse semnificativ în grupurile tratate cu Cis (Figura 3A). Mai mult, a fost observată o scădere a LPO și în celulele GC-1 supuse la Cis (Figura 3B).

Pentru a explora în continuare mecanismul prin care Cis protejează celulele germinale de leziuni hipoxice, au fost efectuate colorarea TUNEL și analize Western blot pentru a evalua apoptoza. Colorația TUNEL (Figura 3C) a arătat apoptoză semnificativă în model și grupuri DMSO. Cu toate acestea, au fost observate mai puține celule apoptotice cu tratamentul Cis, ceea ce a indicat că tratamentul cu Cis a redus apoptoza celulelor GC-1. În plus, expresia PARP, Caspaze-3, Bax și Bcl-2 a fost măsurată pentru a corobora mecanismul molecular. După cum este prezentat în figura 3D, caspaza-3 și PARP au fost activate în celulele GC-1 sub hipoxie, iar această activare a fost inhibată de tratamentul cu Cis. În plus, raportul Bax/Bcl-2 a fost mai mare în grupul model decât în ​​grupul de control, iar tratamentul cu Cis a redus raportul Bax/Bcl-2 (Figura 3D). Aceste date au indicat că Cis avea o capacitate potențială de a atenua daunele oxidante induse de hipoxie, iar acest efect protector ar putea fi obținut prin reducerea acumulării de ROS și inhibarea activării căii apoptozei legate de caspază.

Mecanismul enzimatic care inhibă OS implică captatori de radicali liberi, cum ar fi glutation reductază (GR), glutation peroxidaza (GPx) și superoxid dismutază (SOD) [23]. Mecanismul enzimatic care inhibă OS joacă un rol esențial în preveniredaune oxidativeîn celule și țesuturi [23]. Pentru a valida în continuare mecanismul potențial al inhibării Cis a OS indus de hipoxie în celulele GC-1, au fost măsurate activitățile GR, GPx și SOD. Rezultatele au arătat că toate activitățile GR, GPx și SOD au scăzut semnificativ (P < 0.01,="" figura="" 3e)="" în="" caz="" de="" hipoxie="" în="" comparație="" cu="" grupurile="" de="" control,="" iar="" tratamentul="" cu="" cis="" le-a="" restabilit="" semnificativ="" activitățile="" în="" gc{{6}="" }="" celulele="" expuse="" la="" hipoxie="">< 0.05,="" figure="" 3e),="" suggesting="" that="" these="" compounds="" could="" activate="" the="" powerful="" endogenous="" antioxidant="">

Faceți clic pe linkul de mai jos pentru a obține informații despre partea 2
https://www.xjcistanche.com/news/part2-cistanoside-of-cistanche-herba-ameliorat-54370494.html