Partea 1 Mutațiile ERCC1 împiedică repararea daunelor ADN și provoacă disfuncție hepatică și renală la pacienți

Contact: ali.ma@wecistanche.com

Katja Apelt și colab

Click to Cistanche extract beneficii pentru functia rinichilor

Introducere

Cele șase miliarde de perechi de baze ale genomului uman sunt expuse continuu la agenți care dăunează ADN-ului, provocând o mare varietate de leziuni ADN genomic, inclusiv produse foto induse de lumina UV, legături încrucișate intra și intercatenare (ICL) și ADN dublu. rupturi de fir (DSB). Pentru a asigura integritatea genomică, aceste leziuni ADN trebuie reparate într-un mod specific și eficient. Au evoluat diferite mecanisme de reparare a ADN-ului, care acționează fiecare asupra unui subset specific de leziuni ADN. În timp ce multe proteine ​​de reparare a ADN-ului sunt implicate într-o singură cale, endonucleaza heterodimericăERCC1-XPF este împărțit între mai multe căi de reparare a ADN-ului distincte mecanic (Manandhar și colab., 2015).

XPF este instabil și se degrada rapid, ceea ce este prevenit prin heterodimerizarea sa cuERCC1(Biggerstaff și colab., 1993). Interacțiunea dintre aceste două proteine ​​este mediată de un motiv dublu helix-helix ac de păr (HhH)2 situat în C-terminalii lor respectivi, precum și prin domeniul central alERCC1, și domeniul nuclează al XPF (de Laat și colab., 1998b; Jones și colab., 2020; Tripsianes și colab., 2005; Tsodikov și colab., 2005). Legarea la ADN-ul dublu catenar este facilitată de ERCC1, în timp ce XPF mediază asocierea cu ADN-ul monocatenar (ssDNA) prin domeniul său (HhH)2 (Tsodikov și colab., 2005). Odată poziționat, XPF își folosește activitatea catalitică prin motivul său de nuclează foarte conservat pentru a scinda diferite substraturi ADN la cele 59 de joncțiuni ale bulelor și 39 de protuberanțe monocatenar care se extind dintr-o dublă helix ADN (de Laat și colab., 1998a; Enzlin și Sch¨). are, 2002; Matsunaga et al., 1996). Un rol-cheie al ERCC1- XPF a fost demonstrat pentru prima dată în repararea exciziei nucleotidelor (NER), unde scindează ADN-ul 59 deteriorat de leziune (Sijbers și colab., 1996a).

NER recunoaște o mare varietate de leziuni ADN care nu au legătură structurală, inclusiv fotoproduse induse de UV, prin intermediul celor două sub-căi: repararea globală a genomului (GGR) și repararea cuplată cu transcripție (TCR). Cea mai mare parte a activității NER se bazează pe GGR, unde proteina XPC recunoaște fotoproduși în întregul genom și recrutează complexul factor de transcripție IIH (TFIIH) (Sugasawa și colab., 1998; Volker și colab., 2001). Leziunile ADN care provoacă blocarea ARN polimerazei II (RNAPII) în timpul transcripției declanșează recrutarea de proteine ​​specifice TCR, cum ar fi CSB, CSA și UVSSA, care, la rândul lor, recrutează complexul TFIIH (Nakazawa și colab., 2020; van der Weegen). et al., 2020). În urma recrutării TFIIH la leziunea ADN, GGR și TCR se transformă într-un mecanism molecular comun care implică asocierea XPA și XPG (Marteijn et al., 2014), care stimulează activitatea helicazei a TFIIH și formează un complex stabil de precizie împreună cu RPA ( Kokic și colab., 2019; Riedl și colab., 2003; Wakasugi și Sancar, 1998). TheERCC1- heterodimerul XPF este recrutat în complexul NER de către XPA prin domeniul de legare a XPA alERCC1(Tsodikov și colab., 2007; Volker și colab., 2001). O incizie dublă prin activitatea coordonată a endonucleazelor XPF (59 din leziune) și XPG (39 din leziune) eliberează o întindere de ssDNA care conține leziunea ADN (Li și colab., 1995; Matsunaga și colab., 1995; O. „Donovan și colab., 1994; Staresincic și colab., 2009), după care golul generat este completat și ligat pentru a finaliza reparația.

Pe lângă NER, s-a arătat căERCC1-XPF joacă, de asemenea, un rol esențial în repararea ICL (Klein Douwel și colab., 2014). Această cale de reparare este inițiată de replicarea blocată și implică recunoașterea furculiței de replicare blocată de ICL de către complexul de anemie Fanconi (FA) cu miez multiproteic, care servește ca complex de ubiquitin ligază E3 pentru FANCD2. Mono-ubicuitilarea FANCD2 declanșează recrutarea SLX4, care, la rândul său, vizeazăERCC1-XPF la ICL (Abdullah și colab., 2017; Klein Douwel și colab., 2014; Walden și Deans, 2014; Wood, 2010). Odată recrutat, ERCC1-XPF mediază decuplarea ICL prin incizarea catenei de ADN parental de ambele părți ale leziunii pentru a permite bypass-ul și repararea ulterioară a leziunii (Kuraoka și colab., 2000). În cele din urmă, ERCC1-XPF a fost, de asemenea, implicat în repararea DSB prin recombinare omoloagă (Ahmad și colab., 2008), timp în care poate scinda eficient diferiți intermediari de recombinare (Wyatt et al., 2017). Alternativ, celulele folosesc calea de recoacere cu un singur catenar dependentă de RAD52-, care implică recoacerea regiunilor cu microomologie și îndepărtarea ulterioară a cozilor de ssADN 39 neomolog prinERCC1-XPF (Adair et al., 2000; Li et al., 2013, 2019). Cu toate acestea, rolul precis al ERCC1-XPF în aceste căi de reparare a DSB nu este pe deplin înțeles.

Importanța căilor de reparare a ADN-ului este subliniată de fenotipul clinic al indivizilor cu tulburări moștenite de reparare-deficiență a ADN-ului. Inactivarea GGR are ca rezultat Xeroderma pigmentosum (XP; MIM 278700, 610651, 278720, 278730, 278740, 278760 și 278780; DiGiovanna și Kraemer, 2012), care este crescută și caracterizată de fotosensibilitate și apariție a riscului. a cancerului de piele. Neurodegenerarea, întârzierea creșterii și boala multisistem fără cancer de piele sunt observate în sindromul Cockayne (CS; MIM 216400 și 133540). Pacienții cu CS au un defect genetic selectiv în TCR care previne procesarea RNAPII blocată de deteriorarea ADN-ului (Karikkineth și colab., 2017; Nakazawa și colab., 2020; Nakazawa și colab., 2012; Ribeiro și colab., 2018; Tufegdˇzi´ c Vidakovi´ c et al., 2020). Mutațiile genelor esențiale de reparații ICL provoacă FA (MIM 227650, 300514, 227645, 605724, 227646, 600901, 603467, 614082, 609053, 609054, 614083, 614087, 610832, 613390, 613395 , malformații de organ și instabilitate genomică (Auerbach, 2009). RolulERCC1-XPF în repararea ICL este subliniată de existența mutațiilor în XPF care dau naștere fenotipului FA (Bogliolo și colab., 2013; Ceccaldi și colab., 2016; Kashiyama și colab., 2013). Defectele moștenite în repararea DSB provoacă o gamă largă de tulburări asociate cu radiosensibilitate, predispoziție la cancer, imunodeficiență și neurodegenerare (Helfricht și colab., 2020; McKinnon și Caldecott, 2007).

Tulburările de reparare a ADN-deficiență sunt rare și apar cu o frecvență estimată de aproximativ 1 la 200,000 născuți vii în întreaga lume pentru XP, CS și FA. Cu toate acestea, până în prezent au fost descrise doar două rapoarte de indivizi cu mutații ERCC1 bi-alelice (MIM 126380) (Jaspers și colab., 2007; Kashiyama și colab., 2013). Ambele persoane au prezentat caracteristici compatibile cu CS și au murit la 14 luni și 2,5 ani. Primul și cel mai grav individ afectat (165TOR) a purtat un codon de stop prematur (Q158X) pe o alele și o variantă greșit F231L pe cealaltă (Jaspers și colab., 2007). Al doilea individ (CS20LO) a fost homozigot pentru varianta missense F231L (Kashiyama et al., 2013). Celulele de la ambii indivizi au arătat sensibilitate la deteriorarea ADN-ului indusă de UV și 165TOR, în special, a fost, de asemenea, ușor sensibil la agenții inductori de ICL. Ambii indivizi au murit în copilăria timpurie (1–2 ani; Jaspers și colab., 2007; Kashiyama și colab., 2013). Un al treilea individ (XP202DC) cu mutații ERCC1 bi-alelice care a murit la vârsta de 37 de ani este citat într-un rezumat al reuniunii (Imoto, K., et al. 2007. Pacienți cu defecte în proteinele de reparare a exciziei nucleotidelor care interacționeazăERCC1sau XPF prezintă xeroderma pigmentosum cu degenerare neurologică severă cu debut tardiv. [Rezumat] J. Invest. Dermatol. 127:S92). Acest individ era heterozigot compus pentru o mutație nonsens (K226X) și o mutație splice înERCC1. O descriere fenotipică detaliată nu este disponibilă, iar impactul acestor mutații ERCC1 este necunoscut.

Fenotipul celor doi indivizi menționați mai sus este mai sever decât cel așteptat doar din deficiența NER, în concordanță cu implicarea ERCC1-XPF în mai multe căi de reparare a ADN-ului. În conformitate cu aceasta, fie șoarecii ERCC1, fie XPF-KO au prezentat letalitate embrionară mare și durata de viață scăzută și au murit din cauza insuficienței hepatice severe (McWhir și colab., 1993; Tian și colab., 2004; Weeda și colab., 1997), care nu se observă la șoarecii XPA-KO cu deficit de NER (de Vries și colab., 1995; Nakane și colab., 1995).

În studiul actual, descriem doi frați cu mutații bi-alelice ERCC1 care au un fenotip unic de statură mică, fotosensibilitate, boală hepatică colestatică progresivă și tubulopatie renală. Ambii indivizi au dezvoltat insuficiență hepatică progresivă și au necesitat transplant hepatic înainte de vârsta de 10 ani. Studiile funcționale arată că nivelul de proteină la starea de echilibru al ERCC1 și XPF a fost redus dramatic în celulele staționare și în celulele epiteliale knock-in care poartă varianta missense găsită la pacienți. În plus, proteina ERCC1 mutantă a interacționat doar slab cu alte proteine ​​de reparare NER și ICL. Raportăm un nou caz de deficiență ERCC1 care afectează puternic NER și are un impact considerabil asupra reparației ICL, care împreună au ca rezultat un fenotip unic care combină statura mică, fotosensibilitatea și ficatul progresiv șidisfuncție renală.

Rezultate

Doi frați cu fotosensibilitate, statură mică și disfuncție hepatică și renală progresivă

Fratele 1 (PV50LD; Fig. 1 A) are 13 ani, cel mai mare dintre trei frați cu părinți sănătoși, neînrudiți, de etnie mixtă, inclusiv indigeni australian, maltezi și anglo-celtic. În timpul sarcinii, mama ei a avut o cardiomiopatie dilatativă tranzitorie care s-a rezolvat postpartum. S-a născut la 39 săptămâni de gestație, iar greutatea ei la naștere a fost de 1,9 kg (Z=-3,8), lungimea de 44 cm (Z=-2,44) și circumferința capului de 29,5 cm (Z {{{ 17}} −3,8). Ea a avut o creștere slabă în copilărie și, la vârsta de 18 luni, s-a observat că avea disfuncție hepatică cu un model predominant colestatic. Ecografia hepatică și colangiopancreatografia prin rezonanță magnetică au fost normale. Funcția hepatică a scăzut progresiv, așa cum este evident din creșterea progresivă a nivelurilor de -glutamiltransferazei (GGT), alanin transaminazei (ALT) și bilirubinei (Fig. S1, A-C). La o biopsie hepatică (la vârsta de 3,5 ani), parenchimul lobular a arătat variații în morfologia nucleară a hepatocitelor, cu niște nuclei mult mai mari și celule cu nuclei dubli (Fig. S1 D) până la zonele în care celulele au nuclei mici, neremarcabili. A existat fibroză portală ușoară și expansiune portală fibroasă ușoară și inflamație ușoară a interfeței focale, fără ductopenie sau fibroză periductală (Fig. S1 E).

Ea a suferit un număr mare de infecții recurente, inclusiv amigdalita, varicela, boala mâinii-picior și gură, pneumonie, bronșită și episoade recurente de febră, dureri abdominale și scaune palide, fără nicio cauză găsită. Investigațiile imunologice nu au identificat nicio imunodeficiență. Ea a dezvoltat episoade de fotosensibilitate oculară și a pielii. La vârsta de 6 ani, a fost detectată disfuncție renală, cu caracteristici sugestive de disfuncție tubulară proximală caracterizată prin albuminurie (interval sub-nefrotic) și hipercalciurie. Funcția ei renală a fluctuat, cu episoade intermitente deleziuni renale acute, progresivăinsuficiență renalăcu creșterea nivelului creatininei (Fig. S1 F) și răspuns minim la inhibarea acetilcolinesterazei. Ecografia renală a arătat micrinichicu ecogenitate crescută şi diferenţiere corticomedulară redusă. Testele funcției pulmonare au arătat o boală pulmonară restrictivă ușoară până la moderată.

Etapele de dezvoltare au fost normale, dar unele dificultăți de învățare au fost evidente la vârsta școlară, fără semne de regresie. Vederea și auzul erau normale. Creșterea a rămas foarte lentă în ciuda hrănirii suplimentare. Ea a fost relativ stabilă până la vârsta de 9,5 ani, când a prezentat dovezi de decompensare hepatică cu o creștere progresivă a nivelului de bilirubină (Fig. S1 C) și raport internațional normalizat. Ea a suferit un transplant de ficat ortotopic la vârsta de 9 ani și 10 luni. În urma unui transplant de ficat, tubulopatia ei s-a stabilizat, deși creatinina ei serică continuă să crească într-un ritm mai lent (Fig. S1 F). Este stabilă clinic. La vârsta de 12 ani, a fost diagnosticată insuficiența ovariană. Imagistica prin rezonanță magnetică a creierului (IRM) la vârsta de 12 ani a arătat atrofie cerebrală ușoară cu atrofie cerebeloasă moderată și atrofie ușoară a trunchiului cerebral. La ultima evaluare (în vârstă de 13,5 ani), creșterea a fost lentă (greutate 22,4 kg [Z=-6,08] și înălțime 134,7 cm [Z=-3,72]). Avea o construcție foarte subțire, cu o masă musculară slabă și puțină grăsime subcutanată. Ea a dezvoltat pistrui pe zonele expuse la soare (Fig. 1 A). Avea ochii ușor adânciți, iar părul ei de pe scalp era subțire. Nu au existat anomalii ale razelor radiale. Examenul neurologic a arătat slăbiciune ușoară, ataxie minimă și reflexe deprimate.

Fratele 2 (PV46LD; Fig. 1 A) are 11 ani, o soră mai mică față de fratele 1. Sarcina a fost complicată de placenta previa și cardiomiopatie maternă tranzitorie, iar fratele 2 s-a născut la 35 săptămâni de gestație cu o greutate la naștere de 1,79 kg (al treilea centil), o lungime de 45 cm (al treilea centil) și o circumferință înainte de 29 cm (mai puțin decât al treilea centil). Avea puțină grăsime subcutanată și trăsături faciale similare cu fratele ei mai mare. Ea a prezentat un eșec de a se dezvolta în primul an de viață și insuficiență hepatică de la vârsta de 2 ani, cu niveluri semnificativ crescute de GGT, ALT și bilirubină (Fig. S1, A-C). Biopsia hepatică la vârsta de 6 ani a arătat leziuni ale căilor biliare intrahepatice, ducând la fibroză periductală. Ca și în cazul biopsiei hepatice de la sora ei, a fost observat un număr moderat de hepatocite dublu-nucleate, unele cu nuclei mari și nucleoli mari.

A avut episoade de fotosensibilitate oculară și a pielii. Ea a prezentat o tubulopatie renală cu insuficiență renală ușoară, cu creșterea progresivă a nivelului de creatinine (Fig. S1 F). Ecografia renală a arătat micrinichicu nefrocalcinoză. Etapele de dezvoltare au fost normale, dar o dizabilitate intelectuală ușoară (IQ 66) a fost diagnosticată la vârsta școlară. A existat un progres lent cu etapele de neurodezvoltare și nicio regresie definitivă. Vederea și auzul erau normale. Insuficiența hepatică a fost progresivă, iar la vârsta de 8 ani, ea a suferit un transplant de ficat. RMN-ul creierului la vârsta de 5 ani a fost normal, dar un RMN repetat la 10 ani a arătat atrofie cerebeloasă moderată și atrofie cerebrală ușoară. La vârsta de 11 ani, măsurarea estrogenului, a hormonului foliculostimulant și a hormonului luteinizant a arătat un model care sugerează insuficiența ovariană. La ultima evaluare la vârsta de 11 ani, creșterea a fost lentă (greutate 20 kg [Z=-3,89] și înălțime 120,7 cm [Z=-3,17]). Avea o construcție foarte subțire, cu grăsime subcutanată minimă și volum redus de mușchi, trăsături faciale familiale, ochi ușor adânciți și pistrui pe zonele expuse la soare (Fig. 1 A). Nu avea anomalii ale razelor radiale. Examenul neurologic a arătat o slăbiciune ușoară cu ataxie ușoară și reflexe absente.

Analiza moleculară identifică noi mutații bi-alelice ERCC1

Exome sequencing revealed that both siblings harbor a novel missense variant in exon 4 of the ERCC1 gene (p.R156W; c.466C>T) on the paternal allele (Fig. S2 A). The presence of the c.466C>Varianta T missense a fost confirmată prin secvențierea Sanger la ambii frați afectați (Fig. 1 B). Secvențierea întregului genom a relevat o deleție în exonul 4 pe alela maternă (hg19: chr19:45,922,224- 45,924,375; Fig. S2 B), care a fost confirmată prin PCR cantitativă comparativă (qPCR) a exonului 4 și exonului 5 a ERCC1 la ambii frați și la mamă (Fig. 1, C și D). Deleția, care se așteaptă să fie o alelă nulă, nu a fost detectată nici la tată, nici în patru probe de control negativ (Fig. 1 D).

While a previously described pathogenic ERCC1 missense variant (p.F231L; c.693C>G) este situat în domeniul (HhH)2 (Fig. 1 E), varianta missense (p.R156W) este situată în domeniul central al ERCC1 și este în imediata apropiere a buzunarelor de legare XPA (110–154 aa) a ERCC1 (Fig. 1 E). Analiza structurală a domeniului central ERCC1 a relevat un buzunar hidrofob îngust în formă de V care leagă un motiv scurt (67–80 aa) prezent în XPA (Fig. 1 F; Tsodikov și colab., 2007). Aminoacizii care acoperă buzunarul de legare a XPA din ERCC1 (Fig. 1 F) sunt importanți pentru NER, dar nu pot fi folosite pentru alte căi de reparare dependente de ERCC1-(Orelli et al., 2010). Reziduul R156 care este substituit la pacienți este situat chiar sub buzunarul de legare a XPA și formează o punte de sare cu aminoacidul opus D129 (Fig. 1 F). Prin urmare, înlocuirea R156W afectează probabil stabilitatea buzunarului de legare XPA. Este posibil ca această substituție să slăbească, de asemenea, interacțiunea dintre domeniul central al ERCC1 și domeniul nuclează al XPF (Jones et al., 2020), și am prezice că acest lucru ar putea duce la o destabilizare ușoară până la moderată a interfeței heterodimerului, rezultând o stabilitate redusă a proteinei.

Fibroblastele PV46LD și PV50LD prezintă un defect NER sever. Un semn distinctiv al deficienței NER este o sensibilitate puternică la iradierea UV-C. Pentru a aborda impactul deficienței ERCC1 asupra funcției NER, am obținut fibroblaste primare din biopsiile de piele ale ambilor frați afectați. Pentru a permite testele de supraviețuire clonogene, am imortalizat celulele PV50LD prin introducerea hTERT (Fig. S3 A). Ca control, am generat celule ERCC1-KO complete în celule RPE1-hTERT prin CRISPR-Cas9 (Fig. 2 A). Testul de supraviețuire UV-C clonogenic a arătat că celulele PV50LD-hTERT sunt hipersensibile la iradierea UV-C, deși nu în aceeași măsură ca celulele ERCC1-KO complete (Fig. 2 B), sugerând un defect sever în NER.

Leziunile ADN induse de UV întâlnite în timpul transcripției sunt reparate prin TCR, care poate fi măsurată prin analiza de recuperare a sintezei ARN (RRS) (Nakazawa și colab., 2010). Am măsurat RRS în fibroblastele 48BR (WT), fibroblastele pacienților și am inclus fibroblastele primare cu deficit de XPA (XP1PD) ca martor. Etichetarea transcriptelor naștere prin încorporarea 5-etinil-uridinei a arătat o scădere puternică indusă de UV a transcrierilor naștere în toate liniile celulare la 3 ore după UV-C. În timp ce 48BR și-a recuperat complet transcripția în 18 ore după iradierea UV-C, ambele fibroblaste ale pacienților s-au recuperat chiar mai puțin decât celulele pacientului XP-A cu deficit de NER (Fig. 2, C și D), sugerând că TCR este practic absent în aceste condiții.

Pentru a examina activitatea GGR, am măsurat sinteza ADN neprogramată (UDS) în celulele care nu se divizează (Nakazawa și colab., 2010). În acest scop, fibroblastele primare au fost iradiate local cu lumină UV-C, urmată de marcarea pulsului cu analogul timidinei 5-etinil-deoxiuridină (EdU) pentru a măsura repararea. Încorporarea clară a EdU a fost detectată în celulele 48BR la locurile de deteriorare locală a ADN-ului indusă de UV. Cu toate acestea, doar niveluri foarte scăzute de încorporare EdU au fost detectabile la fibroblastele pacientului la niveluri similare cu cele ale fibroblastelor cu deficit de XPA (XP1PD; Fig. 2, E și F). Nivelurile UDS din celulele PV46LD și PV50LD au fost comparabile cu, sau chiar mai mici decât, nivelurile măsurate în ERCC1-deficient 165TOR descris anterior (Jaspers și colab., 2007) și CS20LO (Kashiyama și colab., 2013) celule, pe care le-am inclus în paralel (Fig. 2 G și Fig. S3 B). Important, reexprimarea ERCC1 marcată cu meniuri în ambele fibroblaste a salvat complet încorporarea EdU (Fig. 2, E și F; și Fig. S3 C), confirmând că defectul puternic UDS se datorează deficienței ERCC1. De asemenea, am obținut fibroblaste primare de la părinți, care au prezentat UDS normal la locurile de leziuni UV locale (Fig. 2 H), sugerând că defectul heterozigot ERCC1 respectiv la părinți este complet compensat de alela WT.

Fibroblastele PV46LD și PV50LD au niveluri foarte scăzute de proteine ​​ERCC1 și XPF

NER implică asamblarea înalt coordonată și secvenţială a complexelor de reparare a ADN-ului, timp în care recrutarea XPA are loc în aval de TFIIH, dar în amonte de ERCC1-XPF (Volker et al., 2001). Pentru a aborda în ce măsură fibroblastele pacientului încă mai susțin asamblarea complexului NER, am iradiat local fibroblastele cu UV-C și am monitorizat recrutarea mai multor proteine ​​de bază NER prin etichetare imunofluorescentă (Fig. 3 A, cuantificare și Fig. S3 D). Recrutarea clară a TFIIH, XPA și ERCC1 la locurile de deteriorare locală a ADN-ului indusă de UV a fost detectată în celulele 48BR, în timp ce celulele XP1PD cu deficit de XPA nu au reușit să recruteze ERCC1 așa cum s-a descris anterior (Fig. 3 A și Fig. S3 D; Volker și al., 2001). Atât celulele PV46LD, cât și PV50LD au prezentat recrutare normală de TFIIH și XPA, în timp ce recrutarea ERCC1 la locurile de deteriorare locală a ADN-ului indusă de UV a fost nedetectabilă (Fig. 3 A și Fig. S3 D).

Pierderea localizării ERCC1 s-ar putea datora unui eșec al recrutării ERCC1, unei reduceri generale a nivelurilor de proteine ​​ERCC1 sau unei combinații a celor două. Analiza Western blot a dezvăluit într-adevăr că nivelurile la starea de echilibru atât ale ERCC1, cât și ale XPF au fost reduse dramatic în celulele PV46LD și PV50LD (Fig. 3 B). Expresia ERCC1 reziduală a fost, totuși, încă detectată în comparație cu celulele ERCC1-KO complete (Fig. 3 B). Reducerea nivelurilor de proteine ​​ERCC1 și XPF în celulele PV46LD a fost foarte similară cu nivelurile reduse detectate fie în celulele CS20LO, fie în celulele 165TOR (Fig. 3 C și Fig. S3, E și F), sugerând că fenotipul mai sever la individul din care au fost derivate aceste celule nu se datorează unui impact mai puternic asupra stabilității proteinelor. În conformitate cu rezultatele noastre UDS, am detectat expresia normală a ERCC1 și XPF în celulele părinților, indicând compensarea de către alela WT (Fig. 3 D). Etichetarea imunofluorescentă a confirmat că nivelurile de proteine ​​ERCC1 și XPF au fost reduse sever, în timp ce celulele de la părinți nu se distingeau de celulele WT (Fig. 3 E). Cuantificarea datelor Western blot arată că nivelurile de proteină ERCC1 au fost reduse la aproximativ 20% fibroblaste pentru pacienți internați, ducând, de asemenea, la niveluri similare reduse ale nivelurilor XPF (~20%; Fig. 3 F).

Introducerea variantei missense R156W duce la instabilitatea proteinei ERCC1-XPF și la un defect sever al NER

Este tentant să speculăm că nivelurile scăzute de proteine ​​în starea de echilibru ale ERCC1-XPF și defectul puternic NER din fibroblastele pacientului sunt cauzate de substituția aminoacizilor R156W în ERCC1. Cu toate acestea, având în vedere că indivizii afectați sunt frați, nu putem exclude că și alte trăsături genetice împărtășite între ei pot contribui la acest fenotip.

To directly assess this, we decided to generate knock-in lines (KIs) carrying the R156W amino acid substitution in RPE1- hTERT cells using CRISPR-Cas9 technology. We obtained homozygous KI clones carrying the patient mutation in ERCC1 (p.R156W; c.466C>T), care a fost confirmată prin secvențierea Sanger în două clone individuale (Fig. 4 A). Mutația missense a provocat o reducere severă a nivelurilor de proteine ​​ERCC1 și XPF în ambele clone KI (clonele 2-17 și 2-51; Fig. 4 B și Fig. S4, A și B). Cuantificarea datelor Western blot a arătat că nivelurile de proteine ​​ERCC1 și XPF au fost aproape la fel de scăzute ca în celulele ERCC1-KO (Fig. 4 C). Aceste constatări stabilesc că substituția aminoacizilor R156W are un impact puternic asupra stabilității ERCC1.

Pentru a stabili în continuare că defectul NER în fibroblastele pacienților este cauzat de substituția aminoacizilor R156W în ERCC1, am măsurat activitatea TCR prin monitorizarea repornirii transcripției după iradierea UV. În timp ce celulele parentale RPE1-hTERT au prezentat repornirea normală la 18 ore după UV, ambele clone R156W-KI au prezentat un defect TCR puternic comparabil cu celulele ERCC1-KO complete (Fig. 4, D și E). În mod similar, experimentele UDS au dezvăluit activitate GGR normală în celulele RPE1-hTERT parentale, care a fost redusă sever sub 10% atât în ​​clonele R156W-KI, cât și în celulele ERCC{1-KO (Fig. 4, F și G) . În cele din urmă, am măsurat sensibilitatea UV a unei clone R156W-KI (2-51) în comparație cu fibroblastul PV50LD al pacientului imortalizat cu hTERT. Celulele R156W-KI au prezentat un fenotip puternic sensibil la UV, deși nu la fel de sensibil ca celulele ERCC1-KO complete (Fig. 4 H). Interesant, fenotipul sensibil la UV al R156W-KI a fost foarte similar cu cel al fibroblastelor pacientului PV50LD-hTERT. Aceste constatări stabilesc că nivelurile scăzute ale proteinei ERCC1-XPF și defectul puternic NER sunt o consecință directă a substituției aminoacizilor R156W în ERCC1.

Substituția ERCC1R156W determină localizarea citoplasmatică parțială

Fibroblastele pacientului și celulele KI prezintă niveluri de proteine ​​reduse dramatic și activitate NER puternic redusă. În continuare, am dorit să examinăm dacă defectul NER este cauzat doar de nivelurile reduse de proteine ​​ERCC1-XPF sau dacă proteina ERCC1R156Wmutant are activitate redusă ca endonuclează sau în NER.

Pentru a rezolva acest lucru, am generat celule ERCC1-KO de CRISPR Cas9 în celule U2OS echipate cu sistemul Flp-In/T-Rex. Folosind recombinarea direcționată pe site bazată pe Flp, am vizat cADN-urile care codifică ERCC1WT sau ERCC1R156W marcat cu GFP la site-ul țintă de recunoaștere genomică Flp (FRT) pentru a permite expresia inductibilă de la un promotor viral puternic. Analiza Western blot a arătat că ERCC1WT și ERCC1R156W au fost exprimate la niveluri similare și că expresia oricărei proteine ​​a salvat nivelurile reduse de proteine ​​​​de XPF observate în celulele ERCC1-KO (Fig. 5 A). Prin urmare, aceste celule sunt un sistem model excelent pentru a dezlega impactul specific al substituției ERCC1R156W atunci când sunt exprimate la niveluri WT de impactul exprimării mai scăzute a ERCC1 în fibroblastele pacientului și celulele epiteliale KI.

Studiile anterioare au arătat că mutațiile missense în XPF pot cauza localizarea greșită a ERCC1-XPF în citoplasmă (Ahmad și colab., 2010). În conformitate cu aceasta, am detectat, de asemenea, că aproximativ 40% din grupul de proteine ​​ERCC1R156W a fost localizat greșit în citoplasmă, ceea ce a fost doar aproximativ 15% în celulele care exprimă ERCC1WT (Fig. 5, B și C). Această localizare greșită a ERCC1 a crescut, de asemenea, fracția de XPF citoplasmatic (Fig. 5, B și C), indicând faptul că ERCC1R156W poate fi parțial pliat greșit.

Pentru a testa această posibilitate, am efectuat experimente de imunoprecipitare pe ERCC1WT-GFP și ERCC1R156W-GFP, urmate de spectrometrie de masă cantitativă fără etichete (MS) pentru a mapa interactori diferențiați ai celor două proteine ​​ERCC1. Important, MS cantitativ a confirmat că au fost trase în jos cantități egale de proteine ​​ERCC1WT-GFP și ERCC1R156W-GFP (Fig. 5 D). În mod surprinzător, interactomul ERCC1R156W a fost îmbogățit pentru proteine ​​de șoc termic (HSP), în special din familia HSPA, în timp ce interacțiunea cu XPF a fost redusă cantitativ în comparație cu ERCC1WT (Fig. 5 D). Proteinele HSPA sunt chaperone de pliere a proteinelor care împiedică agregarea proteinelor pliate greșit (Stetler și colab., 2010). Experimentele de co-imunoprecipitare (Co-IP) au confirmat într-adevăr că ERCC1R156W-GFP a interacționat puternic cu HSPA4 în comparație cu ERCC1WT (Fig. 5 E), sugerând plierea greșită parțială a ERCC1R156W.

Pentru a aborda în ce măsură ERCC1R156W-XPF este încă activ ca endonuclează, am purificat complexul recombinant din celulele de insectă Sf9 (Fig. S4 C). Procedura noastră stabilită anterior implică o etapă de filtrare pe gel care ne permite să evaluăm dacă ERCC1-XPF este într-o stare dimerică sau agregată (Fig. 5 F, fracțiile 2 și, respectiv, 1). Randamentul complexului recombinant ERCC1R156W XPF a fost mai mic și a arătat un nivel mai ridicat de proteină agregată. Mai mult, am observat și o reducere a fracției de proteină heterodimerică în comparație cu ERCC1WT-XPF (Fig. 5 F). Cu toate acestea, recombinantul heterodimeric ERCC1R156W-XPF din fracția 2 a fost complet activ atunci când a fost incubat cu un substrat ADN model cu buclă stem, în timp ce ERCC1-XPFD687A catalitic inactiv, inclus ca martor negativ, a fost lipsit de activitate de incizie (Fig. .5 G). Aceste descoperiri sugerează că ERCC1R156W-XPF este parțial pliat greșit și localizat greșit, dar fracțiunea de proteină care se pliază corect este încă activă ca endonuclează.

Proteina mutantă ERCC1R156W nu reușește să interacționeze eficient cu factorii de bază NER

Apoi am abordat modul în care substituția ERCC1R156W a afectat NER folosind celulele ERCC1-KO reconstituite. Deoarece substituția R156W este situată chiar sub buzunarul de legare a XPA din ERCC1 (Fig. 1 F), am întrebat dacă ERCC1R156W ar putea interacționa în continuare cu proteinele NER ca răspuns la iradierea UV. Pentru a testa acest lucru, am imunoprecipitat ERCC1WT-GFP, ERCC1R156W-GFP sau GFP fuzionat cu un semnal de localizare nucleară (GFP-NLS) ca control din celulele iradiate cu UV și ulterior am efectuat MS fără etichetă. Comparând ERCC1-GFP cu GPF-NLS, am identificat interactori constitutivi și induși de UV ai ERCC1. Analiza noastră a arătat că atât ERCC1WT, cât și ERCC1R156W au interacționat cu XPF și proteinele de schelă specifice reparației ICL SLX4 și SLX4IP, deși reduse cantitativ în celulele care exprimă ERCC1R156W (Fig. 6, A și B). În mod surprinzător, interacțiunea indusă de UV cu subunitatea TFIIH XPB în celulele ERCC1WT a fost complet pierdută în celulele ERCC1R156W (Fig. 6, A și B). Experimentele Co-IP au confirmat că ERCC1R156W nu a reușit să se asocieze nici cu TFIIH, nici cu XPA ca răspuns la iradierea UV, în timp ce interacțiuni robuste au fost detectate după tragerea în jos a ERCC1WT (Fig. 6 C și Fig. S4, D și E).

Recrutarea ERCC1-XPF la complexele NER depinde pe deplin de XPA (Volker și colab., 2001), ridicând întrebarea dacă ERCC1R156W este încă recrutat în locurile de deteriorare a ADN-ului indusă de UV. Pentru a rezolva acest lucru, am monitorizat recrutarea ERCC1-GFP la leziunile ADN induse de UV folosind imagistica cu celule vii. În acest scop, celulele au fost iradiate cu un laser UV-C (266-nm), care a declanșat recrutarea rapidă a ERCC1WT-GFP în primele 60 de secunde după iradiere, atingând un platou în jur de 120 de secunde (Fig. 6, D și E). În schimb, doar recrutarea foarte slabă a ERCC1R156W-GFP a putut fi detectată la iradierea UV-C folosind condiții identice (Fig. 6, D și E). Aceste constatări sugerează că incapacitatea ERCC1R156W de a interacționa cu XPA limitează sever asocierea acestuia cu complexul NER.

Descoperirile noastre în celulele ERCC1-KO reconstituite sugerează că ERCC1R156W încă suportă activitatea de reparare reziduală (~40 la sută) atunci când este exprimat la niveluri similare cu ERCC1WT. Pentru a încerca să măsoare repararea reziduală în fibroblastele primare PV46LD și PV50LD, care au arătat o expresie sever redusă a proteinei mutante ERCC1R156W, am efectuat experimente UDS în care am permis celulelor să încorporeze EdU pentru perioade lungi de timp (4 ore) pentru a captura repararea reziduală. . În timp ce UDS era încă sub ~ 10% în celulele XP1PD cu deficit de XPA, în celulele PV46LD și PV50LD UDS a crescut de la ~ 10% la ~ 20% UDS în aceste condiții (Fig. 6 J și Fig. S5 A). Aceste descoperiri arată că proteina mutantă ERCC1R156W, exprimată la niveluri scăzute în celulele pacientului, susține activitatea NER reziduală, explicând probabil caracteristicile clinice ușoare de tip XP observate la ambii frați. În aceste condiții, am detectat, de asemenea, UDS rezidual în celulele ERCC1- deficiente 165TOR (Jaspers et al., 2007) și CS20LO (Kashiyama și colab., 2013) descrise anterior la niveluri chiar mai mari decât cele detectate în celulele PV46LD și PV50LD. (Fig. 6 J și Fig. S5 A).

Impactul ERCC1R156W în repararea ICL

În timpul reparației ICL, proteina de schelă SLX4 recrutează ERCC1-XPF pentru a efectua inciziile de deblocare care permit repararea ulterioară. Analiza noastră MS a arătat că ERCC1R156W a interacționat în continuare cu SLX4, deși la niveluri reduse în comparație cu ERCC1WT (Fig. 6, A și B). Experimentele Co-IP au confirmat într-adevăr o interacțiune puternică a ERCC1WT cu SLX4, care nu a fost afectată de iradierea UV, în timp ce interacțiunea cu ERCC1R156W a fost puternic redusă (Fig. 7 A). Pentru a rezolva dacă această interacțiune redusă a afectat recrutarea ERCC1 la ICL, am iradiat local celulele cu un laser UV-A (365 nm) în prezența trioxsalenului, care este un derivat de psoralen care formează ICL-uri la iradierea UV (Velimezi și colab. , 2018). Iradierea locală cu laserul UV-A a declanșat recrutarea de FANCD2 endogen numai în celulele sensibilizate cu trioxsalen, demonstrând că ICL-urile au fost induse în condițiile noastre (Fig. S5 B). Am putut detecta o recrutare puternică de GFP-ERCC1WT-GFP la ICL-uri locale, în timp ce recrutarea de ERCC1R156W a fost mult mai slabă (Fig. 7, B și C), sugerând că interacțiunea scăzută cu SLX4 scade și eficiența cu care ERCC1R156W este recrutat pentru ICL-uri. Cu toate acestea, testele de supraviețuire clonogenă după expunerea la agentul inductor de ICL mitomicina C (MMC) au arătat că ERCC1R156W a salvat hipersensibilitatea celulelor ERCC1-KO la MMC, deși puțin mai puțin decât ERCC1WT (Fig. 7 D). Aceste experimente arată că proteina mutantă ERCC1R156W sprijină repararea ICL aproape de nivelurile WT atunci când proteina mutantă este exprimată la niveluri aproape normale.

Pentru a stabili dacă fibroblastele pacientului PV46LD și PV50LD, care au arătat o expresie substanțial redusă a ERCC1R156W, susțin încă repararea eficientă a ICL, am efectuat un test de rupere a cromozomilor indusă de MMC. Această metodă măsoară rupturile cromozomilor induse de MMC în celulele metafază cauzate de o deficiență în repararea ICL. În timp ce celulele 48BR (WT) au acumulat foarte puține pauze după MMC, am măsurat ruperea semnificativă a cromozomului indusă de MMC în celulele WK8103 derivate de la pacient Fanconi (Poll și colab., 1984; Fig. 7 E). Atât PV46LD cât și PV50LD au prezentat un fenotip intermediar cu formare de rupere crescută ca răspuns la MMC, deși nu în aceeași măsură ca celulele Fanconi (Fig. 7 E). În conformitate cu aceasta, celulele PV50LD-hTERT și celulele RPE1-hTERT R156W-KI au fost sensibile la MMC în testele de supraviețuire clonogene, în timp ce celulele VU121F-hTERT cu deficit de FANCF (Joenje și colab., 1997) și în special ERCC{ {24}}Celulele KO au fost hipersensibile la MMC (Fig. 7 F). În concluzie, expresia mai scăzută a ERCC1R156W și interacțiunea scăzută cu SLX4 au un impact considerabil asupra reparării ICL, deși celulele pacientului nu sunt nici pe departe la fel de sensibile precum celulele Fanconi sau ERCC1-KO complete. Acest lucru explică probabil de ce nu sunt evidente caracteristici asemănătoare FA la cei doi frați.

Impactul ERCC1R156W în repararea DSB

Având în vedere rolul ERCC1-XPF în repararea DSB, am abordat, de asemenea, în ce măsură ERCC1R156W acceptă în continuare acest proces de reparare. În acest scop, am efectuat imagini cu celule vii după iradierea cu laser UV-A în celule sensibilizate cu BrdU pentru a genera DSB-uri locale (Lukas și colab., 2003). Recrutarea XRCC4 endogenă a putut fi detectată la locurile de iradiere locală cu laser UV-A numai după sensibilizarea BrdU (Fig. S5 C), arătând că DSB-urile au fost induse în condițiile noastre. Recrutarea ERCC1WT-GFP pe site-urile DSB-urilor a fost detectată în mod clar, în timp ce aceasta a fost mult mai slabă pentru ERCC1R156W (Fig. 8, A și B). Cu toate acestea, testele de supraviețuire clonogene după radiații ionizante (IR) nu au arătat nicio diferență între celulele ERCC1-KO reconstituite fie cu ERCC1WT, fie cu ERCC1R156W (Fig. 8 C), sugerând că proteina ERCC1 mutantă sprijină repararea DSB.

Pentru a aborda acest lucru și în celulele pacientului, am efectuat teste de supraviețuire clonogenă în fibroblaste imortalizate cu hTERT după expunerea la doze crescânde de IR. Fibroblastele cu deficit de XRCC4 (CS16NG-hTERT; Guo et al., 2015) erau în mod clar sensibile la IR deja la cea mai mică doză (2 Gy). Cu toate acestea, celulele PV50LD-hTERT nu au fost foarte sensibile la 2 Gy și au arătat o sensibilitate crescută doar la doze mai mari (Fig. 8 D). De fapt, celulele ERCC1-KO complete și celulele R156W-KI au afișat doar o sensibilitate marginală la IR (Fig. S5 D), sugerând o contribuție minoră a ERCC{1-XPF la protejarea celulelor împotriva IR. O altă metodă de a evalua capacitatea de reparare a DSB este monitorizarea în timp a rezoluției focarelor H2AX induse de IR. Atât fibroblastele 48BR, cât și cele ale pacientului au prezentat o curățare normală a focarelor H2AX în 24 de ore după iradiere cu o doză fiziologică de 2 Gy (Fig. 8, E și F; și Fig. S5 E). Cu toate acestea, tratamentul celulelor 48BR cu inhibitor de protein kinază dependent de ADN (ADN-PK) a suprimat complet rezoluția focarelor H2AX la toate momentele analizate (Fig. 8, E și F). Aceste constatări sugerează că celulele PV46LD și PV50LD sunt pe deplin competente în repararea DSB sub sarcină scăzută de deteriorare.