O formulare micelară de quercetină previne nefrotoxicitatea cisplatinei

pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com

Alfredo G. Casanova, Marta Prieto, Clara I.Colino, & et al.

Flavonoidul antioxidantquercetinăs-a demonstrat că previnenefrotoxicitatepe modele animale și într-un studiu clinic și este astfel un candidat profilactic foarte promițător în curs de dezvoltare.Quercetinăsolubilitatea este foarte scăzută, ceea ce împiedică aplicarea clinică. Scopul acestei lucrări a fost de a studia, la șobolani, biodisponibilitatea și eficacitatea nefroprotectoare a unei formulări micelare de Pluronic F127-încapsulatquercetină(P-quercetină), cu hidrosolubilitate îmbunătățită. Administrarea intraperitoneală a P-quercetinăduce la creșterea concentrației plasmatice și a biodisponibilitățiiquercetinăcomparativ cu administrarea echimolară de naturalquercetină. Mai mult, P-quercetinăpăstrează proprietățile nefroprotectoare generale și chiar îmbunătățește ușor unii parametri ai funcției renale, în comparație cu cele naturale.quercetină. Mai exact, P-quercetinăa redus creșterea creatininei plasmatice (de la 3,4±0,5 la 1,2±{0,3 mg/dL) și a ureei (de la 49{0,9±43,8 la 184,1±). 50,1 mg/dL) și scăderea clearance-ului creatininei (de la {{2{0}},08±0,02 la 0,58±0,19 ml/min) indusă de medicamentul chimioterapeutic nefrotoxic cisplatină, și a ameliorat dovezile histologice ale leziunilor tubulare. Această nouă formulare cu proprietăți cinetice și biofarmaceutice îmbunătățite va permite explorarea în continuare aquercetinăca candidat nefroprotector la doze mai mici şi prin căi de administrare orientate spre utilizarea sa clinică.

Cuvinte cheie:cisplatină;nefrotoxicitate; flavonoid;quercetină; nefroprotecție; biodisponibilitate;rinichi;micele; solubilitate; formulare

Prevenireanefrotoxicitate

Faceți clic pe Cistanche para que sirve pentru boli de rinichi

1. Introducere

Medicamentnefrotoxicitateeste o preocupare medicală și economică serioasă [1,2], 25% dintre cele mai utilizate 100 de medicamente în unitățile de terapie intensivă fiind nefrotoxice [3] șinefrotoxicitateeste, de asemenea, o cauză importantă a căderii candidatului în timpul procesului de descoperire a medicamentului 4]. Cisplatina este un agent antitumoral pe bază de platină utilizat frecvent în tratamentul unei diversitate de neoplasme maligne solide [5,6]. Aproape 30% dintre pacienți prezintă dovezi denefrotoxicitateîn primele zece zile după administrarea cisplatinei, ceea ce reprezintă o limitare importantă a dozei și eficacității terapeutice a acesteia [5-8]. Cisplatină acutănefrotoxicitateprovoacă o tubulopatie derivată dintr-o acumulare de 5-fold în celulele epiteliale ale tubului proximal, în raport cu concentrația plasmatică a acestuia [9-1l], și într-o măsură mai mică în tubul distal [12,13] ].

Tubulopatia cu cisplatină prezintă tulburări electrolitice (în principal hipomagnezemie și hipokaliemie) șiacutrinichirănire(AKI). AKI este un sindrom comun caracterizat printr-o scădere bruscă a ratei de filtrare glomerulară (RFG), azotemie severă și, adesea, oligurie sau anurie [7,14]. În plus, disfuncția endotelială care crește rezistența vasculară renală și afectează autoreglarea contribuie, de asemenea, la AKI indusă de cisplatină[9]. În mod obișnuit, AKI este o afecțiune reversibilă, care totuși are un impact relevant asupra rezultatelor pacientului, inclusiv mortalitate crescută în spital (peste 50 la sută din cazuri în rândul persoanelor în stare critică), spitalizare prelungită, costuri suplimentare de îngrijire a sănătății și, la mijloc, și scenarii pe termen lung, risc crescut de dezvoltareboală cronică de rinichiși a morbimortalității generale și cardiovasculare [7,14]. La nivel subcelular și molecular, citotoxicitatea tubulară a cisplatinei este determinată de leziuni mitocondriale, care limitează respirația, produce stres oxidativ și induce moartea celulelor apoptotice și necrotice și un răspuns inflamator dăunător [13,15,16]. Stresul oxidativ este recunoscut ca un mecanism central al citotoxicității cisplatinei șinefrotoxicitate[12,13,15-17], care rezultă din producția crescută de specii reactive de oxigen și o barieră enzimatică antioxidantă slăbită [5,7,18].

Măsuri profilactice eficiente pentru cisplatinănefrotoxicitateprezintă o nevoie clinică nesatisfăcută de îmbunătățirea profilului farmaco-toxicologic și maximizarea utilității acestuia. Strategiile preventive existente, inclusiv hidratarea intensivă, au demonstrat doar o protecție limitată [6,19]. Sunt în curs de dezvoltare noi strategii bazate pe administrarea concomitentă de nefroprotector. Candidații nefroprotector includ formulări de magneziu |6,9 și, cel mai proeminent, o varietate de antioxidanți [6,20,21]. Flavonoidele sunt o familie de produse polifenolice nefroprotectoare derivate din legume, fructe, nuci și vin, cu proprietăți antioxidante puternice [22].Quercetinăeste un flavonoid caracteristic care exercită multe efecte benefice [23,24], inclusiv eliminarea speciilor reactive de oxigen, suprimarea activării trombocitelor, protecția endotelială, modularea inflamației, inhibarea apoptozei, suprimarea tumorii și nefroprotecția. Coadministrareaquercetinăalături de terapia cu cisplatină într-un model de tumoră animală oferă nefroprotecție fără a interfera cu efectul antitumoral |25,26]. De fapt, a fost identificată o meta-analiză actualizatăquercetinăca un candidat foarte promițător ca neuroprotector pentru dezvoltarea clinică ulterioară [21]. În mod constant, un studiu clinic recent a raportat un efect protector alquercetinăasupra nefropatiei induse de contrast (CIN) [27].

O limitare puternică la aplicarea potențială aquercetină(împărtășită de flavonoide în general) este hidrosolubilitatea sa scăzută care decurge din structura chimică și fragmentele sale, care îi reduc absorbția în intestinul subțire și, prin urmare, biodisponibilitatea și eficacitatea sa [23,24, 28]. Interesant este că glucoza lipofobă-quercetinăconjugatele (glucozidele) sunt substanțial mai biodisponibile decât agliconii lipofile, deoarece acestea din urmă sunt mai puțin solubile în lumenul intestinal [24]. De fapt,quercetinăglucozidele din ceapă prezintă cea mai mare rată de absorbție, iar grăsimea alimentară creștequercetinăabsorbția agliconului în intestinul subțire [29]. Hidrosolubilitatea foarte scăzută aquercetinănu numai că împiedică utilizarea sa clinică pe căi practice de administrare (adică, orală, intravasculară), dar limitează și cercetările preclinice. Cu toate acestea, în modelele animale, căile alternative (adică, intraperitoneală) cu suspensii de medicamente pot fi utilizate în scopuri de demonstrare a conceptului [25,26].

Quercetinăau fost dezvoltate formulări cu noi materiale purtătoare care poartă hidrosolubilitate îmbunătățită, ale căror proprietăți biomedicale trebuie testate. Poloxamerii pluronici sunt o clasă de materiale purtătoare care găzduiesc și îmbunătățesc absorbția compușilor insolubili în apă datorită capacității lor de a forma micelii în medii apoase [30]. Aici, am emis ipoteza că o formulare micelară dequercetinăîncapsulat cu Pluronic F127 descris anterior [31, ar păstra proprietățile nefroprotectoare ale naturale.quercetinăoferind în același timp caracteristici biofarmaceutice îmbunătățite pentru manipulare, formulare și administrare.

Împiedicanefrotoxicitate:quercetină

2. Rezultate

S-au realizat un studiu de biodisponibilitate și nefroprotecție cu noua formulare micelară aquercetinăîncapsulat cu Pluronic F127[31 și formula noastră tradițională de naturalquercetină|25,26|(vezi mai jos Materiale și Metode). În timp ce aceasta din urmă era o suspensie care conținea un tensoactiv, prima era o soluție salină fără aditivi suplimentari. Formula noastră tradițională de naturalquercetinăa fost adecvat doar pentru scopuri experimentale, a precipitat atunci când este lăsat nemișcat și a fost mai dificil de manipulat și injectat. În schimb, formula micelară s-a comportat ca o soluție și nu a prezentat inconveniente de utilizare.

2.1.Studiu de bioaodisponibilitate

Ca metodă de biodisponibilitate comparativă, evoluțiaquercetină(Q) concentrația plasmatică a fost studiată în urma unui singur bolus intraperitoneal de natural și P-quercetină(PQ). Figura 1 arată mediaquercetinăcurbele de nivel plasmatic obţinute după administrarea unei doze dequercetinăsau P-quercetină. Concentrațiile maxime de medicament (Cmax) observate în grupurile Q și PQ au fost 1,14±1,28 ug/mL și, respectiv, 8,90 ±4,62 ug/mL, adică o creștere de 7,8-ori pentru P-quercetină, indicând că formula micelară a crescut absorbția medicamentului.

Figura 1. Evoluția concentrației plasmatice a quercetinei după administrarea intraperitoneală a unui singur bolus de P-quercetină echimolară și quercetină naturală.

Valorile sunt exprimate ca medie ± eroarea standard a mediei (SEM) (n=5 per grup). *p<0.05;><0.01;><0.001 vs.qgroup.="">quercetină(50mg/kg, ip.);PQ:100mg/kg.pP-quercetină(conținând 50 mg/kgquercetină).

Tabelul 1. Parametrii farmacocinetici după administrarea intraperitoneală de P-quercetină și quercetină naturală (n=5 per grup).

Q:quercetin(50 mg/kg, ip; PQ: P-quercetină(100 mg/kg,ip).AUCo24:aria sub curba parțială; AUCo: aria sub curba totală; MRT: timpul mediu de rezidență;t1/2:timp de înjumătățire prin eliminare; X: panta fazei terminale.

Tabelul 1 prezintă parametrii farmacocinetici independenți de model aiquercetinăla șobolani în urma administrării unei singure doze în bolus de naturalquercetinăsau P-quercetină. Timpul până la Cmax a fost crescut de la 15 minute (pentru naturalquercetină) la 1 oră (pentru P quercetină). Această întârziere poate fi atribuită eliberării susținute aquercetinădin formula micelară. Expunerea generală a șobolanilor la flavonoid a fost semnificativ mai mare pentru P-quercetină, așa cum demonstrează aria mai mare sub curbă (AUC) care se traduce printr-o biodisponibilitate cu 302,5% mai mare. Aceste rezultate sugerează că solubilitatea mai mare a formulării micelare îmbunătățește absorbția acesteia.

2.2. Studiu de eficacitate a nefroprotecției 2.2.1. Stare fiziologică

După cum demonstrează evoluția greutății corporale (Figura 2a), sănătatea generală s-a deteriorat după tratamentul cu cisplatină, comparativ cu animalele martor. Nici firescquercetinănici P-quercetinăa modificat semnificativ efectul cisplatinei. Cu toate acestea, ambelequercetinătratamentele au împiedicat aproape complet creșterearinichiraportul/greutatea corporală indus de cisplatină (Figura 2b), un parametru despre care se știe că se corelează cu magnitudinea uzurii lanefrotoxicitate[32].

Figura 2. Evoluția stării generale de sănătate. (a) Variația procentuală a greutății corporale prin experiment; (b) Raportul rinichi/greutate corporală în ziua 9.

Valorile sunt exprimate ca medie ± SEM (n=3-5 per grup). *p<><0.01;><0.001vs.controlgroup.><0.05;><0.01 vs.="" cp="" group.cp:cisplatin(6.5="" mg/kg,="" i.p.)on="" day="">

CP plus Q:quercetină(50 mg/kg, ip) timp de 9 zile și cisplatină (6,5 mg/kg, ip) în ziua 3; CP plus PQ:P-quercetină(100 mg/kg, ip) timp de 9 zile și cisplatină (6,5 mg/kg, ip) în ziua 3.

2.2.2.Evaluarea funcției renale și a țesutului renal

Conform criteriilor internaționale, AKI este definită și diagnosticată în funcție de creșterile concentrației plasmatice a creatininei (Crp)[33-35], un marker surogat al ratei de filtrare glomerulară (RFG). Alți parametri, cum ar fi concentrația de uree în plasmă, sunt adesea evaluați ca indicatori de azotemie [36-38]. Creșterile Crp și ale ureei plasmatice sunt semne de reducere a RFG și AKI. În studiul nostru, funcția renală a fost grav afectată de cisplatină, iar acest efect a fost parțial ameliorat dequercetină. P-quercetinăa arătat o activitate ceva mai îndrăzneață decât a făcut-o naturalaquercetină, așa cum indică daune mai ușoare și un profil de recuperare îmbunătățit (Figura 3). Șobolanii din grupul cu cisplatină (CP) au suferit un AKI evident, deoarece au experimentat o creștere progresivă și semnificativă a nivelurilor plasmatice de creatinine și uree în comparație cu cele ale martorilor (Figura 3a, b). Acești parametri au crescut și în grupurile CP plus Q și CP plus PQ, dar într-o măsură semnificativ mai mică. Diferențele dintre grupurile CP plus Q și CP plus PQ nu au fost semnificative statistic, totuși, șobolanii tratați cu P-quercetinăau prezentat niveluri de creatinină și uree ușor mai scăzute decât cele tratate cu naturăquercetină. Clearance-ul creatininei (ClCr) este o metodă standard pentru măsurarea GFR ]39,40]. În acord cu datele Cr, cisplatin a indus o scădere profundă, care a fost parțial atenuată dequercetină(Figura 3c). În acest caz, totuși, a fost observată o diferență notabilă între P-quercetin și quercetina naturală, prima fiind semnificativ mai eficientă în îmbunătățirea și accelerarea recuperării. De notat, Clcr și Crpl se comportă într-o manieră invers proporțională, ceea ce este evident doar în starea de echilibru. În timpul AKI, cu toate acestea, funcția renală se schimbă continuu și rapid, rezultând o ușoară decuplare a acestei relații.

Figura 3. Evoluția parametrilor renali.

(a) Concentrația plasmatică a creatininei; (b) Concentrația plasmatică a ureei; (c) Clearance-ul creatininei; (d) Proteinurie; și (e)KIM-1 excreția urinară.

Valorile sunt exprimate ca medie±SEM(n=3-5 per grup). *p<><><0.001 vs=""><0.05;><0.01vs.cp group.cp:cisplatin(6.5="" mg/kg,i.p.)on="" day="">

CP plus Q:quercetină(50 mg/kg, ip) timp de 9 zile și cisplatină (6,5 mg/kg, ip) în ziua 3; CP plus PQ: P-quercetină(100 mg/kg, ip.) timp de 9 zile și cisplatină (6,5 mg/kg, ip) în ziua 3. KIM-1:rinichirăniremolecula 1.

Proteinuria este, de asemenea, frecvent măsurată în contextul patologiei renale. În funcție de modelul de afectare subiacent, proteinuria poate avea o origine glomerulară (adică, permeabilitate crescută a barierei de filtrare glomerulară) sau, ca și în cazul cisplatinei.nefrotoxicitate[13], poate apărea din reabsorbția tubulară defectuoasă din cauza leziunii tubulare. O creștere nesemnificativă a proteinuriei a fost detectată în grupele CP și CP-Q (deși mai puțin marcată în ultimul) în ziua 7, care a revenit la normal în ziua 9. În mod similar, excreția urinară a unui biomarker de afectare tubulară (adică,rinichirăniremolecula 1; KIM-1)[41,42]a fost crescut semnificativ de cisplatină, iar această creștere a fost atenuată de ambele forme dequercetină, deși P-quercetinăa fost din nou puțin mai eficient.

Studiul histologic al țesutului renal a fost congruent cu constatările biochimice. Specimenele de la șobolani tratați cu cisplatină au evidențiat necroză tubulară masivă în dunga superioară a medulului extern, însoțită de o anumită afecțiune corticală șiquercetinăleziuni corticale reduse (Figurile 4 și 5). Șobolanii care au primit doar agentul nefrotoxic au dezvoltat dilatare și obstrucție tubulară (văzută ca material hialin acumulat) și necroză tubulară cu deepitelizare și desprindere celulară. Ambiiquercetinătratamentele au redus în mod similar leziunile corticale induse de cisplatină, dar nu au avut niciun efect asupra leziunilor medulare (Figurile 4 și 5).

Figura 4. Imagini reprezentative ale specimenelor renale colorate cu hematoxilină și eozină.

Săgeți negre: necroză tubulară și desprindere celulară; săgeți albastre: dilatații tubulare; săgeți verzi: depozite intratubulare de material hialin. CP: cisplatină (6,5 mg/kg, ip) în ziua 3;

CP plus Q:quercetină(50 mg/kg, ip) timp de 9 zile și cisplatină (6,5 mg/kg, ip) în ziua 3; CP plus PQ: P-quercetină(100 mg/kg, ip) timp de 9 zile și cisplatină (6,5 mg/kg, ip) în ziua 3.

Figura 5. Cuantificarea afectarii renale.

Valorile sunt exprimate ca medie ± SEM (n =5 imagini × 3 șobolani per grup). * p<><0.001 vs.=""><0.05 vs.cp="">

CP: cisplatină (6,5 mg/kg, ip.) în ziua 3; CP plus Q:quercetină(50 mg/kg, ip pentru 9 zile și cisplatină (6,5 mg/kg, ip) în ziua 3; CP plus PQ: P-quercetină(100 mg/kg, ip) timp de 9 zile și cisplatină (6,5 mg/kg, ip) în ziua 3.AU: unități arbitrare.

3. Discuție

Rezultatele noastre arată că o formulare micelară dequercetinăcu Pluronic F127 (P-quercetină), având proprietăți biofarmaceutice îmbunătățite, a crescut biodisponibilitatea acestui flavonoid antioxidant și și-a păstrat (sau chiar și-a îmbunătățit ușor) proprietățile nefroprotectoare generale în comparație cu cele naturale.quercetină.

Quercetinăa fost postulat ca un candidat promițător pentru a proteja împotriva leziunilor renale cauzate de o serie de medicamente și toxine, inclusiv cisplatină [25,26], metotrexat [43,44], ciprofloxacin [45], NaF [46], HgCl [47l și cadmiu. [48]. Desi aceste studii au demonstrat eficacitatea preclinica,quercetinănu a fost testat în scenarii clinice similare din cauza impedimentelor de formulare și a biodisponibilității scăzute, cu excepția unui studiu clinic în carequercetinăa oferit o oarecare protecție împotriva CIN [27]. Ambele limitări sunt consecințele solubilității foarte slabe în apă (doar 0,01 mg/mL, la 25 de grade [49]) aquercetină, și a stabilității sale scăzute (care este afectată de temperatură, pH, hidroxilare, activitate enzimatică și ionii metalici)[28,29,50]. Administrat oralquercetinăse confruntă cu o degradare extinsă în timpul tranzitului stomacal din cauza pH-ului gastric foarte scăzut (adică, 1,5)[50]. În intestinul subțire, protejat chimic de un pH mai mare(7,5), restulquercetinăeste absorbit doar minim. Prin urmare, pentru a crește biodisponibilitatea și eficacitatea biologică, au fost dezvoltate noi formulări de quercetină cu scopul de a îmbunătăți hidrosolubilitatea acesteia, precum și de a proteja părțile sale active de degradare, inclusiv lipozomi, nanoparticule, nanoemulsii și micelii [28].

Formula noastră micelară cu Pluronic F127 creștequercetinăsolubilitatea de zece ori și, în studiile in vitro, a demonstrat un comportament de dizolvare mai bun în fluidele gastrice și intestinale simulate, deoarece realizează o reducere semnificativă a dimensiunii particulelor și o dispersie mai omogenă aquercetinăîn matricea polimericăI3l. Această formulă oferă o cantitate semnificativ crescută dequercetinăîn fluxul sanguin, rezultând o biodisponibilitate de 3-ori care, în mod ciudat, se traduce doar într-un efect nefroprotector ușor mai mare. De acord, nu am observat un efect nefroprotector suplimentar atunci când am folosit o doză mai mare (adică, 100 mg/kg) de natură.quercetinăîn experimentele anterioare (observațiile noastre nepublicate)[25,26]. În acele studii, interpretarea noastră a fost că, probabil, doze mai mari de ipquercetină(i.e., >50 mg/kg) nu s-a tradus într-o biodisponibilitate crescută datorită solubilității reduse, care nu a dus la o absorbție netă crescută semnificativ. Acest lucru a coincis cu depozitele galbene de neabsorbitequercetinăfiind găsită în cavitatea peritoneală la sacrificiu. În plus, rezultatele noastre prezente arată că și concentrațiile plasmatice mai mari de quercetină (cum ar fi cele obținute cu P-quercetin) se traduc doar într-un efect puțin mai mare. pentru căquercetinădistribuția a fost explicată într-o formă simplificată printr-un model de ordinul întâi, cu două compartimente [51], accesul la celulele țintă din compartimentul principal (adică, fluxul sanguin) pare să nu fie limitarea. Astfel, motivul pentru care efectul nefroprotector maxim este aproape atins cu concentrațiile plasmatice mai mici produse de quercetina naturală rămâne evaziv.

Acest lucru are implicații practice pentru dezvoltarea ulterioară aquercetinăca nefroprotector profilactic. În primul rând, aceste rezultate deschid posibilitatea de a studia dacă regimurile de doze mai mici vor fi la fel de eficiente, ca un exces amplu de biodisponibilitate a P-quercetinăpoate fi sacrificat fără a pierde efectul terapeutic dar va maximiza profilul de securitate. În al doilea rând, oportunitatea este acum deschisă pentru administrarea orală, care, totuși, trebuie testată pentru noua formulă. Absorbția din cavitatea peritoneală evită barierele întâlnite pe cale orală. Se presupune că solubilitatea mai mare în lumenul intestinal ar putea duce la o creștere și setarequercetinăbiodisponibilitate în fereastra terapeutică. În al treilea rând, calea intravenoasă ar putea fi acum o alternativă realistă cu toxicitate minimă, care ar evita barierele de absorbție. Până acum, formulările experimentale injectabile alequercetinăa folosit dimetil sulfoxid (DMSO) ca solvent [51].

Se știe că cisplatina se acumulează și lezează tubii proximali și distali și induce apoptoza și necroza celulelor epiteliale tubulare, în funcție de concentrație [16]. Segmentul S3 proximal este cel mai afectat, deși S1 și S2 sunt, de asemenea, din ce în ce mai deteriorate de doze mai mari. În acord cu proprietățile sale antiapoptotice cunoscute asupra celulelor tubulare [52,53],quercetinăreducerea deepitelizarii tubulare corticale. Efectul identic observat cu ambele formulări întărește ideea căquercetinăcinetica de distribuție larinichisunt saturate în studiul nostru. În plus, în cadrulrinichi, quercetinăprezintă un comportament diferit de-a lungul nefronului. De fapt,quercetinănu a avut efect asupra medulului extern, unde se găsește segmentul S3 al tubilor proximali.Quercetinăpare să se acumuleze în tubii S1, S2 sau distali, care sunt localizați aproape de cortex. Pentru că nu se știe cum (adică, ce transportatori sau căi de difuzie) și de unde (adică, partea luminală sau bazolaterală)quercetinăaccesează celulele tubulare, sunt necesare mai multe cercetări pentru a explica aceste efecte diferențiale.

Conservarea moderată a țesutului cortical poate explica doar parțial efectulquercetinăasupra funcției renale (adică RFG). O protecție suplimentară poate apărea din efectele vasculare alequercetină. Funcția endotelială participă la reglarea fluxului sanguin renal (RBF) și GFR prin modularea tonusului contractil al arteriolei aferente și eferente [54-57]. Cisplatina induce disfuncție endotelială și se crede că aceasta contribuie în mod substanțial la scăderea RFG, împreună cu vasoconstricția aferentă renală indusă de mecanismele de feedback tubuloglomerular (activate de afectarea tubulară) și de citokinele inflamatorii [13,58]. Într-adevăr, inversarea disfuncției endoteliale este un efect larg recunoscut alquercetină(și a flavonoidelor în general)[59-61l, ceea ce poate explica de cequercetinăîmbunătățește RBF (și, prin urmare, GFR), așa cum sa raportat anterior [25]. În plus, aceste efecte endoteliale-vasculare ar putea ajuta, de asemenea, să explice eficacitatea puțin mai mare a P-quercetinăla îmbunătățirea funcției renale și la refacerea funcției renale. Probabil că nu este nerezonabil să speculăm că o biodisponibilitate mai mare ar putea avea un efect mai îndrăzneț asupra ligheanului endotelial în contact direct cu sângele.

Unele dintre efectele observate după administrarea dequercetinăpoate fi exercitat de metaboliții săi.Quercetinăeste metabolizat în mucoasa intestinală și în ficat prin reacții de glucuronidare, sulfatare și metilare [62], cei mai abundenți metaboliți fiind metaboliții glucuronid din sânge [63]. Specific,quercetină-3-bO-glucuronidul (Q3GA), un metabolit plasmatic major, s-a dovedit că exercită efecte antiinflamatorii și vasculare, atât direct, cât și după metabolizare înapoi la forma agliconă [64]. Mai multe cercetări sunt necesare pentru a înțelege metaboliții specifici responsabili de neuroprotecție și producția și transformarea lor diferențială de la diferite site-uri de administrare la țintele lor finale.

În concluzie, acest studiu inițial arată potențialul terapeutic al P-quercetinăca o formulare îmbunătățită cu proprietăți biofarmaceutice și farmacocinetice îmbunătățite, utilă pentru dezvoltarea ulterioară și utilizarea clinică prospectivă în profilaxianefrotoxicitate.

Beneficiile quercetinei asupra nefrotoxicității

4. Materiale și Metode

Toate substanțele chimice și reactivii au fost achiziționate de la Merck (Darmstadt, Germania), cu excepția cazului în care se indică altfel.

4.1.Pregătirea formulării micelare (P-quercetină)si NaturalulQuercetinăFormulare

Quercetinăhidratul (puritate minimă de 95 la sută) a fost achiziționat de la Acros Organics (Madrid, Spania) și copolimerul bloc oxid de etilenă-oxid de propilenă Pluronic F127 (greutate moleculară medie 12,6 kDa, echilibru hidrofil-lipofil 22) a fost furnizat de BASF (Ludwigshafen am Rhein, Germania). Pentru formularea micelară, s-a folosit tehnica de precipitare supercritică antisolventquercetină/Pluronic F127 particule (P-quercetină) așa cum a fost descris anterior [31]. Pluronicul rezultatquercetinăformularea a avut o compoziție relativă de 50%/50% g/g Pluronic F127/quercetină. Pentru naturalquercetinăformulare,quercetinăa fost suspendat în 0,16% Tween 20 în soluție salină, așa cum s-a descris anterior [25,26].

4.2. Animalele și Bioetica

Toate procedurile au fost aprobate de Comitetul de Bioetică al Universității din Sala-manca și de Guvernul Regional Castilia și Leon, Ministerul Agriculturii și Creșterii (cod: 0000037, 27 iulie 2015). Animalele au fost manipulate în conformitate cu liniile directoare ale Directivei 2010/63/UE a Consiliului Comunității Europene și cu legislația spaniolă actuală pentru utilizarea și îngrijirea animalelor de experiment (RD53/2013, 01 februarie 2013). Șobolanii masculi Wis-tar (200-250 g) au fost ținuți în condiții de mediu controlate în cadrul unității pentru animalele Universității din Salamanca, cu acces gratuit la apă și mâncare standard.

4.3. Studiu de bioazailabilitate

Șobolanii au fost împărțiți în două grupuri experimentale: O (n{0}}), în care animalele au primit o singură doză p.p. dequercetină(50 mg/kg); și PQ(n=5), în care animalele au primit o singură doză ip echimolară de P-quercetină(100 mg/kg (adică, care conține 50 mg/kgquercetină). Ulterior, probele de sânge au fost prelevate în tuburi acoperite cu acid etilendiaminotetraacetic (EDTA), dintr-o mică incizie în vârful cozii, în următoarele momente:0.25,0.5,1,2,8, 12 și 24 h. Plasma a fost obținută prin centrifugare și 10μL de acid ascorbic 10 mM (pentru a evitaquercetinădegradare） a fost adăugată la 100 μL de plasmă și congelată la -80 grade până la analiza sa.Quercetinăconcentrațiile au fost determinate printr-o metodă de cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) cu fază inversă cu detecție UV. A fost utilizată o coloană C18 cu dimensiunea particulelor Prosper 3 um, cu o fază mobilă compusă din 28% acetonitril și 72% dintr-o soluție de apă cu acid ortofosforic 0,2%, la un debit de 1 ml/min. Lungimea de undă de detecție a fost de 371 nm. Înainte de injectarea în echipamentul de cromatografie, probele au fost supuse unui proces de glucuronidare pentru cuantificarea totală.quercetină. În acest scop, 1000 unități de -glucuronidază din Helix pomatia în tampon acetat 0,1 M (pH 5) au fost adăugate la 100 μL de plasmă, iar acest amestec a fost incubat la 37 de grade timp de 1 oră. . Apoi, a fost efectuat un proces de extracție cu 100 μL dintr-un amestec 0,5M80~20 acetonitril/acetic (de trei ori). Odată ce supernatantul a fost evaporat într-un curent de azot, reziduul uscat a fost re-dizolvat în faza mobilă de 40 μL și 20 μL au fost injectați în sistemul HPLC.

4.4. Studiu de nefroprotecție

Șobolanii au fost împărțiți în următoarele grupuri experimentale (Figura 6): Animalele de control (n=3) au primit vehicul (NaCl0,9 la sută) intraperitoneal (ip) timp de 9 zile; Animalele CP(n=5) au primit o singură doză nefrotoxică de cisplatină (6,5 mg/kg,ip) în ziua 3 a experimentului; animalele CP plus Q(n{=5) au primit o doză zilnică dequercetină(50 mg/kg, ip) timp de 9 zile și o singură doză de cisplatină (6,5 mg/kg, ip) în ziua 3; și animalele CP plus PQ (n=5) au primit o doză zilnică de P-quercetină(100 mg/kg, ip(adică, care conține 50 mg/kgquercetină)) timp de 9 zile și o doză de cisplatină (6,5 mg/kg, ip) în ziua 3.

Figura 6. Schema modelului de nefrotoxicitate.

CP: cisplatină (6,5 mg/kg, ip) în ziua 3; CP plus Q:quercetină(50 mg/kg, ip) timp de 9 zile și cisplatină (6,5 mg/kg, ip) în ziua 3; CP plus PQ:P-quercetină(100 mg/kg, ip.) timp de 9 zile și cisplatină (6,5 mg/kg, ip) în ziua 3.

Probele de sânge （150 μL） au fost colectate în zilele 0,3,5,7 și 9in capilare heparinizate dintr-o mică incizie în vârful cozii. Plasma a fost separată prin centrifugare (11.000 rpm timp de 3 min) și păstrată la -80C. În zilele 7 și 9, urina de 24 de ore a fost colectată în cuști metabolice, curățată prin centrifugare (2000 × g timp de 9 minute) și depozitată la grade -80 . La sfârșitul experimentului (ziua 9), șobolanii au fost anesteziați și au fost anesteziațirinichiau fost disecate, cântărite și fixate în paraformaldehidă 3,7% pentru studii histologice.

Creatinina plasmatică și urinară au fost măsurate utilizând un kit comercial bazat pe metoda Jaffe [65] (QuantiChrom Creatinine Assay Kit, BioAssay Systems, Hayward, CA, SUA). Ureea plasmatică a fost determinată folosind un kit comercial bazat pe metoda Jung [66] (Kit de testare a ureei Quan-tiChrom, BioAssay Systems, Hayward, CA, SUA). Clearance-ul creatininei (Clcr) a fost calculat folosind formula: Clcr=Crur × UF/ Crp); unde Crur corespunde concentrației urinare a creatininei, UF este fluxul de urină și Crp este concentrația plasmatică a creatininei. Proteinuria a fost măsurată cu testul Bradford [67]. KIM-1 a fost cuantificat folosind ȘobolanulRinichirănireKit de molecule 1(KIM-1)ELISA (Cusabio, Houston. TX, SUA). urmând instrucțiunile producătorului.

Pentru studii histologice, specimenele renale au fost încorporate în parafină și secțiuni de țesut de 5 um au fost colorate cu hematoxilină și eozină. Fotografiile au fost făcute la un microscop Olympus BX51 conectat la o cameră digitală color Olympus DP70 (Olympus, Madrid, Spania). Cuantificarea daunelor a fost efectuată într-o manieră oarbă, așa cum a fost descris anterior [68]. Pe scurt, au fost făcute cinci fotografii aleatorii ale regiunii corticale și cinci fotografii ale regiunii medulare externe (adică, zonele deteriorate de cisplatină), cartografiind uniform aceste zone. Fiecare imagine a fost împărțită în 10 secțiuni identice (folosind software-ul Microsoft Office PowerPoint 2016), fiecăreia i s-a atribuit un scor de 0 (fără deteriorare), 1 (prezența deteriorării în mai puțin de 1/3 din zonă), 2 (prezența deteriorării). între 1/3-2/3 din zonă) sau 3 (prezența daunelor în mai mult de 2/3 din zonă). Daunele au fost evaluate ținând cont de prezența necrozei tubulare și dezlănțuirea celulelor, dilatarea tubulară, vacuolizarea, prezența depozitelor hialine și pierderea marginii periei.

4.5.Analiza statistică

Datele sunt prezentate ca medie ± eroarea standard a mediei (SEM). Valorile aberante au fost identificate folosind testul Grubbs|69]. Distribuția normală a datelor a fost evaluată folosind testul Shapiro-Wilk. În studiul de biodisponibilitate, comparația dintre cele două grupuri a fost făcută folosind testul t Student sau testul U Mann-Whitney. Studiul farmacocinetic a fost realizat prin intermediul unei analize independente de model a nivelurilor plasmatice medii alequercetină. Parametrii estimați pentru a evalua biodisponibilitatea relativă aquercetinăau fost aria sub curba parțială a nivelurilor plasmatice (ASC)24, aria sub curba totală a nivelurilor plasmatice (ASC)0~, panta fazei terminale, timpul de înjumătățire al eliminării (ti/2) , și timpul mediu de rezidență (MRT). Estimarea parametrilor farmacocinetici a fost realizată prin combinarea metodei trapezoidale pentru estimarea ariei de sub curba parțială și a regresiei neliniare a fazei terminale a curbei nivelului plasmatic. Pentru studiul de nefroprotecție, a fost efectuată o analiză a varianței (ANOVA) cu testele Scheffe sau un test Kruskal-Wallis pentru comparații între grupuri. Analiza statistică a fost efectuată cu software-ul IBM SPSS Statistics 20.0 (International Business Machines, Armonk, NY, SUA). Microsoft Office Excel și PowerPoint 2016 (Microsoft, Redmond, WA, SUA) au fost folosite pentru a crea lucrările de artă și ilustrațiile.

Referințe

1. Awdishu, L.; Mehta, RLThe6R-urile induse de droguriNefrotoxicitate. BMCNephrol.2017,18,124. [CrossRefl[PubMed]

2. Perazella, MAD Consumul de droguri șiNefrotoxicitateîn Secția de Terapie Intensivă.RinichiInt.2012,81,1172-1178. [CrossRef] [PubMed]

3. Taber, SS; Mueller, BADDisfuncție renală asociată cu medicamente. Crit.Care Clin.2006,22,357-374, vi. [CrossRef] Huang, JX; Blaskovich, MA; Cooper, MACell și teste bazate pe biomarkeri pentru predicțieNefrotoxicitate.

Notă:cele de mai sus nu sunt o listă completă de referință