Relația dintre ciclo-oxigenază (COX-2) și boala indusă de hipoxie

pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com

Prostaglandina E2 intracelulară contribuie la moartea celulelor tubulare proximale induse de hipoxie

Coral Garcia-Pastorl, Selma Benito-Martinez, Ricardo J.Bosch1, Ana B. Fernandez-Martinez, Francisco J. Lucio-Cazana

Celulele tubulare proximale (PTC) sunt deosebit de vulnerabile la apoptoza indusă de hipoxie, un factor relevant pentruboală de rinichi. Am emis aici ipoteza că moartea PTC în hipoxie este mediată de producția dependentă de ciclo-oxigenază (COX-2) a prostaglandinei E,(PGE,), care a fost confirmată în celulele HK-2tubulare proximale umane din cauza hipoxiei. (1 la sută O,) apoptoza indusă (i) a fost prevenită de un COX-2(ciclo-inhibitor al oxigenazei) și de către antagoniștii receptorilor de prostaglandine (EP) și (ii) a fost asociată cu o creștere a PGE intracelulară,(iPGE,) datorită reglării transcripționale a COX{{3} dependente de factorul inductibil de hipoxie. }}(ciclo-oxigenaza). Apoptoza a fost, de asemenea, prevenită de inhibitori ai transportorului de captare a prostaglandinei PGT, care a indicat că iPGE, contribuie la apoptoza indusă de hipoxie (dimpoxie, moartea PTC indusă de hipoxie/reoxigenare s-a datorat exclusiv PGE extracelular). Astfel, iPGE este un nou actor în patogeneza leziunii tubulare induse de hipoxie și PGT ar putea fi o nouă țintă terapeutică pentru prevenirea leziunilor dependente de hipoxie în bolile renale.

Este bine stabilit că hipoxia tubulară este un factor relevant atât pentru acută, cât și pentru cronicăboală de rinichi'2 Celulele tubulare proximale (PTC) sunt foarte active în ceea ce privește consumul de oxigen datorită activităților lor de reabsorbție care necesită energie și, în consecință, sunt vulnerabile la hipoxie. S-a demonstrat că apoptoza joacă un rol relevant în PTC cultivat expus la hipoxie-, dar căile de semnalizare responsabile pentru activarea mașinii apoptotice nu au fost investigate. Noi și alții am descoperit că prostaglandina E, (PGE,), un mediator lipidic important al numeroaselor procese fiziologice și patologice înrinichi, joacă un rol relevant în semnalizarea care duce la apoptoza PTC la tratamentul cu cisplatin7, albumin8 sau leptin și gentamicin. În toate cazurile, s-a dovedit că creșterea PGE depinde de expresia îmbunătățită a ciclo-oxigenazei-2(COX-2)(ciclo-oxigenază), o enzimă inductibilă care, împreună cu COX-1l, este etapa de limitare a vitezei în sinteza prostaglandinelor. În umanrinichi, COX bazal-2(ciclo-oxigenază)expresia este mai puțin intensă decât cea a COX-1. COX-2(ciclo-oxigenază)a fost identificat în podocite și părți ale ansei Henle și a vascularizației renale în condiții fiziologice10. În stările patologice, totuși, imunoreactivitatea COX-2 poate fi găsită în mai multe tipuri de celule dinrinichiinclusiv PTC și, posibil, contribuie la leziuni renale. Interesant este că hipoxia crește expresia COX-2(ciclo-oxigenază)și/sau producerea de PGE,12-i7 în multe tipuri de celule. De fapt, am descoperit anterior că hipoxia îmbunătățește conținutul intracelular în PGE, precum și eliberarea acestuia în mediul extracelular8. Prin urmare, este teoretic posibil ca PGE să medieze efectul apoptotic al hipoxiei asupra PTC.

Cele mai multe studii privind apoptoza dependentă de PGE s-au concentrat în esență pe mecanismele care implică PGE extracelular, deoarece este larg acceptat că PGE își exercită efectele biologice prin activarea receptorilor PGE cuplati cu proteina G care se întinde pe membrana plasmatică (receptorii de prostaglandine din seria E). EP1-4)1. Cu toate acestea, în unele modele, PGE intracelular,(iPGE,) este relevantă în moartea celulelor apoptotice720-22. Acest lucru implică faptul că pentru a induce apoptoza, PGE trebuie să ajungă din nou în mediul intracelular și să activeze un subset de receptori EP, care sunt localizați în interiorul celulei (receptorii iEP). Deoarece sarcina de captare a PGE este realizată în principal de transportorul de absorbție a prostaglandinei (PGT)23-26, inhibarea PGT are ca rezultat prevenirea morții celulare apoptotice mediate de iPGE7.

Luând în considerare acest context, în lucrarea de față, am studiat dacă un COX-2(ciclo-oxigenază)-creșterea dependentă a iPGE, nivelurile mediază apoptoza indusă de hipoxie în PTC.

Faceți clic pentru Cistanche organic pentru boli de rinichi

Metode

Reactivi.

AG1478, Bromocresolgreen (BG), PGE, AH6809, GW627368X, cristal violet, soluții de albastru tripan, Bromosulfoftaleină (BRS), 3-(5'-Hidroximetil2'-furil)-1-benzil indazol (YC1), și actinomicina D au fost achiziționate de la Sigma (St. Louis, MO, SUA). Z-VAD-FMK și celecoxibul au fost de la Calbiochem (Darmstadt, Germania) și, respectiv, Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, SUA). TriReagent a fost achiziționat de la Vitro (Madrid, Spania), iar membranele PVDF și reactivul luminol Western blot au fost achiziționate de la Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA. SUA). Reactiv antidecolorare ProLong Gold cu 4,6-diamidino{{14 Kitul de detectare a apoptozei }}fenil indol (DAPI), anexin-V-FITC (izotiocianat de fluoresceină)/iodură de propidiu (PI) și sonda de diacetat de 2’,7’-diclorofluoresceină (DCFH-DA) au fost achiziționate de la Invitrogen (Carlsbad, CA, SUA), și Sondele Moleculare (Oregon, SUA), respectiv. Anticorpii au fost obținuți din următoarele surse: anti-PGE și anti-COX-2(ciclo-oxigenază)anticorpii au fost de la Abcam (Cambridge, Marea Britanie); anti-Bax și anti-Bcl-2 au fost de la Santa Cruz Technologies (Santa Cruz, CA.USA); anticorpul anti-HIF-la și -iepurele-Alexa-Fluor 488 au fost de la BD Biosciences (Palo Alto, CA, SUA) și respectiv Invitrogen (Carlsbad, CA, SUA); anti- -actină și conjugatul IgG peroxidază de iepure anti-șoarece a fost achiziționat de la Sigma (St.Louis, MO, SUA).

Cultura celulară și condiții experimentale.

Celulele HK-2 tubulare umane proximale au fost achiziționate de la American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, SUA). Celulele au fost menținute în 5% CO, la 37 de grade Cin DMEM/F12 suplimentat cu 10% fetale bovine. ser (FBS), 1% penicilină/streptomicina/amfotericină B și 1% glutamina (Invitrogen. Carlsbad, CA, SUA) și 1% insulină-transferină-seleniu (ThermoFisher. Grand Island, NY, SUA). În toate experimentele, celulele au fost placate la 70-90 procente de confluență și, atunci când s-au atașat complet, au fost cultivate în condiții hipoxice (1 la sută oxigen) sau normoxice (21 la sută oxigen).hipoxieexperimentele au fost efectuate într-un In vivo200hipoxiestație de lucru (Ruskin Technology, West Yorkshire, Regatul Unit). Pentruhipoxie/experimentele de reoxigenare, celulele au fost supusehipoxietimp de 24 de ore și, după aceea, celulele au fost incubate în condiții normoxice până la 3 ore (perioada de reoxigenare).

Analiza de imunofluorescență a iPGE și analiza Western blot a COX-2(ciclo-oxigenază)și HIF-1 .

Celulele pentru analiza imunofluorescenței și analiza Western blot au fost, respectiv, împărțite pe lame de sticlă (4 x 104 celule/lama de sticlă) sau în plăci cu șase godeuri (15 x 104 celule/godeu) și incubate așa cum este descris în „Rezultate”. Apoi, imunofluorescența și analiza imunoblotting au fost efectuate în esență așa cum s-a descris anterior. Diluțiile de lucru cu anticorpi au fost: 1/50 pentru PGE, 1/1000 pentru COX-2(ciclo-oxigenază)/HIF-1a/a-rabbit-Alexa-Fluor 568 și 1/5000 pentru -actină. Detectarea imunofluorescenței a fost efectuată utilizând un microscop confocal Leica SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Germania), prin Serviciul de microscopie confocală (ICTS 'NANBIOSIS'U17) al Centrului de Rețea de Cercetare Biomedicală pentru Bioinginerie, Biomateriale și Nanomedicină (CIBER-BBN la Universitatea din Alcal, Madrid, Spania)

Transfecția tranzitorie.

Transfecția tranzitorie cu siRNA PGT (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), vectorul de expresie de mamifer pcDNA3 care conține cADN al 15-hidroxi-prostaglandin dehidrogenazei umane de tip sălbatic (p15-PGDH) sau Construcții de plasmidă reporter de luciferază pentru COX umană-2(ciclo-oxigenază)PHP2-Luc, omhipoxieelementul de răspuns (HRE)p9HIF1-Luc și R. reniformis pRL-CMV (Promega, Madison, WI) și determinarea activității luciferazei au fost efectuate așa cum este descris în altă parte27,28.

Numărul de celule și morfologia celulei/nucleului.

Numărul de celule aderente a fost determinat spectrofotometric cu o metodă de colorare cu violet cristal modificat2. Pentru a detecta dovezi de apoptoză, morfologia celulară a fost observată folosind microscopie cu contrast de fază. Nucleii celulari au fost vizualizați după colorarea ADN-ului cu DAPI așa cum s-a descris anterior0. Morfologia apoptotică tipică care a fost examinată a inclus contracția celulară, condensarea și fragmentarea nucleară și formarea corpurilor apoptotice. Pentru cuantificare, șase câmpuri au fost examinate în fiecare condiție experimentală într-o manieră oarbă pentru a estima procentul de nuclee cu aspect asemănător apoptozei.

Testul de apoptoză prin citometrie în flux și analiza viabilității celulare prin testul de excludere a colorantului cu albastru tripan.

Celulele aderente la placă au fost detașate prin tripsinizare și, împreună cu celulele detașate recuperate anterior din mediul de cultură, au fost utilizate pentru analiză.

Kitul de detectare a apoptozei Annexin-V-FITC/PI a permis detectarea prin citometrie în flux a celulelor HK-2 apoptotice și necrotice, așa cum s-a descris anterior7. Celulele apoptotice timpurii și, respectiv, târzii au fost pozitive la colorarea anexinei V și a ambelor și anexinei V. colorarea. Celulele necrotice au fost pozitive doar pentru PI, iar celulele HK-2 vii nu au prezentat nicio colorare.

Testul de excludere a colorantului albastru tripan a fost utilizat pentru a evalua viabilitatea celulară. Celulele viabile (albe) și celulele moarte (albastre) au fost numărate folosind un microscop cu lumină și un hemocitometru.

Analize statistice.

Fiecare experiment a fost repetat de cel puțin trei ori. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SEM. Au fost supuși unei analize unidirecționale a varianței (ANOVA), urmată de testul lui Bonferroni pentru comparații multiple. Nivelul de semnificație a fost stabilit la P Mai mic sau egal cu 0,05.

Rezultate

Hipoxia induce moartea celulelor HK-2 tubulare proximale.

hipoxiea redus numărul de celule HK-2, așa cum a fost evaluat prin testul cristal violet (Fig. la), și a indus, de asemenea, rotunjirea și detașarea celulelor de pe placă (Fig. lb, panoul superior). Cum era de așteptat,hipoxiea declanșat un model de moarte celulară cu caracteristici morfologice clare ale apoptozei (vezi colorarea nucleară cu DAPI în Fig. lb, panoul inferior, stânga) cum ar fi contracția celulară cu condensare nucleară semnificativă, fragmentare și formare de corpuri asemănătoare apoptotice.hipoxie-apoptoza indusă a fost confirmată în continuare prin creșterea colorării anexinei V-FITC, așa cum a fost evaluată prin citometrie în flux, și prevenirea acesteia cu inhibitorul de pan-caspază Z-VAD-FMK (Fig. lc).hipoxiea determinat, de asemenea, o scădere a numărului de celule viabile, dar nu a indus modificări semnificative statistic ale numărului de celule necrotice (Fig. lc, insert).

Figura 1. Hipoxia induce moartea celulelor HK-2 tubulare proximale.(a) Diminuarea numărului de celule (test cu cristal violet). (b) Caracteristicile morfologice ale apoptozei. Fotomicrografii reprezentative cu contrast de fază (panoul superior, mărire originală, 10×) Fotomicrografii cu colorare DAPI (panoul inferior, mărire originală, 40×). (c) Creșterea apoptozei (studii de citometrie în flux). Celulele anexine V plus cuprind celule anexine V plus/iodură de propidiu (adică celule apoptotice timpurii cu integritatea membranei plasmatice păstrate) și celule anexine V plus/iodură de propidiu plus (adică celule apoptotice tardive). Inset: Tipuri de populații celulare (anexina V-/ iodura de propidiu plus celulele sunt celule necrotice și anexina V-/ iodura de propidiu- sunt celule vii). Rezultatele sunt exprimate ca procente în raport cu numărul total de evenimente. Informații generale: (1) Celulele au fost incubate timp de 24 de ore în condiții normoxice (21% O2) sau hipoxice (1% O), așa cum este indicat în „Metode?. inhibitorul de pan-caspază Z-VAD-FMK (25 μM) a fost adăugat cu 1 oră înainte de a începe expunerea lahipoxie. (2) Microfotografiile sunt exemple reprezentative pentru trei experimente independente. Bare și bare de eroare în grafice: fiecare bară reprezintă media ± SEM a 3 experimente diferite *P<0.01 vs.=""><0.01 vs="">hipoxie;**P<0.01 vs.="" normoxia="" and="">hipoxieplus ZVAD.

COX-2(ciclo-oxigenază)Calea receptorului /iPGE,/EP mediază moartea celulelor HK-2 tubulare proximale induse de hipoxie.

Pentru a evalua rolul COX-2(ciclo-oxigenază)calea receptorului /iPGE2/EP înhipoxiemoartea celulelor HK-2 indusă, am preincubat mai întâi celulele cu celecoxib, un COX-2(ciclo-oxigenază)inhibitor1; AH6809, un antagonist al receptorilor EP1, EP2 şi EP3 sau GW627368X, un antagonist al receptorului EP433; sau cu verde de bromocrezol sau bromosul-foftal în ambii inhibitori ai PGT435. PGT a fost de asemenea doborât prin transfecție cu siARN.

Figura 2. COX-2(ciclo-oxigenază)Calea receptorului /iPGE,/EP mediază moartea celulelor HK-2 tubulare proximale induse de hipoxie.(a) Prevenirea morții celulare prin inhibitori ai căii. Panoul superior; Barele arată procentul de moarte celulară totală (stânga) sau procentul de anexină V apoptotică plus celule (dreapta). Înainte de a fi expus lahipoxie, celulele au fost pre-incubate timp de 1 oră cu celecoxib 3 μM (COX-2(ciclo-oxigenază)inhibitor）;10 uM AH6809, (antagonist al receptorilor EP1-3), 10 uM GW627368X (antagonist al receptorului EP4); sau cu 50 μM verde de bromocrezol (BG) sau 25 μM bromosulfoftaleină (BrS), doi inhibitori PGT. Panoul inferior: Stânga: Prevenirea morții celulare prin doborârea PGT prin transfecție cu siARN (testul de excludere a scufundarii cu albastru tripan). Inset: Eficacitatea reducerii PGT (analiza Western blot) Dreapta: Dependența de concentrație a efectului preventiv al verdelui de bromocrezol (BG). (b) Prevenirea morții celulare prin transfecție cu un vector de expresie de mamifer care conține enzima de inactivare a prostaglandinei 15-hidroxi-prostaglandin dehidrogenază ({15-PGDH) cADN (testul de excludere a colorantului cu albastru tripan). 11}}PGDH (analiza Western blot) în celulele transfectate. (c)hipoxieinduce o creștere sensibilă la PGT a iPGE, Stânga: PGE, imunofluorescența dependentă singură sau combinată cu colorarea nucleară cu DAPI este prezentată (mărire originală, 40 ×) Dreapta: Abordare cantitativă a imaginilor prezentate în panoul din stânga folosind software-ul Image J. (d) Inhibitorul activării EGFR AG1478 nu previne moartea celulelor HK-2 EGFR. Celulele au fost pre-incubate timp de 1 oră cu 1 μM AG1478 înainte de a fi supuse lahipoxie. （e） Inhibitorul PGT BG nu modifică expresia Bax și Bcl-2 în celulele HK-2 subhipoxie(Analiza Western blot). (f)Prevenireahipoxie/moartea celulară indusă de reoxigenare de către inhibitorii căii (testul de excludere a colorantului albastru tripan). Celulele au fost pre-incubate cu inhibitori ai căii și supusehipoxieca în (a). Apoi, celulele au fost expuse la normoxie timp de 3 ore. Informații generale: (1) Celulele au fost incubate timp de 24 de ore în condiții normoxice (21% O,) sau hipoxice (1% O,), așa cum este indicat în „Metode”. (2) Microfotografiile sunt exemple reprezentative pentru trei experimente independente. (3) Solvenții inhibitorilor (mediu luL/mL) nu au modificat efectulhipoxiela moartea celulei (rezultatele nu sunt afișate). (4) Analiza Western blot: proteina egală a fost confirmată prin sondarea cu o anti- -actină sau un anticorp anti-GAPDH. (5) Bare și bară de eroare în grafice: fiecare bară reprezintă media ± SEM a 3 experimente diferite.*P<0.01><0.01>hipoxiesauhipoxie/reoxigenare.

După cum se arată în Fig. 2a,hipoxie-moartea celulelor tubulare proximale induse a fost prevenită în toate cazurile. Inhibarea apoptozei de către celecoxib a indicat că COX-2(ciclo-oxigenază)joacă un rol relevant înhipoxie-moartea celulară apoptotică indusă (Fig. 2a, panoul superior, dreapta). Mai precis, faptul că apoptoza a fost prevenită prin antagonismul receptorilor EP arată că apoptoza este mediată de COX-2(ciclo-oxigenază)-producția dependentă de PGE. Pe de altă parte, este cel mai probabil ca iPGE, să contribuie lahipoxie-a indus moartea celulelor HK-2 deoarece a fost prevenită prin; (i) inhibarea PGT (Fig.2a) sau (i) supraexpresia 15-PGDH (Fig. 2b), care inactivează iPGE2 prin intermediul acestuia oxidare25 (de remarcat, procedura de transfecție în sine a crescut sensibilitatea celulelor HK-2 lahipoxie: moartea celulară a fost de 45-55 procente pentru transfecție în condițiile de control, comparativ cu 15-20 procente în celulele netransfectate). Sprijin suplimentar la contribuția iPGE, lahipoxiemoartea celulelor HK-2 indusă, sunt descoperirile noastre anterioare căhipoxiedetermină o creștere a conținutului de celule al iPGE1 și că această creștere a fost prevenită de inhibitorii PGT (Fig. 2c).

Căile de semnalizare MAPK pot induce apoptoza, deoarece receptorii iEP transactivează receptorul factorului de creștere epidermic (EGFR)36, ceea ce duce la activarea kinazelor MAP ERK1/2 și p38 în celulele HK-20, am întrebat dacă pre -incubarea celulelor HK-2 cu inhibitorul activării EGFR AG1478 a prevenithipoxie-moartea celulară indusă. Am găsit rezultate negative (Fig. 2d) și, prin urmare, este puțin probabil ca transactivarea EGFR să medieze moartea celulelor HK-2 subhipoxie.

În mai multe modele experimentale, reducerea ATP-ului derivat mitocondrial în timpulhipoxiedetermină o creștere a raportului de expresie dintre proteina pro-apoptotică Bax și proteina anti-apoptotică Bcl-2, ceea ce duce la eliberarea citocromului C în citosol, la activarea caspazei 9 și la scindarea și activarea ulterioară a efectorului din aval. caspaze37,38. Cu toate acestea, pre-incubarea cu inhibitor PGT BG în celulele HK-2 subhipoxienu a dus la modificări compatibile cu o schimbare anti-apoptotică a echilibrului dintre expresia Bc-2 și Bax (Fig.2e), care nu susține rolul acestor proteine ​​în celula HK-2 moarte subhipoxie.

În urma expunerii hipoxice, episoadele de reoxigenare (leziune de ischemie/reperfuzie) pot induce deteriorarea suplimentară a celulelor. „Paradoxul” leziunii de reoxigenare poate fi înțeles luând în considerare faptul că celulele suferă modificări specifice în activitățile enzimatice, funcția mitocondrială, structura citoscheletică, transportul membranar și apărarea antioxidantă ca răspuns lahipoxie, care apoi predispun colectiv la leziuni de reoxigenare39. Reoxigenarea contribuie la afectarea acută a rinichilor în timpul accidentului vascular cerebral ischemic, transplantului de rinichi, insuficienței circulatorii sau intervenției chirurgicale renale și cardiovasculare. În acest context, valoarea potențială terapeutică a inhibăriihipoxie/moartea celulelor tubulare proximale induse de reoxigenare prin intervenție în COX-2(ciclo-oxigenază)calea receptorului /iPGE,/iEP este evidentă. Prin urmare, am întrebat dacă iPGE mediază în mod specifichipoxie-moartea celulară indusă sau de asemenea mediazăhipoxie/moartea celulară indusă de reoxigenare (un model in vitro care imită in vivo ischemia renală/leziunea de reperfuzie). După cum se arată în Fig.2f, moartea celulară (așa cum a fost evaluată prin testul de excludere a scufundarii cu albastru tripan) a fost prevenită de COX-2(ciclo-oxigenază)inhibitor celecoxib, precum și de către antagoniştii receptorului EP AH6809 sau GW627368X. La fel ca și pentru Fig.2a, aceste rezultate sugerează că COX-2 joacă un rol relevant înhipoxiemoartea celulară indusă de /reoxigenare și, mai precis, că moartea celulară este mediată de COX-2(ciclo-oxigenază)-producerea dependentă de PGE, deoarece a fost prevenită prin antagonismul receptorilor EP. Cu toate acestea, deoarece moartea celulară nu a fost prevenită de inhibitorii PGT verde de bromocrezol sau bro-mosulfoftaleină (Fig. 2f și Figura suplimentară 2d), este mai probabil cahipoxieMoartea celulelor HK-2 indusă de /reoxigenare este mediată exclusiv de PGE extracelular.

Reglarea transcripțională dependentă de HIF-1 -COX-2(ciclo-oxigenază)expresia genelor contribuie la ahipoxie-creșterea indusă a iPGE, în celulele HK-2 tubulare proximale. PGE, biosinteza implică eliberarea din glicerofosfolipidele membranei a acidului arahidonic de către fosfolipaza A, urmată de conversia de către izoenzimele COX a acidului arahidonic în prostaglandina H și, în final, prin izomerizarea glandei prostată în H, în PGE, prin sintezele de prostaglandine E. cum ar fi PGE sintaza microzomală-1 (mPGES-1)19. Am constatat căhipoxieapoptoza indusă în celulele HK-2 este cel mai probabil mediată de o COX-2(ciclo-oxigenază)-creșterea dependentă a producției de PGE,(Fig.2). Având în vedere că COX-2(ciclo-oxigenază)este o enzimă a cărei expresie poate fi indusă dehipoxie, am emis ipoteza că ahipoxie-creșterea indusă a PGE, producția în celule HK-2 ar putea fi consecința unei creșteri a exprimării COX-2(ciclo-oxigenază). Pentru a ne confirma ipoteza, am studiat (i) efectulhipoxieasupra expresiei COX-2(ciclo-oxigenază)proteine ​​și ARNm și (ii) efectul COX-2(ciclo-oxigenază)inhibitor celecoxib pehipoxie-creșterea indusă a iPGE, rezultatele noastre au indicat căhipoxiedeterminată într-o manieră tranzitorie, reglarea în sus transcripțională a COX-2(ciclo-oxigenază)expresia (Fig. 3a,b) și acel COX-2(ciclo-oxigenază)inhibarea a redus creșterea iPGE, în celulele HK-2 subhipoxie(Fig.3c). Interesant,hipoxiea determinat, de asemenea, o reglare în sus tranzitorie a expresiei proteinei mPGES-1 (Fig, 3a, insert), dar nu a afectat expresia mPGES-1 ARNm (Fig, 3b. insert). Aceste rezultate au indicat că expresia crescută a COX-2(ciclo-oxigenază)iar mPGES-1 este responsabil pentruhipoxie-creșterea indusă a iPGE.

Figura 3. Reglarea transcripțională dependentă de HIF-la a COX-2(ciclo-oxigenază)expresia genei contribuie la creșterea iPGE indusă de hipoxie, în celulele HK-2 tubulare proximale.(a)Expresia COX-2(ciclo-oxigenază)proteina este crescută tranzitoriu cuhipoxie(Analiza Western blot). Inset: proteina expresiei mPGES-1 este, de asemenea, reglată tranzitoriu de cătrehipoxie. (b)Expresia COX-2(ciclo-oxigenază)ARNm este crescut tranzitoriu cuhipoxie. Inset: expresia mPGES-1 ARNm nu este afectată dehipoxie. (c)Prevenirea prin celecoxib, un COX-2(ciclo-oxigenază)inhibitor, al creșterii iPGE, indus dehipoxie. Celulele au fost preincubate timp de 1 oră cu celecoxib 3 μM. Este prezentată imunofluorescența dependentă de Left∶PGE, singură sau combinată cu colorarea nucleară cu DAPI (mărire originală, 40×). Dreapta: Abordare cantitativă a imaginilor prezentate în panoul din stânga folosind software-ul Image J. (d) Contribuția mecanismelor transcripționale. Stânga: Inhibitorul transcripțional actinomicina D (Act. D) previne ahipoxie-creștere indusă a COX-2(ciclo-oxigenază)expresia proteinei (analiza Western blot). Celulele au fost pre-tratate timp de 1 h cu 1 ug/ml Act. D înainte de a fi expus lahipoxietimp de 3 ore. Dreapta: creșterea activității unui COX-2(ciclo-oxigenază)constructul reporterului. (e) Inhibitorul HIF-la YC-1 previnehipoxieCOX transcripțional indus-2(ciclo-oxigenază)suprareglementare. Celulele au fost preincubate timp de 1 oră cu 0,5 uM YC-1. Stânga: prevenirea COX-2(ciclo-oxigenază)suprareglementare. Celulele au fost expuse lahipoxietimp de 8 ore. Centru: prevenirea creșterii activității unui COX-2(ciclo-oxigenază)constructul reporterului. Dreapta: Inhibarea activității unui construct de reporter condus de HRE. Celulele au fost expuse lahipoxietimp de 8 h. (f) inhibitorul HIF-la YC-1 crește moartea celulelor apoptotice (studii de citometrie în flux). Înainte de a fi expus lahipoxie, celulele au fost pre-incubate timp de 1 oră cu 0.5 μM YC-1. Inset∶ YC-1 inhibăhipoxie-creșterea indusă a expresiei HIF-1a (analiza Western blot). Informații generale: (1) Celulele au fost incubate timp de 24 de ore în condiții normoxice (21% O,) sau hipoxice (1% O,), așa cum este indicat în „Metode”. (2) Microfotografiile sunt exemple reprezentative pentru trei experimente independente. (3) Analiza Western blot: proteina egală a fost confirmată prin sondarea cu un anticorp anti- -actină (4) Bare și bare de eroare în grafice: fiecare bară reprezintă media±SEM a 3 experimente diferite *P<0.01 vs.="" other="">

Pentru a examina în continuare contribuția mecanismelor transcripționale la creșterea COX-2(ciclo-oxigenază)expresia proteinei subhipoxie, expresia COX-2(ciclo-oxigenază)a fost evaluat în celule HK-2, care au fost pre-incubate cu inhibitorul de transcripție actinomicina D înainte de a fi supuse lahipoxietimp de 5 ore. După cum se arată în Fig.3d,hipoxie-creștere indusă a COX-2(ciclo-oxigenază)expresia proteinei a fost prevenită de actinomicina D. În plus,hipoxiea determinat, de asemenea, o creștere a activității unui COX-2(ciclo-oxigenază)constructul promotor transfectat anterior în celule HK-2 (Fig. 3d dreapta). Luate împreună, rezultatele prezentate în Fig. 3d sugerează că mecanismele transcripționale contribuie la ahipoxie-creștere indusă a COX-2(ciclo-oxigenază)expresia proteinelor. Cu toate acestea, a existat o discrepanță între momentul activării promotorului COX-2 și momentul COX maxim-2(ciclo-oxigenază)Expresia ARNm: în timp ce creșterea tranzitorie a COX-2(ciclo-oxigenază)Expresia ARNm a fost maximă după 2 ore (Fig.3b), promotorul COX-2 a fost activat după 3 ore (Fig.3d), ceea ce reflectă probabil contribuția mecanismelor post-transcripționale la creșterea COX{{6} }}(ciclo-oxigenază)expresie4. În consecință, speculăm că COX-2(ciclo-oxigenază)ARNm este stabilizat subhipoxie, ceea ce ar duce la niveluri crescute de COX-2(ciclo-oxigenază)Expresia ARNm fără nicio contribuție (în acel moment) de activitate crescută a COX-2(ciclo-oxigenază)promotor. Cu toate acestea, este, de asemenea, posibil ca un decalaj de timp între activarea promotorului și acumularea de substrat măsurabil să contribuie, de asemenea, la discrepanța dintre momentul activării promotorului COX-2 și momentul COX{{1 maximal. }}(ciclo-oxigenază)expresia ARNm.

HIF-1 este un factor de transcripție heterodimeric compus din subunitatea -dependentă de oxigen și subunitatea -exprimată constitutiv. Subhipoxie, HIF-l se acumulează și intră în nucleu, unde generează factorul de transcripție HIF-1 după dimerizarea cu HIF-1 . HIF-1 promovează apoi expresia genelor țintă prin legarea dehipoxie-elementele de răspuns (HRE) prezente în regiunea lor de reglementare și, ulterior, orchestrează răspunsurile adaptive celulare la luptăhipoxie 3. Dat fiindhipoxiepoate activa COX-2(ciclo-oxigenază)expresia într-un mod dependent de HIF-1- printr-un HRE funcțional prezent în secvența promotor COX-22, am examinat rolul HIF-l într-ohipoxie-creștere indusă a COX-2(ciclo-oxigenază)expresie. Am analizat, de asemenea, activitatea unui construct promotor COX-2 transfectat în celule HK-2. După cum se arată în Fig. 3e, pre-incubarea cu HIF-1un inhibitor YC{-1, care a tocithipoxie-creșterea indusă a expresiei HIF-la și a activității unui construct reporter HRE, a dus la prevenirea creșterii ambelor expresii a COX-2(ciclo-oxigenază)și activitatea COX-2(ciclo-oxigenază)constructul promotor în HK-2 supushipoxie. În rezumat, rezultatele sunt prezentate în Fig, 3a-e susțin ideea că regularea transcripțională a COX-2 dependentă de HIF-1 -(ciclo-oxigenază)este responsabil pentruhipoxie-creşterea indusă a iPGE2.

Deși consecințele activării HIF-1a onhipoxie-apoptoza indusă sunt controversate (probabil pentru că pot fi dependente de context), am analizat (într-o manieră preliminară) rolul HIF-1a în sistemul nostru experimental. Deoarece am găsit anterior acea intervenție în COX-2(ciclo-oxigenază)/iPGE, calea receptorului EP inhibă creșterea expresiei HIF-la declanșată dehipoxie8,56 am întrebat dacă inhibarea HIF-la are ca rezultat prevenireahipoxieapoptoza celulelor HK-2 indusă. După cum se arată în Fig. 3f, pre-incubarea cu YC-1, un inhibitor HIF-l, a crescut de fapthipoxie-apoptoza indusa. Prin urmare, este puțin probabil ca HlF-la

Discuţie

Țesuthipoxieeste considerat a fi relevant critic în patofiziologia atât a bolii renale cronice, cât și a leziunii renale acute, fiind PTC cea mai susceptibilă porțiune a tubilor renali împotrivahipoxie. Aici am examinat rolul PGE, în prejudiciul cauzat dehipoxiela PTC uman și a constatat că producția crescută de iPGE provine din reglarea în sus a COX dependentă de HIF-la-2(ciclo-oxigenază)expresia genelor și expresia crescută a mPGES-1, contribuie lahipoxie-moartea celulară apoptotică indusă în celulele HK-2. Având în vedere că hipoxia tubulară este un factor relevant atât pentru boala renală acută, cât și pentru cea cronică-2, aceste rezultate indică transportorul de prostaglandine PGT ca o nouă țintă terapeutică în bolile renale.

hipoxienu numai că crește iPGE, ci și eliberarea acestuia în mediul extracelular8, astfel încât PGE secretat (extracelular) ar putea juca, de asemenea, un rol înhipoxie-apoptoză indusă (de exemplu, declanșarea cascadelor apoptotice prin activarea canonică a receptorilor EP localizați la nivelul membranei celulare). Două studii anterioare au arătat că moartea celulară subhipoxies-a datorat și COX-2(ciclo-oxigenază)-productie dependenta de PGE,1345. Pe de altă parte, în anumite tipuri de celule (fibroblaste, microglia, neuroni și linii celulare de leucemie limfoblastică acută), apoptoza indusă de PGE este mediată de activarea dependentă de PGE a receptorilor EP46-48. Am găsit aici căhipoxieapoptoza celulelor HK-2 indusă a fost prevenită și prin antagonismul receptorilor EP (Fig.2a, panoul superior, dreapta). Dar, deoarece receptorii EP au fost descriși în mod clasic ca receptori de membrană plasmatică, astfel încât să fie inaccesibili pentru iPGE2-, speculăm că receptorii EP care mediază efectul apoptotic al iPGE, în celulele HK-2 hipoxice sunt un subgrup localizat intracelular (adică receptorii iEP).

Spre deosebire de rolul iPGE2 înhipoxie-apoptoza indusă în celulele HK-2, am descoperit că numai PGE extracelular mediazăhipoxieMoartea celulelor HK-2 indusă de /reoxigenare deoarece nu a fost prevenită de inhibitorii PGT (Fig. 2f). Deşi mecanismele patologice ale leziunii celulare dupăhipoxie/reoxigenarea nu sunt pe deplin înțelese, este acceptat că moartea celulară are loc în mare parte prin producerea de specii reactive de oxigen excesive (ROS). Acest lucru este valabil mai ales pentru celulele HK-249,50. Cu toate acestea, deșihipoxiepoate crește, de asemenea, producția de ROS, din câte cunoștințele noastre nu există dovezi că ROS joacă un rol relevanthipoxiemoartea celulelor HK-2 indusă. Acest lucru sugerează că efectele letale ale hipoxiei și hipoxiei/reoxigenării în celulele HK-2 sunt mediate de mecanisme diferite, ceea ce ar putea explica de ce BG și BS sunt de protecție împotrivahipoxiedar nu împotrivahipoxie/reoxigenare. În consecință, inhibarea PGT ar putea oferi beneficii terapeutice în PTC împotriva leziunii celulare induse de hipoxie, dar nu împotriva efectului dăunător alhipoxie/reoxigenare.

Reglementarea COX dependentă de HIF-1 -cox-2(ciclo-oxigenază)a fost un eveniment critic pentruhipoxieapoptoza celulelor HK-2 indusă (Fig.3e). Cu toate acestea, observația noastră conform căreia inhibitorul HIF YC-1 a îmbunătățit moartea celulelor apoptotice (Fig.3f) este surprinzătoare, deși rapoartele anterioare au arătat deja rezultate similare1. O posibilă explicație este un scenariu ipotetic în care HIF-la nu mediază doar reglarea pro-apoptotică a COX-2(ciclo-oxigenază)dar şi reglarea în sus a moleculelor protectoare. Într-adevăr, HIF-1-a reglementat expresia moleculelor protectoare împotrivahipoxiecum ar fi ARN lung necodificator DARS-AS1 și microARN-2103 au fost găsite în mod specific în celulele HK-2. Cu toate acestea, deși aceste dovezi susțin scenariul nostru ipotetic, ar trebui efectuate experimente specifice pentru a-l confirma.

Investigarea răspunsului celulelor renale lahipoxiene poate îmbunătăți înțelegerea patologiei renale. Am studiat, deși într-o manieră preliminară, rolul creșterii raportului de expresie dintre proteina pro-apoptotică Bax și proteina anti-apoptotică Bcl-2 înhipoxie-apoptoza indusă în celulele HK-2. Rezultatele noastre au indicat că inhibarea PGL nu a dus la modificări compatibile cu o schimbare anti-apoptotică a echilibrului dintre expresia Bcl-2 și Bax (Fig. 2e), care nu sprijină rolul acestor proteine ​​în Moartea celulelor HK-2 dependentă de iPGE subhipoxie. Din câte știm, există doar două studii privind implicarea axei Bcl{{0}}/Bax în apoptoza indusă de hipoxie în PTC și ambele au implicat concentrații de O anoxic" sau aproape anoxic5 Când PTC a fost expus la 0,2% O., expresia Bax a rămas neschimbată, iar apoptoza a fost legată de scăderea gradului de expresie a Bcl-2. Cu toate acestea, expresia Bcl-2 nu a fost afectată de 1% O, în ciuda faptului că prezența apoptozei, care coincide cu rezultatele noastre. Prin urmare, alte mecanisme care nu implică neapărat modificări cantitative ale expresiei Bcl-2 sau Bax ar trebui luate în considerare: de exemplu, inducerea apoptozei în celulele de gliom cultivate de către iPGE2 necesită doar asocierea sa fizică cu Bax, care declanșează translocarea lui Bax în mitocondrii 202. Astfel, mecanismul prin care iPGE contribuie la apoptoza celulelor HK-2 merită un studiu suplimentar.

Grupul nostru a descoperit că un COX-2(ciclo-oxigenază)creșterea dependentă a iPGE, mediază moartea apoptotică în celulele HK-2 expuse la cisplatină, corpuri apoptotice7" șihipoxie(rezultatele noastre curente). Deoarece PGE este eliberată rapid în exteriorul celulei după ce a fost svnthesized2, transportul său spre interior de către PGl joacă un rol critic în apoptoza indusă de iPGE în celulele HK-2. Prin urmare, ori de câte ori afectarea PTC este mediată de iPGE, tratamentul cu inhibitori ai PGT ar putea fi o abordare terapeutică utilă cu aplicații potențiale, cum ar fi prevenirea leziunii PTC induse de cisplatină, inhibarea propagării leziunii tubulare prin corpurile apoptotice sau limitarea efect nociv alhipoxiepe PTC.