Efectele protectoare ale microveziculelor celulelor progenitoare endoteliale asupra leziunilor celulelor renale de șobolan induse de Ang II

edmund.chen@wecistanche.com

Abstract.Hipertensiunea cronică poate duce laafectarea rinichilor,cunoscut sub numele de nefropatie hipertensivă sau nefroscleroză hipertensivă. Înțelegerea în continuare a mecanismelor moleculare prin care se dezvoltă nefropatia hipertensivă este esențială pentru un diagnostic și tratament eficient. Prezentul studiu a investigat mecanismele prin care celulele progenitoare endoteliale (EPC) repară șobolanul primarrinichicelule (PRK). ELISA, Cell Counting Kit-8 și testele de citometrie în flux au fost utilizate pentru a analiza efectele EPC-urilor sau EPC-MV-urilor asupra stresului oxidativ, inflamației, proliferării celulare, apoptozei și ciclului PRK-urilor induse de AngII. Un model de leziune PRK a fost stabilit folosind angiotensina II (Ang II). După inducerea Ang II, proliferarea PRK a fost scăzută, apoptoza a fost crescută și ciclul celular a fost blocat în faza G1 înainte de a intra în faza S. S-a constatat că nivelurile de specii reactive de oxigen și malondialdehidă au fost crescute, în timp ce nivelurile de glutation peroxidază și superoxid dismutază au fost scăzute. Mai mult, nivelurile de citokine inflamatorii IL-1, IL-6 și TNF- au fost semnificativ crescute. Astfel, Ang II a deteriorat PRK prin stimularea stresului oxidativ și promovarea răspunsului inflamator. Cu toate acestea, atunci când PRK-urile au fost co-cultivate cu EPC, daunele induse de Ang II au fost reduse semnificativ. Studiul actual a colectat microveziculele (MV) secretate de EPC și le-a co-cultivat cu PRK-uri induse de Ang II și a identificat că EPC-MV-urile și-au păstrat efectul protector asupra PRK. În concluzie, EPC-urile protejează PRK-urile de daune induse de Ang II prin intermediul MV secretate.

CISTANCHE VA AMUNĂȚI BOLILE RENALILOR/RENALILOR

Introducere

Hipertensiunea arterială este un factor de risc pentru incidența bolilor cardiovasculare și cerebrovasculare și a mortalității asociate acestora (1). Therinichipoate provoca hipertensiune arterială și sunt unul dintre organele țintă ale afectarii hipertensiunii arteriale (2). Cronicboală de rinichi(CKD) a fost una dintre cauzele majore de creștere a mortalității în rândul persoanelor cu hipertensiune arterială din întreaga lume în ultimele două decenii (3,4). Astfel, există o necesitate urgentă de a promova tratamentul nefropatiei hipertensive și de a studia mecanismul patologic al acesteia. Studiile anterioare au arătat că angiotensina II (Ang II) a indus leziuni vasculare și a jucat un rol cheie în bolile vasculare prin mai multe mecanisme, cum ar fi inducerea apoptozei (5), oprirea ciclului celular (6), creșterea nivelului speciilor reactive de oxigen (ROS) ( 7), promovând răspunsul la stres oxidativ prin creșterea secreției de malondialdehidă (MDA) și reducerea secreției de glutation peroxidază (GSH-Px) și superoxid dismutază (SOD) (8,9). Ang II promovează, de asemenea, producerea de factori legați de inflamație, cum ar fi IL-6, IL-1 și TNF- (10-12). Prin urmare, leziunile induse de Ang II au fost utilizate pentru a modela hipertensiunea in vitro, inclusiv la șobolanul primarrinichicelule (PRK) (13,14).

Pentru pacientii cufunctie renalaafectarea, deteriorarea celulelor endoteliale și scăderea regenerării și reparației sunt principalele cauze ale pierderii microveziculelor peritubulare (MV) (15). Celulele progenitoare endoteliale (EPC) derivate din măduva osoasă pot promova repararea endotelială (16,17). Studiile anterioare au arătat că EPC-urile pot îmbunătăți regenerarea cardiovasculară (18) și pot regla angiogeneza (19), precum și pot exercita efecte terapeutice asupra acutelor.renalleziune ischemie-reperfuzie (20) şi la pacienţii cutransplant renal(21). Cu toate acestea, după cunoștințele noastre, efectul EPC asupra nefropatiei hipertensive nu a fost raportat anterior. Am emis ipoteza că EPC-urile pot avea un efect protector împotriva nefropatiei hipertensive înrenalcelule. MV-urile sunt secretate continuu de o varietate de celule din organism, cum ar fi celulele epiteliale, celulele tumorale și celulele stem și există în mai multe fluide corporale, cum ar fi sângele, urina și laptele, unde mediază funcțiile biologice (22). Dovezile acumulate au sugerat că efectul protector al EPC este strâns asociat cu eliberarea de MV (23,24) În studiul de față, potențiala aplicare a EPC-MV pentru tratamentul nefropatiei hipertensive a fost examinată prin investigarea efectelor și mecanismelor de protecție. prin care EPC-MV-urile protejează împotriva leziunilor PRK induse de Ang II, pentru a oferi o bază teoretică biologică pentru tratamentul nefropatiei hipertensive.

Cuvinte cheie:EPC-MV, nefropatie hipertensivă, Ang II, ROS, MV, inflamație, rinichi, rinichi

Materiale și metode

animale.Un total de șobolani masculi Wistar-Kyoto (WKY) fără patogeni specifici (greutate, 80-120 g) de 12 8 săptămâni au fost obținuți de la Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (licență nr. SCXK, Guangdong, 2015‑0063). Șobolanii au fost plasați într-o cameră cu o temperatură și umiditate constante (temperatura, 23±2˚C; umiditate, 50±10 la sută), sub un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore, cu acces ad libitum la hrana standard pentru șobolani și apă în o cușcă de polistiren. Toate experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor al Universității Medicale din Hainan (Haikou, China; aprobare nr. HYLL-2021-053) și au fost efectuate în conformitate cu ghidurile National Institutes of Health (25).

CISTANCHE VA ÎMBUNĂTĂȚI FUNCȚIA RINICHII/RENALE

Izolarea și cultura PRK-urilor.Șobolanii WKY cu acces liber la apă au postit timp de 12 ore înainte de experiment. Șoarecii WKY au fost eutanasiați folosind o injecție intraperitoneală de pentobarbital sodiu (200 mg/kg greutate corporală), apoirinichiau fost îndepărtate aseptic, iar porțiunea corticală arinichia fost excizat și transplantat într-un pahar mic. Therenalcortexul a fost tăiat în fragmente de țesut de ~1 mm3, spălat de trei ori cu PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), centrifugat la 1,000 xg la 25°C timp de 5 minute și supernatantul a fost aruncat. Fragmentele de țesut au fost adăugate la colagenază de tip I (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) la o concentrație finală de 1 g/l, iar fragmentele de țesut au fost oscilate și digerate la 37°C timp de 30 min. După filtrare printr-o sită din oțel inoxidabil de 200 de ochiuri (0,075 mm), celulele au fost separate prin centrifugare cu gradient de densitate Ficoll (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) (26). După centrifugare la 1,000 xg la 25˚C timp de 2 minute, suspensia intermediară a fost colectată și amestecată cu mediu MEM/F12 (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), inoculată într-o placă cu 6 godeuri și cultivat la 37˚C sub 5% CO2. După 24 de ore, mediul a fost îndepărtat și înlocuit cu un mediu proaspăt, iar cel neatașatrenalcelulele și țesuturile au fost aruncate. După 48 de ore, mediul a fost îndepărtat din nou, celulele au fost spălate de două ori cu PBS și au fost notate ca PRKs (27, 28); constituentul principal au fost celulele mezangiale glomerulare de șobolan. PRK-urile au fost cultivate timp de trei generații și tratate cu Ang II (1 µM; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) la 37˚C timp de 24 de ore pentru a stabili PRKafectare renalămodel. Inflamația indusă de Ang II la șobolanrenalcelulele epiteliale tubulare a fost efectuată așa cum a fost descris anterior de Nair și colab. (29).

PRK-urile au fost identificate folosind un test de imunofluorescență (IF).După clătirea de trei ori cu PBS și fixarea cu 4% paraformaldehidă la 25°C timp de 1 oră, celulele au fost incubate (25°C) cu Triton X‑100 timp de 2 ore, urmate de 5% BSA (Beijing). Solar Science & Technology Co., Ltd.) la 25˚C timp de 30 min. PRK-urile au fost apoi incubate peste noapte în întuneric cu actină musculară netedă (-SMA; 1 µg/ml; nr. cat. ab7817; Abcam) și vimentină (1:250; nr. cat. ab92547; Abcam) la 4˚C. După clătirea de trei ori cu PBS, celulele au fost incubate cu anticorpi secundari Alexa Fluor® 488- (1:100; cat. nr. ab150077; Abcam) sau 647 (1:200; cat. nr. ab150075; Abcam) la 37 ˚C timp de 1 oră. Apoi, celulele au fost colorate cu DAPI (0,5 pg/ml; Institutul de Biotehnologie Beyotime) la 25°C timp de 5 minute. În cele din urmă, imaginile au fost capturate folosind un microscop cu fluorescență (mărire, x400; Leica Microsystems GmbH).

Cultura și identificarea EPC-urilor.Femurul și tibia de șobolan au fost disecate și fiecare tub de măduvă osoasă a fost spălat cu PBS steril. Amestecul rezultat a fost centrifugat (1,000 xg; 25°C; 15 min) și particulele au fost resuspendate în mediu MEM/F12. Celulele au fost izolate prin centrifugare cu gradient de densitate Ficoll (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) (1,000 xg; 25˚C; 20 min) și plasate într-un balon de cultură de 25 cm2 acoperit cu fibronectină (BD Biosciences). Celulele au fost menținute într-un mediu complet în condiții standard (37°C; 5% CO2). Mediul de cultură a fost schimbat după 4 zile, iar celulele aderente au fost cultivate pentru încă 3 zile (30). Colorarea cu lipoproteine ​​de densitate joasă acetilată cu complex Dil (Dil-Ac-LDL) (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) a fost utilizată pentru a identifica EPC-urile. Pentru sistemul de co-cultură, PRK-uri (1x104) au fost adăugate în camera inferioară a unei plăci de co-cultivare (Corning, Inc.) timp de 24 de ore și apoi au fost Ang II (1 µM) sau 200 µl PBS și EPC-uri (3x104) adăugat în camera superioară și incubat la 37°C timp de 24 de ore înainte de a fi efectuată o analiză suplimentară a funcției celulare. La screening-urile PRK și cea mai bună proporție de EPC, proporțiile numărului de celule au fost 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 și 1:7.

Pregătirea EPC-MV-urilor. EPC-urile au fost cultivate timp de 7 zile așa cum s-a descris anterior (30), spălate de două ori cu PBS și înfometate de ser timp de 12 ore. Ulterior, mediul MEM/F12 care conține EPC-uri de cultură a fost colectat și centrifugat la 4°C (1,000 xg; 15 min), iar supernatantul a fost extras la 4°C (100,000 xg; 60 min) pentru colectarea EPC-MV secretate. După încorporare în rășină epoxidica Pon 812 (Structure Probe, Inc.), aceasta a fost plasată la 37°C peste noapte. Apoi, soluția de fixare cu microscopul electronic (Wuhan Service Technology Co., Ltd.) a fost adăugată timp de 4 ore și acetat de uraniu (2%; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) și citrat de plumb (Wuhan Service Technology Co., Ltd. ) au fost colorate la 25°C timp de 15 minute. MV au fost confirmate prin microscopie electronică cu transmisie. În sistemul de cocultură, 50 ug/ml EPC-MV (31) au fost adăugate în camera superioară a unei plăci de testare Transwell, iar parcuri au fost adăugate în camera inferioară așa cum s-a descris anterior și incubate timp de 24 de ore.

Test de proliferare celulară.PRK-urile au fost digerate cu tripsină, inoculate în plăci cu 96 de godeuri la o densitate de 3x103 celule/godeu și cultivate timp de 24 de ore. Densitatea optică la 450 nm a fost măsurată folosind 10 µl de reactiv Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) la 37˚C timp de 60 de minute, conform instrucțiunilor producătorului, pentru a evalua rata de proliferare celulară.

CISTANCHE VA Ameliora DURILE DE RINCHI/RENALI

Test de apoptoză celulară.Un test de apoptoză celulară a fost efectuat folosind un kit de detectare a apoptozei Annexin V-FITC (BD Biosciences), conform instrucțiunilor producătorului. PRK-urile au fost recoltate, spălate de două ori cu PBS răcit cu gheața (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) și resuspendate în 500 µl tampon de legare. PRK-urile resuspendate au fost apoi incubate cu 5 µl de anexină V-FITC și 5 µl de PI la întuneric timp de 15 minute la 23±2˚C. Apoptoza celulară a fost evaluată utilizând citometrie în flux (FCM; FACSCanto II; software-ul BD FACSChorus™, versiunea: 1.0; BD Biosciences).

Fuziunea EPC-MV și PRK.Pentru a observa dacă EPC-MV-urile au fost fuzionate cu PRK, EPC-MV-urile au fost etichetate cu un colorant fluorescent încorporat în membrană lipidică (PKH26) înainte de co-incubare. Pe scurt, 50 ug/ml EPC-MV au fost combinate cu 2 ml PKH26 (2x10-6 M; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) și amestecate la 23±2°C timp de 5 minute. Amestecul marcat a fost adăugat la 2 ml 1% BSA (v) și centrifugat la 100,000 xg la 4°C timp de 60 de minute, apoi clătit cu PBS rece. Precipitatul a fost suspendat în 1 ml mediu MEM/F12, adăugat la PRK și incubat la 37°C timp de 24 ore. În cele din urmă, s-a adăugat 1 pg/ml DAPI pentru colorarea nucleară la 25°C timp de 15 minute. Imaginile celulare au fost obținute folosind un microscop cu fluorescență (mărire, x400; Leica Microsystems GmbH).

Analiza ciclului celular.Testul ciclului celular a fost efectuat folosind kitul de detectare a ciclului celular (BD Biosciences). EPC-urile sau PRK-urile (1x106) au fost recoltate, spălate de două ori cu PBS și apoi fixate în 500 µl 70% etanol rece cu gheața timp de 2 ore la 25 °C. Celulele au fost apoi spălate de două ori cu PBS rece și incubate în PI (400 ui) și RNază (100 ui) timp de 30 de minute la 37 °C în întuneric. Semnalul PI a fost detectat folosind FCM (FACSCanto II). Procentele celulelor în faza G1, S și G2 au fost numărate și comparate folosind software-ul FlowJo (versiunea 10.0.6; FlowJo LLC).

Măsurarea ROS de către FCM.PRK-urile au fost cultivate la 60-70% confluență și recoltate prin tripsinizare. Toate celulele au fost incubate cu 1,0 uM diacetat de 2',7'-diclorodihidrofluoresceină timp de 15 minute la 37°C. Celulele au fost apoi spălate de două ori cu PBS și analizate prin FCM pentru a detecta ROS folosind un laser de 488 nm pentru excitare și un laser de 535 nm pentru detectare.

ELISA.După centrifugare (1,000 xg; 25˚C; 5 min), supernatantul celular din fiecare subgrup a fost colectat pentru a analiza nivelurile de MDA, GSH-Px, SOD și factorii inflamatori IL-6, IL- 1 și TNF- . Următoarele truse au fost utilizate conform instrucțiunilor producătorului: kit de analiză Micro MDA (nr. cat. BC0020; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), kit de analiză GSH‑Px (nr. cat. BC1195; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), kit de detectare a activității SOD (cat. nr. BC0170; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), șobolan IL‑1 ELISA kit (cat. nr. RLB{ {13}}; R&D Systems, Inc.), kit IL-6 Quantikine ELISA pentru șobolan (nr. cat. R6000B; R&D Systems, Inc.) și kit ELISA pentru șobolani TNF Quantikine (nr. cat. RTA00; R&D Systems, Inc. ).

Analize statistice.Toate experimentele au fost repetate de trei ori și toate datele sunt exprimate ca medie ± SD. Datele au fost analizate utilizând software-ul SPSS versiunea 21.0 (IBM Corp.). Diferențele dintre mai multe grupuri au fost evaluate folosind ANOVA unidirecțională și testul post-hoc al lui Dunnett. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Rezultate

Identification of isolated EPCs and PRKs. The isolated  EPCs were identified using Dil‑Ac‑LDL staining (Fig. 1A).  Microscopic counting revealed that the degree of coincidence between red (Dil‑Ac‑LDL staining) and blue (nuclear staining with DAPI) fluorescence was >90 la sută, confirmând că EPC-urile au fost izolate cu succes. PRK-urile izolate au fost analizate prin IF (vimentin/-SMA). Rezultatele au demonstrat că nivelul de expresie al vimentinei/-SMA în PRK a fost ridicat și pozitiv, ceea ce sugerează izolarea cu succes a PRK (Fig. 1B).

Raportul optim dintre EPC și PRK.S-a examinat efectul combinării diferitelor proporții de PRK/EPC într-un sistem de cocultură și s-a constatat că PRK cultivate într-un raport de 1:3 PRK/EPC nu au avut rate de proliferare crescute în comparație cu PRK cultivate cu 2: Raportul 1, 1:1 sau 1:2 dintre PRK/EPC (Fig. 1C). Mai mult, proporțiile tot mai mari de EPC (1:4, 1:5, 1:6 și 1:7) au dus la o creștere semnificativă a proliferării PRK în comparație cu cea a EPC (1:3). Prin urmare, a fost selectat un raport de 1: 3 PRK/EPC pentru studii ulterioare pentru a preveni posibila interferență din cauza EPC-urilor excesive în experimentele ulterioare.

Efectul coculturii EPC asupra daunelor induse de Ang II.PRKs (1x104) au fost inoculate cu 24 de ore înainte în compartimentul inferior al unei plăci Transwell. Camera superioară a conținut 200 ui PBS în grupul de control și 200 ui EPC-uri (3x104) în grupul experimental. Pentru a modelaafectarea rinichilor,S-a adăugat 1 pM Ang II în compartimentul inferior. După 24 de ore, au fost efectuate teste CCK-8 și FCM pentru a măsura rata de proliferare a PRK. PRK care au primit Ang II în absența EPC-urilor au avut o scădere semnificativă (P<0.05) proliferation="" rate="" (fig.="" 1d),="" and="" increased="" apoptosis="" rate="" (fig.="" 1e)="" and="" cell="" cycle="" arrest="" in="" the=""  g1="" phase="" (fig.="" 1f)="" compared="" with="" the="" control="" group,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" receiving="" ang="" ii="" showed="" the="" reverse="" effects.="" these="" results="" indicated="" that="" co‑culture="" with="" epcs="" can="" reduce="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" a="" rat="">rinichimodel celular.

EPC-urile protejează PRK-urile de daune induse de Ang II, au fost examinate nivelurile de stres oxidativ induse de Ang II în PRK-urile cultivate în comun cu EPC. Rezultatele testului FCM au arătat că Ang II a crescut semnificativ (P<0.05) the="" levels="" of="" ros="" in="" prks="" in="" the="" absence="" of="" epcs,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" had="" comparatively="" lower="" ros="" levels="" (fig.="" 2a).=""  similarly,="" the="" elisa="" results="" indicated="" that="" the="" levels="" of="" secreted=""  mda="" (fig.="" 2b)="" were="" increased="" and="" gsh="" and="" sod="" (fig.="" 2c=""  and="" d)="" levels="" were="" decreased="" in="" prks="" receiving="" ang="" ii,="" while=""  prks="" receiving="" ang="" ii="" and="" co‑cultured="" with="" epcs="">

Figure 1. Recovery of PRKs by co‑culture with EPCs following injury induced by Ang II. (A) Confirmation of the isolation of EPCs via Dil‑Ac‑LDL staining. Magnification, x100. (B) Confirmation of the isolation of PRKs using an immunofluorescence assay. Magnification, x400. (C) CCK‑8 analysis of the effects of different proportions of co‑cultured EPCs on the proliferation of PRKs. NS P>0.05 vs. PRKs:EPC, grup 2:1; *P<0.05 vs.="" prks:epcs,="" 2:1="" group.=""  (d)="" cck‑8="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" proliferation="" rate="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" fcm="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" (e)="" apoptosis="" and="" (f)="" cell="" cycle="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" *=""><0.05 vs.="" control;="" #=""><0.05 vs.="" ang="" ii.="" ang="" ii,="" angiotensin="" ii;="" epcs,="" endothelial="" progenitor="" cells;=""  prks,="" primary="" rat="">rinichicelule; FCM, citometrie în flux; CCK-8, Kit de numărare a celulelor-8; Dil-Ac-LDL, lipoproteină de densitate joasă acetilată complex Dil; OD, densitate optică; ‑SMA, ‑actina musculară netedă; NS, nu este semnificativ. rezultate opuse în ceea ce privește secreția acestor enzime. Generarea de ROS poate fi, prin urmare, implicată în deteriorarea celulară indusă de Ang II și poate fi ameliorată prin co-cultură cu EPC.

Ang II poate, de asemenea, deteriora celulele prin promovarea secreției de citokine inflamatorii, în timp ce EPC-urile pot preveni inflamația (32). Apoi, s-a investigat dacă Ang II promovează secreția de citokine inflamatorii în PRK și dacă EPC-urile și-ar putea exercita rolul protector prin inhibarea secreției de citokine inflamatorii. Secreția de IL-1, IL-6 și TNF-a fost semnificativ suprareglată în PRK prin adăugarea Ang II. În schimb, în ​​PRK-urile co-cultivate cu EPC, nivelurile de IL-1, IL-6 și TNF- (Fig. 2E-G) au fost comparativ mai mici (P<0.05) than="" those="" in="" prks="" cultured="" alone.="" therefore,="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" prks="" was="" also="" associated="" with="" pro‑inflammatory="" cytokines,="" and="" co‑culture="" with="" epcs="" exerted="" protective="" effects="" by="" reducing="" the="" secretion="" of="" these="">

Efectul protector al EPC-urilor este exercitat prin intermediul MV-urilor.Mecanismele prin care EPC-urile exercită efecte protectoare asupra Ang II induserinichicelulele au fost analizate în continuare prin izolarea MV-urilor din EPC-uri (Fig. 3A). EPC-MV-urile au fost etichetate cu PKH26 și adăugate la PRK-uri împreună cu Ang II într-o placă Transwell, așa cum s-a descris anterior. Fluorescența PKH26 a fost detectată în citoplasma PRK-urilor (Fig. 3B), indicând faptul că EPC-MV-urile s-au fuzionat cu PRK. Apoi, s-a constatat că scăderea ratei de proliferare indusă de Ang II, a promovat apoptoza și oprirea ciclului în faza G1, au fost inhibate de EPC-MV (Fig. 3C-E). Similar cu PRK-urile co-cultivate cu EPC, PRK-urile crescute în prezența EPC-MV-urilor și expuse la Ang II au avut niveluri reduse de ROS și MDA (Fig. 4A și B), niveluri crescute de GSH și SOD (Fig. 4C și D) și scăderea secreției de citokine inflamatorii IL-1, IL-6 și TNF- (Fig. 4E-G), în comparație cu grupul Ang II.

Discuţie

Din cunoștințele noastre, studiul de față a demonstrat pentru prima dată că EPC-urile pot proteja PRK-urile de deteriorarea celulară indusă de Ang II. Acest efect protector este, cel puțin parțial, mediat de MV care sunt secretate de EPC și fuzionează cu PRK în timpul coculturii. Prin adăugarea de MV îmbogățite la PRK expuse la Ang II, s-a constatat că EPC-MV singure ar putea proteja PRK de daune induse de Ang II prin inhibarea stresului oxidativ și a inflamației. MV-urile sunt definite ca nanodebrituri membranare (0.05-1 µm) (33) și sunt eliminate de la suprafața celulei după activare, stres sau apoptoză. În plus, MV-urile pot fi derivate din diferite tipuri de celule, cum ar fi trombocite, celule endoteliale, EPC și celule albe din sânge (34,35). MV exprimă markeri specifici de suprafață celulară, care variază în funcție de celula de origine și de formarea lor și pot exercita efecte antiinflamatorii, anticoagulante și angiogene (36). MV-urile eliberate din EPC-uri pot transporta informațiile biologice ale celulei lor părinte și, astfel, exercită o funcție similară asupra celulelor țintă (33). De exemplu, EPC-MV-urile protejează cardiomiocitele de hipertrofia și apoptoza induse de Ang II (28), îmbunătățesc funcția endotelială și capacitatea de a regla angiogeneza (37) și atenuează disfuncția endotelială indusă de stresul oxidativ (38). Cu toate acestea, după cunoștințele noastre, efectul EPC-MV-urilor asupra nefropatiei hipertensive nu a fost raportat anterior. Prin urmare, prezentul studiu și-a propus să investigheze potențialele efecte de protecție ale EPC-urilor și EPC-MV-urilor înlezarea celulelor renale.

În studiul de față, a fost stabilit un model de leziune PRK prin inducerea leziunilor cu Ang II. În conformitate cu rapoartele anterioare (26, 39), Ang II a redus proliferarea PRK, a crescut apoptoza și a oprit ciclul celular în faza G1 înainte de a intra în faza S. Pe baza acestor markeri legați de hipertensiune arterială, s-a ajuns la concluzia că modelul de hipertensiune PRK indusă de Ang II a fost stabilit cu succes. În plus, s-a stabilit că co-cultura cu EPC-urile a protejat PRK-urile de daune induse de Ang II. După co-incubarea EPC-urilor cu PRK plus Ang II, nivelurile enzimelor de stres oxidativ și factorii inflamatori din PRK au fost scăzute. Astfel, mecanismele potențiale prin care EPC-urile își exercită efectele protectoare asupra PRK pot implica reglarea stresului oxidativ și a inflamației. Din câte știm, studiul actual a demonstrat pentru prima dată că EPC-urile pot ameliora răspunsul la stresul oxidativ indus de Ang II și inflamația în PRK.

EPC-urile protejează în mod eficientfunctie renalaîn CKD (40) și joacă un rol major în menținerea integrității vasculare și repararea leziunilor endoteliale (15), precum și reducerea scurgerilor vasculare, îmbunătățirea funcției organelor și creșterea ratei de supraviețuire în sepsis (41). Dovezile acumulate sugerează că EPC-urile pot exercita un rol protector prin secreția de MV (37,42,43). Pentru a testa efectul protector al EPC-MV în PRK, EPC-MV au fost izolate și etichetate cu PKH26, iar apoi MV-urile etichetate au fost co-incubate cu PRK plus Ang II. EPC-MV-urile s-au fuzionat cu PRK și au inhibat semnificativ răspunsul la stresul oxidativ și inflamația induse de Ang II, iar aceste rezultate sunt similare cu cele ale lui Fu et al (44). Efectul inhibitor al EPC-MV-urilor asupra nivelurilor enzimelor de stres oxidativ a fost mai mare decât cel al EPC-urilor singure; acest lucru poate fi atribuit faptului că MV-urile sunt prezente la o concentrație mai mare în PRK-urile tratate cu EPC-MV decât în ​​cele co-cultivate cu EPC. Aceste constatări sugerează că efectul protector al EPC-urilor asupra PRK împotriva leziunilor celulare induse de Ang II poate depinde de MV secretate. O limitare a prezentului studiu este că mecanismele potențiale prin care EPC-MV-urile reglează axele de transducție microARN/mRNA/semnal nu au fost pe deplin examinate. Rolul și mecanismele prin care EPC-MV-urile exercită protecție împotrivaafectarea rinichilorar trebui evaluat într-un model animal de nefropatie hipertensivă, care este o direcție promițătoare pentru cercetările viitoare. În concluzie, prezentul studiu a demonstrat că EPC-urile pot proteja PRK-urile de stresul oxidativ indus de Ang II și de inflamația crescută prin secreția de MV. Aceasta oferă o nouă direcție pentru tratamentul nefropatiei hipertensive și stabilește un model in vitro pentru studiulleziuni renale.