Anti-apoptoza podocitelor și pro-apoptoza celulelor mezangiale pentru telmisartan în atenuarea leziunilor renale diabetice

ABSTRACT

Leziunile podocitelor și expansiunea celulelor mezangiale sunt două manifestări patologice importante ale leziunii glomerulare în diabetul precoce. Telmisartanul, ca inhibitor al receptorului angiotensinei de tip 1 (AT1), ar putea îmbunătăți produsele de terminare a glicației avansate (AGE) sau leziunile podocitelor induse de angiotensină Ⅱ (Ang Ⅱ), inclusiv detașarea sau apoptoza. În această lucrare actuală, am confirmat mai întâi efectul protector al telmisartanului asupra leziunii renale diabetice precoce la șobolanii cu diabet zaharat de tip 1. Telmisartanul a redus pierderea de podocină și a inhibat expresia -SMA, reflectând efectul său protector asupra leziunii podocitelor și, respectiv, proliferării mezangiale. Mai interesant, am observat un efect opus al telmisartanului asupra viabilității celulare și a apoptozei podocitelor și celulelor mezangiale într-un mediu cu conținut ridicat de glucoză in vitro. Efectul anti-apoptotic al telmisartanului asupra podocitelor ar putea fi legat de inhibarea exprimării swiprosinei-1 (o proteină care poate media apoptoza podocitelor indusă de glucoză ridicată). În timp ce telmisartanul a indus o expresie ridicată a PPAR în celulele mezangiale, iar GW9662 (un antagonist PPAR) a inhibat parțial apoptoza indusă de telmisartan și a redus viabilitatea celulelor mezangiale. În plus, expresia ridicată a PKC 1/TGF 1 indusă de glucoză în celulele mezangiale ar putea fi blocată de telmisartan. Aceste date oferă un mecanism celular mai precis pentru a dezvălui efectul protector al telmisartanului în leziunile renale diabetice.

CUVINTE CHEIE

boală renală diabetică, podocite (MeSH: D050199), celule mezangiale, telmisartan (PubChem CID: 65, apoptoză

Click aici pentru a cumpara produsele Cistanche

INTRODUCERE

Boala diabetică de rinichi (DKD), bine cunoscută ca o boală cronică de rinichi indusă de diabetul zaharat (DM) de tip 1 sau 2 (Podgórski et al., 2019), ar putea agrava rata de filtrare glomerulară (GFR) scade progresiv, apoi se dezvoltă în cele din urmă la sfârșit. - stadiul bolii renale (Hou et al., 2018; Ruiz-Ortega et al., 2020; Grupul de experți al Societății Chineze de Nefrologie, 2021). Există două mecanisme prin care hiperglicemia mediază prin leziunea podocitelor renale și modificările membranei bazale glomerulare (GBM) induse de expansiunea sau proliferarea celulelor mezangiale (Anders et al., 2018).

Podocitele sunt celule epiteliale viscerale specializate, care căptușesc stratul extern al GBM, ale cărui procese ale piciorului se interdigitează formând o barieră finală pentru a preveni pierderea proteinelor urinare (Podgórski et al., 2019). Numărul și/sau densitatea fiecărui glomerul a fost studiat la pacienții cu DZ (Papadopoulou-Marketou și colab., 2017). Leziunile podocitelor contribuie la pierderea proprietăților lor adezive și este o cauză majoră a dezvoltării DKD (Podgórski et al., 2019). O altă caracteristică notabilă a podocitelor este că podocitele mature sunt celule proliferative limitate (Podgórski și colab., 2019), (Griffin și colab., 2003). Pierderile de podocite duc la proliferarea celulelor mezangiale, cu toate acestea, pierderi mai substanțiale duc la fibroză glomerulară și proteinurie crescută ca denudare ulterioară a GBM (Fukuda et al., 2012). Controlul slab al glicemiei are ca rezultat podocitopatie (Anders et al., 2018), modificări morfologice caracterizate prin hipertrofie podocitelor, transdiferențiere epitelial-mezenchimală podocitelor (Chang et al., 2017), detașare podocitelor (Zhang et al., 2020), posisdocytes (apop). Wang și colab., 2018a) și pierderea podocitelor, care duc la aberațiile progresive ale podocitelor, duc la detașarea GBM cu glomeruloscleroză în consecință.

Celulele mezangiale au un impact semnificativ nu numai asupra ajustării circulației glomerulare și intraglomerulare, ci și asupra conservării glomerulilor, cum ar fi apărarea celulelor endoteliale glomerulare și fluxul de substanțe din ser și lichid din microvase (Wakisaka et al., 2021). GBM îngroșat și mezangialul extins sunt tulburări glomerulare vizibile în diabet (Papadopoulou-Marketou și colab., 2017). Îngroșarea GBM este o histopatologică timpurie în DKD și este afectată de venitul aberant și variația matricei extracelulare secretate de celulele endoteliale și podocite (Anders et al., 2018). Hiperglicemia stimulează celulele mezangiale să prolifereze și să fabrice matrice (Kriz și colab., 2017) prin activarea factorului de creștere transformator- (TGF), care determină direct activarea transcripțională a colagenului matricei (Ziyadeh și colab., 2000) conducând la expansiunea mezangială. matrice.

Intervenția precoce cu tratament hipoglicemiant și antihipertensiv este benefică pentru a întârzia apariția și dezvoltarea DKD (Martins și Norris, 2001). Recomandat în special la adulții cu tensiune arterială normală cu DZ și albuminurie este un inhibitor al enzimei de conversie a angiotensinei (IECA) sau blocant al receptorilor angiotensinei (BRA) (Liew et al., 2020). Blocarea sistemului renină-angiotensină ameliorează expresia ANGPTL2 și integrinei care mențin bariera glomerulară (Tawfik et al., 2021). Motivul pentru care a fost ales telmisartanul este că este descris ca fiind mai eficient decât alte medicamente ARB în atenuarea proteinuriei (Naruse et al., 2019; Guo et al., 2020). Mai mult, telmisartanul poate scădea nefrotoxicitatea indusă de cisplatină, cum ar fi apoptoza podocitelor și nivelurile de expresie a proteinelor asociate cu autofagie (Malik și colab., 2015). Fascinant, telmisartanul are astfel de caracteristici, ținând cont de rolul său dublu de acțiune de blocare a receptorului AT1 și de proprietatea agonistă parțială a receptorului activat de proliferatorul peroxizomal gamma (PPAR) (Balakumar și colab., 2012). Scopul acestei lucrări a fost de a examina influența protectoare a telmisartanului asupra leziunii podocitelor și, respectiv, expansiunii mezangiale în stadiul incipient al DM de tip 1.

Pudra de Cistanche

MATERIALE ȘI METODE

1. Animale

Șobolani masculi SD au fost achiziționați de la SLRC Laboratory Animal Ltd. (Shanghai, China). Șobolanii au fost adăpostiți la o temperatură controlată de 22 ± 2 grade C, umiditate relativă de 50–60 la sută, cicluri de 12-h lumină și 12-h de întuneric (lumină, 08:00-20) :00, întuneric, 20: 00–08:00), și a permis accesul gratuit la dieta uscată standard și la apă de la robinet. Toate animalele au primit îngrijire umană, iar protocoalele experimentale au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea animalelor de la Universitatea de Medicină Navală.

2. Modelul diabetic și tratamentul

Weight 180–200 g male rats were treated with STZ (Sigma, Deisenhofen, Germany) to induce type 1 diabetes. STZ was dissolved in sterile citrate buffer (pH 4.5) and injected intraperitoneally (65 mg/kg body weight) within 10 min of preparation. The non-diabetic rats initially injected with STZ vehicles served as controls (group Con, n = 10). Diabetes mellitus was confirmed by measuring glucose levels in tail venous blood using a B-glucose analyzer (HemoCue, Angelholm, Sweden) 7 days later. Rats with random blood glucose levels>16,7 mmol/L au fost incluse în experimente.

Sobolanii diabetici au primit apoi telmisartan (Merck, PHR 1855, 10 mg kg-1 ·d-1 po, grupul DM plus Tel, n=10) sau vehicul (grupul DM, n=10) prin gavaj timp de 4 săptămâni. Telmisartanul utilizat în această lucrare a fost obținut de la Sigma-Aldrich Germany, Inc., a cărei puritate este de 98% plus (HPLC). Periodic, s-au măsurat glicemia și greutățile corporale și au fost colectate probe de urină pentru măsurarea cantitativă a albuminuriei în cuști metabolice. Șobolanii au fost sacrificați sub anestezie după 4 săptămâni, rinichii au fost îndepărtați și cântăriți pentru analiza histologică și extracția proteinelor.

3. Albumină urinară

Probele de urină au fost centrifugate la 10,000 rpm timp de 5 minute pentru a îndepărta materialele insolubile. Supernatantul a fost alicotat și depozitat la -80 grade C până la utilizare. Trusa ELISA pentru albumina urinară de șobolan de la Chondrex (Redmond, WA) a fost utilizată conform instrucțiunilor producătorului.

4. Rata clearance-ului creatininei

Trusa de testare a creatininei (Nanjing Jiancheng, C011-2-1) a fost utilizată pentru determinarea creatininei în sânge și urină. Ccr a fost calculată conform formulei: Ccr=(creatinina urinară*volum de urină 24 h)/(creatinina sanguină*24 h*60 min/h)/greutate finală (kg).

5. Colorarea imunohistochimică și TUNEL

Rinichii au fost tăiați într-un microtom de feliere la 7-8 μm și fixați cu 4% paraformaldehidă în PBS timp de 1 0 min. Blocarea a fost efectuată cu tampon (PBS, 2% BSA, 10% FBS) timp de 1 oră urmată de incubare timp de 10 minute cu un al doilea tampon (PBS, 0,4% Triton). Anticorpul primar împotriva -SMA (Servicebio, GB13044) sau NPHS2 (Abcam, ab229037) a fost incubat timp de 3 ore la temperatura camerei într-o cameră umidificată. După spălare, secțiunile au fost incubate cu Cy3 capră anti-IgG de șoarece (H plus L) (Servicebio, GB21301), IgG de capră anti-Rabbit conjugată cu HRP (H plus L) (Servicebio, GB23303) sau TUNEL imunofluorescent (Servicebio, G1501). ) reacție într-o cameră umedă (întuneric, 37 de grade, 1 h). Secțiunile au fost apoi contracolorate cu DAPI (Servicebio, G1012) pentru detectarea nucleelor. În cele din urmă, secțiunile colorate au fost încorporate în lichidul de etanșare de stingere a fluorescenței și au fost ilustrate folosind un microscop cu fluorescență (NIKON ECLIPSE C1, Japonia).

Extract de Cistanche

6. Cultura celulară

Celulele mezangiale renale umane (HRMCs) au fost obținute de la ScienCell Research Laboratories, Santiago, CA, și cultivate în Mezangial Cell Medium (MsCM, ScienCell Research Laboratories). HRMC-urile au fost placate pe un balon acoperit cu poli-L-lizină (2 ug/cm2) și crescute la 37 de grade într-o atmosferă umidificată care conține 5% CO2. Celulele din acest experiment au fost utilizate în 3-4 pasaje și au fost examinate pentru a se asigura că au demonstrat caracteristicile specifice ale celulelor mezangiale. Linia celulară de podocite de șoarece MPC-5 a fost obținută de la ATCC, Maryland, Statele Unite. Celulele au fost crescute pe colagen de tip I în RPMI 1640 (10% FBS) cu 50 U/ml IFN- la 33 grade până la 85% confluență și apoi transferate la 37 grade fără IFN- timp de 10-14 zile pentru diferențiere.

7. Analiza de viabilitate și proliferare celulară

Kitul de numărare a celulelor-8 (CCK-8) a fost folosit pentru a măsura proliferarea și viabilitatea celulelor. Celulele au fost însămânțate în fiecare godeu al plăcilor de cultură 96-godeuri (5 × 103 /godeu). După tratament, s-au adăugat 10 ul CCK-8 (Beyotime, Shanghai, China) și s-au incubat timp de 1 oră la 37 grade C. Absorbanța a fost măsurată folosind un cititor de microplăci (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Statele Unite) la o lungime de undă de 450 nm.

8. Colorarea cu anexină V și cu iodură de propidiu

Celulele au fost placate și crescute până când au atins o confluență de 60% și apoi tratate cu glucoză ridicată (50 mmol/L) sau telmisartan. După 96 de ore, celulele colectate au fost spălate cu PBS rece și resuspendate într-un tampon de legare. Anexa V-FITC și PI (eBioscience, Santiago, CA, Statele Unite) au fost adăugate la suspensia celulară conform instrucțiunilor producătorului și a fost analizată o probă de fluorescență de 10,000 celule prin citometrie în flux efectuată cu FACScan ( Becton, Dickinson, and Company, Franklin, NJ, Statele Unite).

9. Vest Ștergere

Cortexul renal, HRMC și MPC-5 au fost omogenizate în reactiv de extracție a proteinelor din țesuturi sau celule (Beyotime) suplimentat cu inhibitori de protează și fosfatază (Merck, Whitehouse Station, NJ, Statele Unite). Probele au fost separate pe un SDS PAGE 10% și transferate pe o membrană de nitroceluloză (Pall Corporation, NY, Statele Unite). Membrana a fost blocată cu 5% albumină serică bovină și tamponată cu anticorpi. Anti-PKC 1 (Tehnologie de semnalizare celulară, 46.809), anti-swiprosin-1 (Abcam, ab24368), TGF- 1 (Abcam, ab215715), Tubulin (Beyotime, AT819) și GAPDH (Beyotime, AF5009) ) au fost utilizate la o concentrație de 1:1,000. Proteinele au fost vizualizate folosind anticorpi secundari anti-șoarece sau anti-iepure conjugați cu IRDye (Rockland, Limerick, PA, Statele Unite) la 1: 5,000. Utilizarea SISTEMULUI DE IMAGINI INFRAROSII ODYSSEY (LI-COR) pentru a analiza rezultatele.

10. Analize statistice

Procesarea datelor a fost analizată de Origin 6.1 (OriginLab, Northampton, MA) și exprimată ca medie ± SD a cel puțin trei experimente independente. Semnificația statistică a fost determinată folosind ANOVA. O valoare de p < 0.05 a fost considerată semnificativă statistic.

Cistanche tubulosa

DISCUŢIE

Telmisartanul este un blocant selectiv al receptorilor AT1 care a fost utilizat clinic pentru reducerea tensiunii arteriale crescute și a excreției urinare de proteine ​​la pacienții hipertensivi (Baden și colab., 2008; Mann și colab., 2009). Mai multe studii clinice au sugerat că telmisartanul este eficient pentru a reduce proteinuria la pacienții cu macroalbuminurie și întârzie debutul și progresia nefropatiei diabetice (Makino și colab., 2005; Nakamura și colab., 2010; Fujita și colab., 2011; Schmieder și colab. ., 2011). În studiul de față, tratamentul oral cu telmisartan la șobolani cu diabet zaharat indus de STZ a prevenit apariția unor anomalii precoce la nivelul renal și, în general, inclusiv scăderea greutății corporale, a glicemiei și a proteinelor din urină. Aceste rezultate au confirmat că telmisartanul are renoprotecție la șoarecii cu nefropatie diabetică în stadiu incipient. Mai important, acest studiu a constatat că efectul protector al telmisartanului asupra glomerulilor diabetici s-a reflectat în efectele anti-apoptotice și pro-apoptotice asupra podocitelor și, respectiv, a celulelor mezangiale.

Produșii finali de glicație avansată (AGE) ar putea provoca leziuni și detașarea ADN-ului podocitelor, parțial prin stimularea axei Ang II-AT1R, oferind astfel o caracteristică benefică inovatoare a telmisartanului în DKD (Fukami și colab., 2013). În bolile glomerulare proteinurice normotensive, de grad scăzut, tratamentul cu telmisartan în stadiul incipient al bolii atenuează afectarea glomerulară și tubulointerstițială (Villa și colab., 2011). Și mai multe căi sunt probabil legate de consecințele pleiotrope, inclusiv semnalizarea factorului de creștere, ținta mamiferelor de semnalizare a rapamicinei, ubiquitinarea proteinelor, calea Wnt-beta catenină și semnalizarea hipoxiei (Villa și colab., 2011).

Recent, am raportat că swiprosin-1 (Wang et al., 2018b), un alt nume pentru domeniul EF-hand care conține 2 (EFhd2), a jucat un rol esențial în progresia DKD inițiată după inducție, în timp ce a localizat în podocitele glomerulului de şoarece. Absența Swiprosin-1 a ameliorat apoptoza podocitelor dependentă de mitocondrii, stimulată de hiperglicemie sau glucoză ridicată prin calea de semnalizare p38 MAPK. Aici, am constatat, de asemenea, că telmisartanul a inhibat hiperglicemia sau expresia indusă de glucoză ridicată a swiprosinei-1 atât in vivo, cât și in vitro, ceea ce a indicat că efectul anti-apoptoză al telmisartanului asupra podocitelor poate fi legat de reglarea swiprosinei{ {12}} expresie.

S-a constatat că proliferarea celulelor mezangiale și depunerea excesivă a proteinelor matricei extracelulare contribuie la dezvoltarea DKD (Lee și colab., 2004). Studiile anterioare au arătat că glucoza ridicată ar putea induce expresia proteinelor matricei extracelulare mezangiale în cazul hiperglicemiei (Taniguchi et al., 2013). -SMA este, în general, utilizat pentru a diferenția celulele mezangiale de alte celule glomerulare la șoarecii diabetici induși de STZ, iar expresia crescută a SMA ar putea fi markerul schimbărilor fenotipice ale celulelor mezangiale de la faza neactivată la faza proliferativă, activată secretorie (Niu). et al., 2014). Aici, am constatat că telmisartanul a scăzut expresia -SMA în glomerulul diabetic. În plus, s-a raportat că proliferarea celulelor mezangiale are un impact semnificativ asupra patogenezei DKD (Zeng et al., 2013). Rezultatele noastre din acest studiu au reflectat efectul deprimat dependent de timp și doză al telmisartanului asupra proliferării celulelor mezangiale legate de caracteristicile proapoptotice.

Dovezile clinice recomandă că telmisartanul este mai eficient decât losartanul în ameliorarea proteinuriei la persoanele hipertensive cu DKD, ceea ce poate fi legat de capacitatea sa de a agoniza parțial PPAR (Bichu et al., 2009). Mai mult, aceste modificări benefice, cum ar fi prevenirea atrofiei renale și a fibrozei telmisartanului, au fost legate de o scădere a expresiei TGF 1 și a altor gene de citokine proinflamatorii și profibrotice prin activarea PPAR/HGF (Kusunoki și colab., 2012), independent. blocarea receptorilor Ang II tip 1. Aici, am găsit, de asemenea, expresia genei PPAR activată în mod specific de telmisartan în celulele mezangiale, iar efectul pro-apoptotic cauzat de telmisartan celulelor mezangiale ar putea fi atenuat de inhibitorii PPAR.

PKC 1 este una dintre familiile de serin-treonin kinaze exprimate pe scară largă care transduc o gamă largă de progresii celulare prin fosforilare specifică substratului (Newton, 1995). S-a raportat că nu numai creșterea activității PKC, ci și nivelurile sale de ARNm sunt observate în biopsiile de nefropatie diabetică umană (Langham și colab., 2008). Expresia și activarea PKC indusă de hiperglicemie are efecte pleiotrope în celulele mezangiale, inclusiv promovarea acumulării excesive de proteine ​​ECM (Brownlee, 2001). Studiile au arătat că inhibarea PKC atenuează hipercelularitatea glomerulară și expansiunea matricei extracelulare la șoarecii db/db și disfuncția glomerulară la șobolanii STZ (Ishii și colab., 1996; Koya și colab., 2000). De asemenea, inhibitorul PKC a atenuat proliferarea celulelor mezangiale și producția de colagen determinate de factorul de creștere derivat din trombocite (PDGF) (Tokuyama și colab., 2011). În studiul nostru, telmisartanul a redus suprareglarea ARNm PKC 1 și expresia proteinei în celulele mezangiale stimulate de hiperglicemie. În plus, expresia TGF 1 în celulele mezangiale indusă de glucoză ridicată ar putea fi, de asemenea, inhibată de telmisartan.

Atât receptorii AT1 cât și AT2, bine cunoscuți ca șapte receptori cuplați cu proteina G care se întind pe transmembrană, au fost donați și ilustrați farmacologic (Touyz și Berry, 2002). Receptorii AT1 pot fi antagonizați selectiv de telmisartan, în timp ce blocanții receptorilor AT1 pot induce expresia receptorilor AT2 (Touyz și Berry, 2002). Studiile au arătat că receptorii AT1 își exercită influențele prin restrângerea creșterii celulare și prin provocarea apoptozei (Horiuchi și colab., 1997; Touyz și colab., 1999). În plus, receptorii AT2 induc apoptoza celulară într-o conformație specifică prin semnalizarea apoptotică mediată de p38 MAPK (Miura și Karnik, 2000). În lucrarea noastră de față, expresia ARNm AT1 și AT2 a fost neschimbată în celulele mezangiale cultivate stimulate cu telmisartan sau hiperglicemie. Prin urmare, apoptoza celulelor mezangiale induse de telmisartan și scăderea expresiei PKC 1 ar putea să nu fie mediate de receptorii AT1 și AT2.

Cistanche capsule

În concluzie, telmisartanul a atenuat prejudiciul glomerular precoce la șobolanii cu diabet de tip 1 prin inhibarea apoptozei podocitelor și promovarea apoptozei mezangiale. Efectul antiapoptotic al telmisartanului în podocite poate fi legat de inhibarea exprimării swiprosinei-1, între timp, efectul proapoptotic asupra celulelor mezangiale a fost asociat parțial cu efectul său agonist asupra PPAR. În plus, telmisartanul a blocat selectiv expresia PKC 1/TGF 1 în celulele mezangiale, dar nu și în podocite. Sunt necesare studii avansate pentru a elucida efectele opuse, dar benefice, ale telmisartanului asupra podocitelor și celulelor mezangiale și a mecanismelor moleculare subiacente.

Xin Wei 1, Yabin Ma2, Ya Li 3, Wenzhao Zhang4, Yuting Zhong5, Yue Yu6, Li-Chao Zhang5, Zhibin Wang4 și Ye Tu2

1 Departamentul de Farmacie Clinică, Spitalul Xinhua, Școala de Medicină a Universității Jiaotong din Shanghai, Shanghai, China,

2 Departamentul de Farmacie, Spitalul de Est din Shanghai, Universitatea Tongji, Shanghai, China,

3 Departamentul de farmacie clinică, Centrul de studii clinice, primul spital afiliat al primului spital medical din Shandong și spitalul provincial Qianfoshan din Shandong, Jinan, China,

4 Departamentul de Medicină Critică, Școala de Anestezie, Universitatea de Medicină Navală, Shanghai, China,

5 Departamentul de Farmacie, Spitalul Municipal de Medicină Tradițională Chineză din Shanghai, Shanghai, China,

6 Institutul de Boli Vasculare, Shanghai TCM-Integrated Hospital, Shanghai, China