Factorul inductibil de hipoxie orală, inhibitorul prolil hidroxilazei, enarodustat, contracarează modificările metabolismului energetic renal în stadiile incipiente ale bolii de rinichi diabetic.

Contact: emily.li@wecistanche.com

Introducere

Divizia de Nefrologie și Endocrinologie, Facultatea de Medicină a Universității din Tokyo, Tokyo, Japonia; Bursa de cercetare pentru tineri oameni de știință, Societatea Japoneză pentru Promovarea Științei, Tokyo, Japonia; laboratoare de cercetare biologică și farmacologică,

Institutul Central de Cercetare Farmaceutică, Japan Tobacco Inc., Takatsuki, Japonia; Departamentul de Farmacologie a Sistemelor, Facultatea de Medicină a Universității din Tokyo, Tokyo, Japonia; Laboratorul de Biologie Sintetică, Centrul RIKEN pentru Cercetare Dinamica Biosistemelor, Suita, Japonia; și WPI International Research Center for Neurointelligence, Institutele de Studii Avansate ale Universității din Tokyo (UTIAS), Universitatea din Tokyo, Tokyo, Japonia.

Inhibitorii prolil hidroxilazei factorului inductibil de hipoxie (HIF), cunoscuți și ca stabilizatori HIF, cresc producția endogene de eritropoietină și servesc ca noi agenți terapeutici împotriva anemiei.cronicrinichiboala. HIFinduce expresia diferitelor gene legate de metabolismul energetic ca răspuns adaptativ la hipoxie. Cu toate acestea, rămâne neclar modul în care țesutul intern de reprogramare metabolică prin stabilizarea HIF afectează fiziopatologiarinichi boli. Studiile anterioare sugerează că tulburările metabolice sistemice, cum ar fi hiperglicemia și dislipidemia, provoacă modificări ale metabolismului renal, ducând la disfuncție renală, inclusiv boala renală diabetică. Aici, analizăm efectele enarodustatului (JTZ-951), un stabilizator HIF oral, asupra metabolismului energetic renal în stadiile incipiente ale bolii renale diabetice, utilizând șobolani diabetici induși de streptozotocină și șoareci diabetici induși de alloxan. Analiza transcriptomului a arătat că enarodustat contracarează modificările metabolismului renal diabetic. Analiza transcriptomului a arătat că metabolizarea acizilor grași și a aminoacizilor a fost reglată în sus în țesutul renal diabetic și subreglată de enarodustat, în timp ce metabolismul glucozei a fost reglat în sens pozitiv. Aceste modificări simetrice au fost confirmate prin analiza metabolomului. În timp ce glicoliza și metaboliții ciclului acidului tricarboxilic au fost acumulați și aminoacizii s-au redus în țesutul renal al animalelor diabetice, aceste tulburări metabolice au fost atenuate de enarodustat. În plus, enarodustatina a crescut raportul glutation la glutation disulfură și a atenuat stresul oxidativ în țesutul renal al animalelor diabetice. Astfel, stabilizarea HIF contracarează modificările metabolismului energetic renal care apar la începutdiabeticrinichiboala.

Cistanche este foarte bun pentru funcția rinichilor

Declarație translativă

Inhibitorii prolil hidroxilazei factorului inductibil de hipoxie (HIF) (cunoscuți și ca stabilizatori HIF) măresc producția endogene de eritropoietină și servesc ca noi agenți terapeutici împotriva anemiei.cronicrinichiboala. Analizele noastre de transcriptom și metabolom ale țesutului renal la modelele diabetice de șobolan și șoarece au arătat că enarodustat (JTZ-951), un stabilizator oral HIF, contracarează modificările metabolismului energetic renal în stadiile incipiente ale bolii renale diabetice. Rezultatele oferă date importante pentru extrapolarea efectelor stabilizatorilor HIF asupra metabolismului energetic renal în medii clinice, deși sunt necesare studii suplimentare pentru a clarifica modul în care această reprogramare a metabolismului renal de către stabilizatorii HIF afectează progresiadiabeticrinichiboala.

Introducerea

Inhibitorii prolil hidroxilazei factorului inductibil de hipoxie (HIF) cresc producția endogene de eritropoietină și servesc ca noi agenți terapeutici împotriva anemiei cronice.rinichiboala. Celulele sunt dotate cu un mecanism de apărare împotriva hipoxiei, iar HIF este un regulator principal al acestei apărări. Rinichii sunt expuși fiziologic la hipoxie, iar hipoxia cronică este recunoscută ca o cale finală comună care duce la boala renală în stadiu terminal. Având în vedere că HIF induce expresia diferitelor gene legate de răspunsurile hipoxiei, stabilizatorii HIF ar putea avea efecte pleiotrope asupra progresieirinichiboliprecum si ameliorarea anemiei in cronicerinichiboala. Interesant este că HIF induce expresia genelor glicolitice și a piruvat dehidrogenazei kinazei, care inhibă piruvat dehidrogenazei să utilizeze piruvat pentru a alimenta ciclul acidului tricarboxilic mitocondrial (TCA). pentru adaptarea celulelor expuse la medii hipoxice. Cu toate acestea, rămâne neclar modul în care reprogramarea metabolică a țesutului renal prin stabilizarea HIF afectează fiziopatologiarinichi boli. Boala diabetică de rinichi (DKD) este cauza majoră a bolii renale în stadiu terminal. Tulburările metabolice sistemice, cum ar fi hiperglicemia și dislipidemia, provoacă modificări ale metabolismului renal, ducând la disfuncție renală, inclusiv DKD. Studiile anterioare au arătat creșterea fluxului metabolic și acumularea de glucoză și metaboliți ai ciclului TCA în țesutul cortical renal diabetic, care ar putea fi legate de disfuncția mitocondrială și progresia DKD. Am emis ipoteza că stabilizatorii HIF ar putea inversa modificările metabolismului în țesutul cortical renal diabetic, având în vedere că HIF, ca răspuns adaptativ la hipoxie, reduce fluxul metabolic în celule pentru a reprima consumul de oxigen. Astfel, utilizând analize de transcriptom și metabolom, am efectuat un studiu de dovadă a conceptului pentru a înțelege în mod cuprinzător modul în care enarodustat (JTZ-951), un stabilizator HIF oral, afectează modificările metabolismului renal care apar în stadiile incipiente ale DKD.

REZULTATE: Enarodustat induce reprogramarea metabolică de la ciclul TCA la glicoliză în celulele tubului proximal renal.

Deoarece cortexul renal este compus în principal din tubuli proximali, am examinat mai întâi efectele enarodustatului asupra fluxului metabolic al celulelor tubului proximal renal in vitro. În primul rând, testul de stres Mito (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) și analiza vitezei glicolitice (Agilent) au fost efectuate în celule HK-2 cultivate, o linie de celule epiteliale a tubului proximal uman (Figura 1a). Enarodustat a redus semnificativ respirația mitocondrială (ciclul TCA) și a crescut glicoliza bazală, indicând reprogramarea metabolică de la ciclul TCA la glicoliză (Figura 1; Figura suplimentară S1). De asemenea, am efectuat un experiment folosind ARN interferent mic (siRNA) pentru HIF -1 (Figura 2; Figura suplimentară S2). Eliminarea HIF-1 de către ARNsi a inversat modificările metabolice (respirația bazală, respirația maximă, capacitatea respiratorie de rezervă și producția de adenozin trifosfat [ATP]) induse de enarodustat, care a arătat că reprogramarea metabolică a fost în principal prin HIF-1 stabilizare (Figura 2; Figura suplimentară S2). Activitatea piruvat dehidrogenazei, un factor important pentru ca celulele să folosească piruvatul pentru a alimenta ciclul TCA, a fost, de asemenea, redusă de enarodustat (Figura 2f), care a fost compatibil cu observațiile publicate anterior.

Date de bază ale șobolanilor diabetici induși de streptozotocină

Din rezultatele experimentelor in vitro, am emis ipoteza că stabilizatorii HIF ar putea atenua modificările metabolismului în țesutul cortical renal diabetic prin reprogramarea metabolică de la ciclul TCA la glicoliză. Am ales mai întâi șobolanii diabetici induși de streptozotocină (STZ) ca model pentru experimentul de dovadă a conceptului pentru a testa ipoteza menționată mai sus. În acest model, diabetul este indus rapid, permițându-ne să observăm efectele nete ale diabetului și ale stabilizatorilor HIF asupra metabolismului energetic în țesutul renal într-o perioadă scurtă de timp. Protocolul de studiu și datele de bază din experimentele la șobolani diabetici induși de STZ sunt prezentate în Figura 3a. Am împărțit șobolanii în 3 grupuri: grupul A (fals), grupul B (DKD) și grupul C (DKD + enarodustat). Glicemia, hemoglobina glicozilata HbA1c, trigliceridele și nivelurile de colesterol total în ziua 14 au fost semnificativ crescute la grupurile cu diabet zaharat în comparație cu grupul A, în timp ce nu au existat diferențe semnificative între grupurile B și C (Figura 3d-g). Deși nivelurile plasmatice ale creatininei nu au fost diferite între grupuri, excreția urinară de albumină a fost semnificativ crescută și glomerulomegalia a fost vizibilă în grupul B în comparație cu grupul A, iar enarodustat a avut tendința de a inversa aceste modificări (Figura 4). Nivelurile de azot din ureea din sânge au fost mai mari la grupurile de diabetici, reflectând deshidratarea din cauza diabetului. În rezumat, rinichii șobolanilor tratați cu STZ din studiul nostru reprezintă stadiile incipiente ale DKD. Analizele transcriptomului și metabolomului au fost efectuate folosind țesutul cortical renal al acestor șobolani.

Analiza transcriptomului țesutului cortical renal

Rezultatele analizei transcriptomului țesutului cortical renal sunt prezentate în figurile 5 și 6. Analiza componentelor principale și analiza grupării ierarhice au indicat că grupurile A, B și C au fost separate în grupuri diferite, respectiv (Figura 5a și b). Genele exprimate diferențial au fost selectate prin │log2 fold-change (FC) │ Mai mare sau egală cu 0.5 și valoarea Q <0.05. ontologia="" genelor="" și="" analizele="" căilor="" canonice="" au="" arătat="" că="" genele="" legate="" de="" metabolismul="" acizilor="" grași="" au="" fost="" suprareglate="" în="" grupul="" b="" în="" comparație="" cu="" grupul="" a.="" în="" schimb,="" genele="" legate="" de="" metabolismul="" glucozei="" și="" răspunsul="" la="" hipoxie,="" inclusiv="" rețeaua="" hif-1,="" au="" fost="" suprareglate="" în="" grupul="" c="" în="" comparație.="" cu="" grupa="" b="" (figura="" 5c="" și="" d).="" de="" asemenea,="" am="" efectuat="" analiza="" de="" îmbogățire="" a="" setului="" de="" gene="" (gsea)="" folosind="" datele="" transcriptomice="" (figura="" 6,="" tabelele="" 1="" și="" 2).="" seturile="" de="" gene="" ale="" metabolismului="" acizilor="" grași="" și="" aminoacizilor="" au="" fost="" reglate="" în="" creștere="" în="" grupul="" b="" în="" comparație="" cu="" grupul="" a="" (figura="" 6).="" în="" schimb,="" aceste="" seturi="" de="" gene="" au="" fost="" reglate="" în="" jos,="" iar="" seturile="" de="" gene="" ale="" metabolismului="" glucozei="" au="" fost="" reglate="" în="" sus="" în="" grupul="" c="" în="" comparație="" cu="" grupul="" b,="" arătând="" că="" enarodustat="" a="" inversat="" modificările="" metabolismului="" induse="" de="" diabet="" (figura="" 6).="" mai="" mult,="" seturile="" de="" gene="" ale="" ciclului="" tca="" au="" fost="" reglate="" în="" jos="" în="" grupul="" c="" în="" comparație="" cu="" grupul="" b="" (tabelul="" 2),="" ceea="" ce="" este="" compatibil="" cu="" noțiunea="" de="" reprogramare="" metabolică="" indusă="" de="" enarodustat="" în="" tubii="" proximali="" observată="" în="" studiul="" nostru="" in="" vitro.="" în="" rezumat,="" enarodustat="" a="" contracarat="" modificările="" metabolismului="" renal="" diabetic="" din="" perspective="">

Analiza metabolomului țesutului cortical renal

Am măsurat concentrațiile absolute a 116 metaboliți legați de energie în țesutul cortical renal al șobolanilor (n =4, pentru fiecare grup) selectați aleatoriu din fiecare grup (Tabelul suplimentar S1; Figura suplimentară S3). Analiza discriminantă parțială a celor mai mici pătrate (PLS-DA) a fost efectuată pentru a evalua semnificația discriminării de clasă (Figura 7). Am efectuat analiza de îmbogățire a setului de metaboliți (MSEA) utilizând metaboliții cu importanță variabilă în proiecție (VIP) PLS-DA de 1 USD. Diferențele în metabolismul aminoacizilor, cum ar fi glicină, serină, metionină, aspartat, glutamat, arginină, prolină, și b-alanina între grupurile A și B au fost notate. S-au observat diferențe în metabolismul aminoacizilor și între grupele B și C. Mai mult, procesele de metabolism al glucozei, precum glicoliza și gluconeogeneza, au prezentat tendințe diferite între grupele B și C (Figura 7).

Vizualizarea datelor transcriptomului și metabolomului pe harta căilor metabolice energetice

Am vizualizat datele transcriptomului și metabolomului pentru o înțelegere cuprinzătoare a modificărilor metabolismului energetic (Figura 8). S-a constatat că glicoliza și metaboliții ciclului TCA sunt acumulați în grupul B în comparație cu grupul A, ceea ce s-ar putea datora afluxului excesiv de glucoză și reglării în creștere a metabolismului acizilor grași în DKD. Concentrația de aminoacizi a fost redusă în grupul B comparativ cu grupul A, reflectând reglarea în creștere a metabolismului aminoacizilor (Figura 8a). În schimb, acumularea metaboliților de glicoliză a fost ameliorată de enarodustat, datorită fluxului facilitat de glicoliză. Enarodustat a inversat, de asemenea, modificările induse de diabet în metaboliții și aminoacizii ciclului TCA (Figura 8b). Mai mult, enarodustat a atenuat acumularea de disulfură de glutation (GSSG) în țesutul renal diabetic și, astfel, a arătat un raport glutation/GSSG mai mare, ceea ce sugerează că enarodustat a atenuat stresul oxidativ în DKD (Figura 8a și b). Reducerea stresului oxidativ a fost confirmată de nivelurile markerului de peroxidare a lipidelor malondialdehidei în țesutul cortical renal: enarodustat a inversat acumularea de malondialdehidă în țesutul cortical renal diabetic (Figura suplimentară S4). În rezumat, integrarea datelor transcriptomului și metabolomului a demonstrat că enarodustat contracarează modificările metabolismului energetic renal care apar în stadiile incipiente ale DKD.

Alterările metabolice simetrice (diabet vs. enarodustat) sunt confirmate într-un model alternativ

Am efectuat analiza transcriptomului la șoareci diabetici induși de alloxan, un alt model animal de diabet, pentru a confirma descoperirile noastre în modelul de șobolan. Protocoalele de studiu și datele de bază pentru modelul de șoarece sunt prezentate în Figura 9. Excreția urinară de albumină a fost crescută semnificativ în grupul B în comparație cu grupul A, care a fost inversată de enarodustat (Figura 9d). În plus, am aplicat o analiză 3-dimensională cuprinzătoare (Cocktailuri clare, neobstructive pentru imagistica corporală/creier și analiză computațională [CUBIC] – rinichi)16 pentru a vizualiza glomerulii din rinichi. Glomerulomegalia a fost vizibilă în grupul B în comparație cu grupul A, care a fost inversată de enarodustat (Figura 9e). Analiza transcriptomului țesutului renal la șoarecii diabetici induși de alloxan a arătat modificări simetrice ale metabolismului (diabet vs. enarodustat) în același mod ca și în modelul de șobolan diabetic indus de STZ (Figura 10): metabolismul acizilor grași a fost reglat în plus de diabet, în timp ce glucoza metabolismul a fost suprareglat de enarodustat. Mai mult, metabolismul aminoacizilor a fost reglat în sus de diabet și reglat în jos de enarodustat. Astfel, enarodustat a contracarat modificările metabolismului energetic renal care apar în stadiile incipiente ale DKD în modelul de șoarece diabetic indus de alloxan, precum și în modelul de șobolan diabetic indus de STZ.

DISCUŢIE

În acest studiu, am demonstrat că enarodustat (JTZ-951), un stabilizator HIF oral, contracarează modificările metabolismului energetic renal care apar în stadiile incipiente ale DKD la modelele de diabet la șobolani și șoareci. Analizele transcriptomului și metabolomului au arătat modificări simetrice ale metabolismului în țesutul renal (diabet versus enarodustat): metabolismele acizilor grași și aminoacizilor au fost reglate în creștere în DKD, în timp ce enarodustat a reglat în jos aceste căi și, în plus, a reglat metabolismul glucozei (Figurile 5-10).

Nu a fost pe deplin elucidat dacă stabilizarea HIF are efecte protectoare asupra patofiziologiei DKD sau nu. Studiile anterioare au arătat că țesutul renal diabetic este expus la hipoxie17, iar expresia HIF în țesutul renal diabetic este insuficientă pentru a răspunde la condițiile lor hipoxice, care este parțial cauzată de stresul oxidativ.18 Stabilizarea HIF cu clorură de cobalt a îmbunătățit starea de stres oxidativ și a redus proteinuria și leziuni tubulointerstițiale în DKD indusă de STZ.19 Rezultatele studiului pe animale au indicat, de asemenea, că stabilizarea HIF a protejat împotriva dezvoltării obezității20, a îmbunătățit sensibilitatea la insulină20 și a scăzut nivelul de colesterol seric.21 Aceste rezultate sugerează efectele protectoare ale stabilizării HIF în dezvoltarea DKD. În schimb, stabilizarea suprafiziologică a HIF prin deleția von Hippel-Lindau a fost raportată că induce fibroză renală.22 Rolul stabilizării HIF în progresia DKD poate fi dependent de context, având în vedere efectele pleiotrope ale HIF și existența unor fenotipuri DKD variate. Scopul acestui studiu a fost de a clarifica efectele nete ale stabilizării HIF asupra metabolismului energetic la rinichiul diabetic. Rapoartele anterioare au indicat că în DKD apar modificări ale metabolismului energetic. Sas et al.10 au arătat o creștere a fluxului metabolic de energie și acumulare de metaboliți ai glucozei în țesutul cortical renal diabetic, care ar putea fi legată de disfuncția mitocondrială. You et al.23 au raportat că fumaratul, un metabolit al ciclului TCA, a fost acumulat în țesutul renal diabetic și a contribuit direct la progresia DKD. Am arătat anterior că metaboliții ciclului TCA s-au acumulat în țesutul renal diabetic, care a fost inversat prin inhibarea cotransportatorului sodiu-glucoză 2 sau restricția calorică.11 Mai mult, Qi și colab.24 au arătat că enzimele din căile glicolitice, inclusiv piruvat kinaza M2 (PKM2), au fost supraregulate la pacienții cu diabet zaharat de tip 1 fără DKD în comparație cu pacienții cu DKD. Activarea PKM2 a inversat acumularea metaboliților de glicoliză și a restabilit funcția mitocondrială, parțial prin creșterea fluxului glicolitic.24,25 Aceste rapoarte anterioare sugerează că acumularea de glicoliză și metaboliții ciclului TCA ar putea afecta progresia DKD, care poate fi atenuată prin glicoliză facilitată, inclusiv PKM2. activare. În studiul nostru, stabilizarea HIF de către enarodustat a inversat modificările metabolismului energetic și a atenuat acumularea de glicoliză și metaboliți ciclului TCA în țesutul cortical renal diabetic (Figura 8). Expresia enzimelor glicolitice, inclusiv PKM2, a fost, de asemenea, reglată de enarodustat (Figura suplimentară S4B). Mai mult, enarodustat a atenuat acumularea de GSSG și a crescut raportul glutation/GSSG, ceea ce sugerează că enarodustat a atenuat stresul oxidativ în DKD (Figura 8). Această reducere a stresului oxidativ indusă de enarodustat a fost confirmată și de modificările nivelurilor de malondialdehidă în țesutul cortical renal (Figura suplimentară S4A). Aceste rezultate sugerează că stabilizarea HIF ar trebui să aibă roluri protectoare asupra patofiziologiei DKD cel puțin din perspective metabolice. Este cert că nu putem examina dacă reprogramarea metabolică prin stabilizarea HIF are efecte directe asupra progresiei DKD, deoarece poate fi imposibil de a discerne efectele nete ale modificărilor metabolismului asupra rezultatului renal datorită rolului pleiotrop al HIF. Cu toate acestea, în studiul nostru, excreția urinară ușoară de albumină și anomaliile patologice renale (glomerulomegalie și îngroșarea membranei bazale glomerulare) induse de diabet au fost atenuate de enarodustat, în asociere cu normalizarea metabolismului energetic renal. Am extras genele ale căror modificări de expresie s-au corelat cu nivelurile de albumină urinară (257 de sonde; 232 de gene) din datele microarray din modelul de șoarece diabetic indus de alloxan și am efectuat analiza de îmbogățire a căii (Figura suplimentară S5). Ca rezultat, căile legate de membrana mitocondrială și transportul de electroni respiratori sunt reglate în sens pozitiv asociate cu nivelurile de albumină urinară, ceea ce indică faptul că sarcina mitocondrială este strâns legată de excreția urinară de albumină. Astfel, există posibilitatea ca normalizarea metabolică a țesutului renal diabetic de către stabilizatorii HIF să reducă sarcina mitocondrială și să atenueze progresia DKD. Datele noastre sugerează patofiziologia DKD din perspective metabolice, după cum urmează: Hiperglicemia creează necesar de energie pentru reabsorbția glucozei în tubii proximali renali; astfel, ciclul TCA din mitocondrii este activat forțat pentru a satisface cererea de energie în stadiile incipiente ale DKD (reglarea în creștere a metabolismului acizilor grași și a aminoacizilor). Iar stabilizatorii HIF ar putea atenua această povară mitocondrială prin reprogramarea metabolică de la ciclul TCA la glicoliză (reglarea în jos a metabolismului acizilor grași și a aminoacizilor și reglarea glicolizei), care ar putea avea roluri protectoare împotriva progresiei DKD. Sunt necesare studii suplimentare, inclusiv omice unicelulare, pentru a clarifica modul în care sarcina mitocondrială din țesutul renal afectează în mod direct patofiziologia DKD. O altă întrebare interesantă este dacă stabilizatorii HIF afectează direct absorbția glucozei în tubii proximali. Datele noastre in vitro au arătat că producția de ATP este redusă semnificativ de enarodustat prin reprogramarea metabolică de la ciclul TCA la glicoliză (Figurile 1 și 2). Având în vedere că ATP este necesar pentru reabsorbția glucozei de către cotransportatorul sodiu-glucoză 2, am emis mai întâi ipoteza că reabsorbția glucozei ar putea fi inactivată de enarodustat. Cu toate acestea, nivelurile de glucoză urinară nu au fost semnificativ diferite între grupul B și grupul C la ambele modele animale (Figura suplimentară S6). Probabil, reducerea producției de ATP de către enarodustat este mult mai ușoară într-o situație fiziologică comparativ cu efectul său in vitro; astfel, stabilizarea HIF nu afectează absorbția glucozei prin cotransportatorul sodiu-glucoză 2, cel puțin în experimentele noastre pe animale. Studiul nostru a avut 2 limitări. În primul rând, am folosit șobolani diabetici induși de STZ și șoareci diabetici induși de alloxan ca modele DKD în stadiu incipient și am observat efectele pe termen scurt ale stărilor diabetice. Cu toate acestea, în cadrul clinic, stabilizatorii HIF ar fi administrați la pacienții cu anemie în DKD în stadiu avansat. Sunt necesare mai multe studii pentru a înțelege efectul stabilizării HIF asupra modificărilor metabolismului renal în DKD în stadiu avansat. În al doilea rând, studiului îi lipsea o putere statistică suficientă în ceea ce privește dispersia concentrațiilor metaboliților în datele metabolomului, în timp ce datele transcriptomului aveau o putere statistică suficient de mare pentru a clarifica întreaga imagine a metabolismului energetic. Deoarece nu mulți metaboliți au arătat o diferență semnificativă între grupuri, am efectuat PLS-DA și am selectat metaboliții cu un scor PLS-DA VIP mai mare sau egal cu 1 pentru MSEA. Deși este dificil să se verifice încrucișat o modificare metabolică folosind numai datele metabolomice, rezultatele analizei metabolomului au fost compatibile cu datele transcriptomice (Figurile 7 și 8), oferind un sprijin suplimentar pentru efectele observate ale modificărilor transcriptomului asupra metabolismului energetic renal. În concluzie, enarodustat (JTZ-951), un stabilizator HIF oral, contracarează modificările metabolismului energetic renal în stadiile incipiente ale DKD. Studiul nostru sugerează că stabilizarea HIF poate servi ca o intervenție potențială care vizează metabolismul energetic dereglat renal în DKD.

METODE

Testul de stres mito și analiza vitezei glicolitice

Celulele HK-2 au fost însămânțate pe o microplacă de 96-godeuri la o densitate de 1 * 10⁴celule/puţ. În ziua următoare, fluxul metabolic a fost măsurat în timp real de Seahorse XFe96 Analyzer (Agilent) utilizând kitul Mito Stress Test Kit (103015-100; Agilent) sau Kitul de analiză a ratei glicolitice (103344- 100; Agilent). Concentrațiile de glucoză, piruvat și glutamină în mediul de cultură au fost de 10 mmol/l, 1 mmol/l și, respectiv, 2 mmol/l.

transfecția siARN

Eliminarea HIF-1 a fost efectuată de Stealth RNAi pentru HIF1A uman (HSS104774 [#1] și HSS104775 [#2]; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Stealth RNAi siRNA Negative Control Med GC Duplex #2 (12935112; Thermo Fisher Scientific) a fost utilizat ca control negativ.

Western blot

Anticorpii primari utilizați pentru colorare au fost anticorpul anti-HIF-1 uman (policlonal de iepure, 1:500; Novus Biologicals, Littleton, CO) și anticorpul anti-actină uman (policlonal de iepure, 1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Un anticorp secundar a fost anticorpul IgG de capră anti-iepure conjugat cu peroxidază de hrean (170-6515, 1:5000; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

Experimente pe animale

Şobolani Crl: CD (Sprague Dawley) şi şoareci Crl: CD1 (Institutul de Cercetare a Cancerului) au fost obţinuţi de la Charles River Laboratories Japan Inc. (Yokohama, Japonia). Toate experimentele au fost aprobate de Consiliul Instituțional de Revizuire al Universității din Tokyo (numărul de aprobare P17-110). Toate procedurile pe animale au fost efectuate conform ghidurilor National Institutes of Health (Ghid pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator). Protocoalele de studiu sunt prezentate în figurile 3 și 9.

Analiza transcriptomului

ARN-ul total din țesutul cortical renal a fost izolat utilizând kit-ul GenElute Mammalian Total ARN Miniprep (RTN7{{10}}; Sigma-Aldrich). ARN total (100 ng) a fost etichetat utilizând Kitul de etichetare cu amplificare rapidă cu intrare scăzută (Agilent) și apoi hibridizat cu SurePrint G3 Rat GE v2 8x60K Microarray (pentru șobolan; Agilent) și SurePrint G3 Mouse GE v{{7 }}x60K Microarray (pentru mouse), respectiv. Toate experimentele cu microarray au fost efectuate de DNA Chip Research Inc. (Tokyo, Japonia). Datele brute au fost procesate cu pachetul R limma în Bioconductor (http://www.bioconductor.org/) pentru a efectua corecția de fundal și normalizarea datelor folosind metoda de normalizare cuantilă. Efectele lotului au fost eliminate de ComBat (Bioconductor) în experimentul cu șobolani. Genele exprimate diferențial au fost determinate de│log2 FC│ mai mare sau egală cu 0,5 și valoarea Q < 0,05.="" analizele="" ontologiei="" genetice="" și="" a="" căilor="" canonice="" au="" fost="" efectuate="" utilizând="" motorul="" de="" corelare="" basespace="" (illumina,="" san="" diego,="" ca).="" datele="" microarray="" au="" fost="" depuse="" în="" centrul="" național="" pentru="" informații="" biotehnologice="" gene="" expression="" omnibus="" ca="" seriile="" gse131221="" (șobolan)="" și="" gse139317="">

Analiza îmbogățirii setului de gene

GSEA este o metodă de calcul care determină dacă un set de gene definit a priori prezintă diferențe semnificative statistic, concordante între 2 stări biologice. GSEA a fost efectuată utilizând GSEA v.3.0 (Broad Institute, Cambridge, MA). Căile cu o rată de descoperire falsă < 0.25="" au="" fost="" considerate="">

Analiza metabolomului

Măsurătorile metabolomului au fost efectuate de Human Metabolome Technologies Inc. (Tsuruoka, Japonia). Concentrațiile metaboliților au fost calculate prin normalizarea zonei de vârf a fiecărui metabolit în raport cu aria standardului intern și prin utilizarea curbelor standard, care au fost obținute din 3-calibrări punctuale. Vezi și Metodele suplimentare.

Analiza îmbogățirii setului de metaboliți

Analiza datelor metabolomice a fost efectuată utilizând platforma integrată bazată pe web MetaboAnalyst 4.0. A fost efectuat PLS-DA și au fost calculate scorurile VIP asociate. Metaboliții cu scor PLS-DA VIP mai mare sau egal cu 1 au fost utilizați pentru MSEA.

Cuantificarea ariilor glomerulare în patologiile renale

Am luat aleatoriu 3 imagini patologice din imaginea de colorare periodică acid-Schiff a fiecărei probe și am măsurat fiecare zonă glomerulară, respectiv, folosind Fiji (o distribuție a ImageJ; National Institutes of Health, Bethesda, MD).

CUBIC-rinichi

Imagistica 3-dimensională cuprinzătoare a glomerulilor din țesutul renal a fost efectuată folosind CUBIC conform lucrărilor noastre anterioare. Pe scurt, rinichii fixați de șoarece au fost scufundați în CUBIC-L pentru delipidare și apoi supuși colorării imunofluorescente. În cele din urmă, indicele de refracție a fost egalat prin plasarea probelor în CUBIC-R plus. Imagini cuprinzătoare 3D-dimensionale de la rinichi transparenți au fost obținute cu microscopie cu fluorescență cu foaie de lumină personalizată (MVX10-LS; Olympus, Tokyo, Japonia). Anticorpul primar utilizat pentru colorare a fost anticorpul anti-podocină (policlonal de iepure, 1:100, P0372; Sigma-Aldrich). Anticorpul secundar a fost Alexa Flour 555- IgG anti-iepure de măgar conjugat (1:100, A-31572; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).

analize statistice

Pentru comparații multiple, s-a aplicat {{0}}analiza varianței, urmată de testele post-hoc de comparații multiple Tukey, dacă este cazul. Toate analizele statistice au fost efectuate cu software-ul GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, San Diego, CA). P < 0,05="" a="" fost="" considerat="" semnificativ="" statistic.="" datele="" sunt="" prezentate="" ca="" medie="" ±="">

DEZVĂLUIRE

MN a primit onorari, taxe de consiliere sau finanțare pentru cercetare de la KyowaHakko-Kirin, Akebia, Astellas, Chugai, GlaxoSmithKline, Japan Tobacco Inc. (JT), Torii, Tanabe-Mitsubishi, Daiichi-Sankyo, Takeda, Ono, Bayer, Boehringer Ingelheim și Alexion. TT a primit un grant de cercetare de la JT. Enarodustat (JTZ-951) a fost furnizat de JT, Tokyo, Japonia. EAS și HRU sunt coinventatori ai brevetelor deținute de RIKEN. O parte a acestui studiu a fost realizată în colaborare cu Olympus Corporation și cu un software amabil susținut de Bitplane. Celălalt autor a declarat că nu există interese concurente.

MULȚUMIRI

Suntem recunoscători Dr. Shuhei Yao și Dr. Shinji Tanaka pentru discuțiile valoroase. De asemenea, mulțumim Dr. Tsuyoshi Inoue, Dr. Satoru Fukuda și doamnei Kahoru Amitani pentru suportul tehnic. Această lucrare a fost realizată parțial cu sprijinul Centrului de Știință Izotopică, Universitatea din Tokyo. Această lucrare a fost susținută de bursier de cercetare Grant-in-Aid for Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (JSPS KAKENHI grant 19J11928 către SH), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (JSPS KAKENHI grant 18H02824 către MN) ), Grant în ajutor pentru cercetare științifică (C) (grant JSPS KAKENHI 17K09688 către TT) și Grant în ajutor pentru cercetare științifică în domenii inovatoare (grant KAKENHI 26111003 către MN).