Arhitectura tridimensională a nefronilor în rinichiul normal și chistic
Mar 17, 2022
pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com
Thomas Blanc1,2,7, Nicolas Goudin3,7, Mohamad Zaidan1,4,7, Meriem Garfa Traore3, Frank Bienaime1,5,Lisa Turinsky1, Serge Garbay1, Clement Nguyen1, Martine Burtin1, Gerard Friedlander1,6, Fabiola Terzi1,8și Marco Pontoglio1,8
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U1151, Centre National de la Recherche Scientifique UMR8253, Université de Paris, Institut Necker Enfants Malades, Département « Croissance et Signalisation », Paris, Franța;2Service de Chirurgie Viscérale etUrologie Pédiatrique, AP-HP, Hôpital Necker Enfants Malades, Paris, Franța;3Structure Fédérative de Recherche Necker, SUA24-UMS3633, Paris, Franța; 4Service de Néphrologie-Transplantation, AP-HP, Hôpital Bicêtre, Le Kremlin-Bicêtre, Franța;5Service d'ExplorationsFonctionnelles, AP-HP, Hôpital Necker Enfants Malades, Paris, Franța; și6Service d'Explorations Fonctionnelles, AP-HP, HôpitalEuropéen Georges Pompidou, Paris, Franța
CUVINTE CHEIE: chisticrinichiboala;rinichi; nefron; nefronoftiză; curățarea țesuturilor
Declarație translativă
Metodele de curățare oferă un instrument unic pentru înțelegerea modului în care modificările morfologice duc la consecințe patologice.Rinichisunt organe critice care mențin homeostazia corpului prin manipularea apei, metaboliților și electroliților, care depind în mod esențial de structura 3-dimensională complexă anefroni.Când această organizare structurală este alterată, apare fiziopatologia renală. În studiul de față, am dezvoltat o metodă puternică bazată pe curățare optică, microscopie multifotonă și urmărire digitală pentru a studiarinichila nivel de un singur nefron în condiţii fiziologice şi patologice. În special, oferim prima reconstrucție 3-dimensională a unui rinichi policiclic la scara unui singurnefroni. Această metodă poate fi aplicată în mai multe contexte patologice, permițându-ne să înțelegem mai bine procesul complex de deteriorare a rinichilor și, în consecință, să dezvoltăm strategii terapeutice mai țintite.
Rinichiul menține homeostazia corpului prin intermediul complexului său3-dimensională(3D) structura nefronului. Când această organizare structurală este modificată, apare fiziopatologia renală. Cronicrinichibolile sunt caracterizate prin dezvoltarea leziunilor renale. În mod intrigant, patologii au raportat o mare eterogenitate în distribuția leziunilor în timpul bolilor cronice de rinichi. Pentru a rezolva această problemă, este obligatoriu să reconstruiți 3D (Tridimensional) forma denefroniîn contexte patologice.
Pentru cunostinta noastra,nefroniau fost reconstruite complet doar folosind secțiuni 2D în serie.3–5 Deși secționarea histologică standard oferă o rezoluție înaltă, reconstrucțiile 3D sunt laborioase și greu de obținut. Acest lucru se datorează în primul rând distorsiunilor mecanice, care este un efect inevitabil al procedurii de tăiere. În plus, reconstrucția 3D (din imagini 2D nu permite imaginea directă a structurilor 3D în țesuturi montate întreg.
Microscopia multifotonica ne-a îmbunătățit capacitatea de a detecta modificări morfologice în secțiuni groase. Cu toate acestea, o limitare semnificativă este adâncimea accesibilă mică din cauza împrăștierii luminii. Prin reducerea la minimum a diferențelor de indice de refracție, agenții de curățare au îmbunătățit dramatic capacitatea de a face imagini la adâncime. -17 Studii recente au demonstrat potențialul lor pentru imagistica altor organe solide, cum ar fi ficatul, pancreasul saurinichi.18–26
Polichisticrinichiboala, o afecțiune eterogenă genetic care implică mutații în mai multe gene ciliare, este cea mai frecventă boală ereditară de rinichi.27,28 Polichisticărinichiboala este caracterizată prin dezvoltarea chisturilor care duc la distrugerea completă a rinichiului.28 Studiile de microdisecție au sugerat că chisturile se pot dezvolta fie ca o „împingere în afara” a unui segment de nefron, ca în boala polichistică de rinichi autosomal dominantă; ca expansiune extatică a conductelor colectoare (CD), ca în polichisticul autozomal recesivrinichiboala; sau exclusiv în tubii medulari, ca în nefronoftiză (NPHP).27,29 Cu toate acestea, cum se dezvoltă chisturile în 3D (Tridimensional) și se organizează între ele și tubuleze normale vecine încă necunoscute.
Aici, am combinat curățarea optică cu microscopia multifotonică pentru a oferi noi perspective despre cumnefronisunt modelate și organizate în condiții fiziologice și cum sunt modificate în timpul bolii, cum ar fi cistogeneza. Rezultatele noastre demonstrează că există 3 tipuri denefroniși că vasele pot influența organizarea spațială a nefronilor. În mod interesant, am observat că nefronii tind să se afle în planuri specifice. În mod neașteptat, atunci când am aplicat această tehnică la șoareci, am observat că chisturile s-au dezvoltat doar în segmente specifice de nefroni cu chisturi fusiforme amestecate cu tubuli normali.
Apasa peCistancheefecte secundarepentru boli de rinichi
REZULTATE
Setare experimentala
Pentru a studia forma întreguluinefroniîn raport cu mediul lor, am adoptat o tehnică bazată pe clarificare optică și microscopie multifotonă (Figura suplimentară S1A). Prin compararea diferitelor protocoale de curățare optică, am stabilit că pentrurinichi, alcoolul benzilic/benzoatul de benzii (BABB) a fost cel mai potrivit din punct de vedere al eficacității (Figura suplimentară S1B și C și Tabelul suplimentar S1).
3D (Tridimensional) reconstrucția și urmărirea digitală necesită imagini de înaltă calitate, cu rezoluție înaltă și un raport semnal-fond ridicat. Am observat că semnalul optic furnizat de fluorescența nativă nu a fost uniform pe secțiunile de rinichi. În special, imaginile din medulare au fost slab contrastate cu un raport semnal-fond scăzut (Figura suplimentară S2). Pentru a îmbunătăți raportul semnal-fond, secțiunile colorate cu acid periodic – Schiff (Figura suplimentară S1D), deoarece am observat empiric că această colorare a dat naștere la un contrast ridicat în secțiunile subțiri în timpul fotonfluorescenței. Cu toate acestea, semnalul nu a fost uniform pe tot parcursul acidului periodic gros, colorat cu Schiffrinichisecțiuni (Figura suplimentară S1E). Prin urmare, am colorat secțiunile de rinichi cu lectine cuplate cu fluorocrom: aglutinină de arahide și aglutinină din germeni de grâu, care colorează glomeruli și tubulii, și aglutinină Griffonia simplicity I folia, care marchează vasele de sânge.30 Remarcabil, cu combinația acestor lectine, raportul semnal-fond. a crescut dramatic în secțiunile întregi de rinichi, cu o îmbunătățire semnificativă atât în planul XY, cât și în axa z (figura suplimentară S1E și filmul suplimentar S1).
Vizualizare 3D a segmentului de nefron
Pentru a vizualiza forma întreguluinefroni, le-am urmărit căile, începând de la polul urinar al glomerulului și terminând la joncțiunea CD (film suplimentar S2). În ciuda faptului că lectinele utilizate leagă la nivel global toate segmentele de nefron, am observat că atunci când au fost inspectate cu atenție, aceste lectine au fost caracterizate printr-un model specific în modul în care au colorat membranele bazale sau luminale în diferitele segmente de nefron. Cu alte cuvinte, am profitat de modelul stereotip al colorării cu lectină pentru a identifica diferitele segmente de nefron. În acest fel, am putea identifica cu ușurință 6 entități: tubul proximal (PT), membrul subțire (TL) al Henleloop (HL), membrul ascendent gros (TAL) al HL, tubul contort distal (DCT), tubul de legătură (CNT), și CD. Tranziția între PT și TL a fost caracterizată prin pierderea bruscă a semnalului tipic de margine a periei PT și prin scăderea lățimii lumenului, care era aproape practic absentă în TL (Figura 1a). În schimb, tranziția între TL și TAL a fost caracterizată printr-o creștere semnificativă a diametrului tubular extern și a lățimii lumenului relativ constantă (Figura 1b). La toți nefronii, tranziția TAL la DCT a fost găsită sistematic la polul vascular al glomerulului. Această tranziție a fost caracterizată printr-o mărire bruscă a diametrului tubular extern, care s-a datorat în principal creșterii semnificative a diametrului lumenului (Figura 1c). Tranziția dintre DCT și CNT a fost caracterizată prin reducerea atât a diametrului tubular, cât și a lumenului (Figura 1d). În cele din urmă, conexiunea dintre CNT și CD cortical a fost caracterizată printr-o creștere bruscă atât a diametrului tubular, cât și a lumenului (Figura 1e). Cuantificarea acestor tranziții morfologice a fost semnificativă statistic (Figura 1f), iar pertinența sa a fost verificată prin colorare cu markeri tubulari specifici (Figurile suplimentare S3-S5 și Filmul suplimentar S3-S5).
Forma și dimensiunea PT diferă în funcție de adâncimea lor
Colorarea groaserinichisecțiunile ne-au permis să urmărim coordonatele evoluției spațiale ale întregilor segmente PT. În mod interesant, am descoperit că forma lor era extrem de variabilă și determinată de poziția glomerulilor lor în cortex. La nivel global, am identificat 3 modele. Primul corespundea celui mai superficialnefroni(SNs) (Figura 2a; Film suplimentar S6), care a ocupat cea mai externă parte a cortexului (cea mai externă 30% aproape de capsula renală). Părțile lor întortocheate au format structuri compacte cu doar 6 până la 7 circumvoluții în jurul propriului glomerulus, ocupând spații foarte mici și strâns strâns. Convoluția acestor SN s-a terminat în parți drepte lungi și drepte care au coborât în medular. La capătul opus al acestui spectru, am observat un al doilea model de nefroni situat în partea cea mai profundă a cortexului (cu 40% mai multă adâncime internă), lângă medulă (nefroni juxtamedulari [JNs]) (Figura 2a; Figura suplimentară S6 și Film suplimentar) S6). PT-urile lor au fost caracterizate printr-o buclă scurtă inițială care a coborât sistematic spre papilă și apoi U sa întors pentru a urca spre capsula renală. Spre deosebire de SN, tubulii contorți proximali JN au fost caracterizați de bobine mari care au evoluat în jurul propriului glomerulus și au ocupat domenii mari, slab împachetate în cortexul juxtamedular. Partea întortocheată a PT a JN-urilor avea 10 până la 15 convoluții, formând domenii mari. În cele din urmă, al treilea model a inclus nefroni localizați în porțiunea mijlocie a cortexului (nefroni mijlocii [MNs]) (Figura 2a; Film suplimentar S6). Interesant, acești tubuli aveau formă și orientare spațială care reprezentau o tranziție între SN și JN. De fapt, au conținut 8 până la 9 circumvoluții cu bobine care erau mai mari decât SN-urile, dar mai mici decât JN-urile. În plus, MN-urile aveau pars recta mai lung decât JN-urile. Interesant, o comparație globală a formelor PT-urilor a arătat că SN-urile și MN-urile aveau un model omogen, în timp ce JN-urile erau extrem de eterogene (Figura suplimentară S6). În plus, reconstrucția spațială a mai multornefroni a dezvăluit că PT nu se amestecă niciodată (SupplementaryMovie S6), ceea ce indică faptul că fiecare nefron ocupă propriul spațiu individual în cortex.
Analizele morfometrice au confirmat diferențele mari în dimensiunea și forma SN-urilor și JN-urilor, cu un aspect intermediar pentru MN-uri. PT-ul JN-urilor a fost de 2-ori mai mult decât PT-ul SN-urilor (Figura 2b); cu toate acestea, dreptatea a fost mai mare în SN decât în JN (Figura 2c), în concordanță cu observația că tubii JN au fost mult mai tortuosi (Figura 2a; Figura suplimentară S6).
Figura 1|Criterii morfologice utilizate pentru identificarea segmentelor de nefron. (a–e) Morfologia diferitelor segmente ale șoarecilor nefron care nu controlează.Nefroniau fost urmărite de la polul urinar al glomerulului până la canalul colector (tubul proximal [PT]: turcoaz; membru subțire[TL] al ansei Henle: gri deschis; membru gros ascendent [TAL] al ansei Henle: gri închis; distal tubul contort [DCT]: roz; tubul de conectare [CNT]: galben; canalul colector cortical [CCD]: portocaliu). Săgețile indică diametrul diferitelor segmente de nefron. (Continuare)
Figura 1|(Continuare) (f) Cuantificarea diametrului tubular exterior al diferitelor segmente de nefron. Datele sunt exprimate ca medie±SEM.Analiza varianței urmată de testul Tukey-Kramer: **P < 0.01, ***P < 0,001.
Figura 2 |Tridimensional(3D) reconstrucția tubului proximal dezvăluie 3 forme și organizări diferite. (a) Imagini reprezentative de reconstrucție 3D ale tubilor proximali prin întreg cortexul renal, împărțite în 3 niveluri (linii albe) în funcție de forma tubilor proximali (PT): cortexul superficial (albastru), mijlociu (verde) și juxtamedular (roșu), corespunzând la 30 la sută exterioară, la 30 la sută mijlocie și, respectiv, la 40 la sută interioară a cortexului. Observați diferitele forme ale celor 3 tipuri denefroniși în special lungimea și tortuozitatea tubilor juxtamedulari. Bară{{0}} mm. (b,c) Cuantificarea (b) lungimea și (c) dreptatea celor 3 tipuri de tubuli proximali. (d) Cuantificarea volumului de glomeruli din fiecare regiune a cortexului. Datele sunt exprimate ca SEM mediu. Analiza varianței urmată de testul Tukey-Kramer: PT juxtamedular versus PT superficial: ###P < 0.001;="" pt="" juxtamedular="" versus="" pt="" mijlociu:="" ***p="">< 0,001;="" pt="" superficial="" versus="" pt="" mijlociu:="" $$$p=""><>
Figura 3 |TridimensionalReconstrucția nefronului (3D) dezvăluie 3 tipuri diferite de nefroni. (a) Imagini 3D reprezentative ale întregului nefron (panourile din stânga) de la glomeruli până la canalul colector din cortexul superficial (albastru), cortexul mijlociu (verde) și regiunea juxtamedulară (roșu) la șoarecii de control. Segmentarea nefronilor (panourile din dreapta) pentru cele 3 tipuri diferite de nefroni. Bară=150 mm. (b) Cuantificarea distanței interioare dintre cele 2 membre ale ansei Henle pentru cele 3 tipuri de nefroni. (c) Cuantificarea lungimii nefronului pentru (continuare)
Figura 3|(continuare) 3 tipuri denefroni. (d) Cuantificarea lungimii diferitelor segmente ale nefronului în funcție de tipul de nefron. Datele sunt exprimate ca medie±SEM. Analiza varianței urmată de testul Tukey-Kramer: nefron juxtamedular (JN) versus nefron superficial (SN): ###P < 0.001;="" jn="" versus="" nefron="" mediu="" (mn):="" *p="">< 0,05,="" **p=""><0,01, ***p=""><0,001. cnt,="" tubul="" de="" legătură;="" dct,="" tubul="" distalconvolut;="" pt,="" tubul="" proximal;="" tal,="" membru="" gros="" ascendent="" al="" ansei="" henle;="" tl,="" membru="" subțire="" al="" buclei="">
Dimensiunea glomerulare variază în funcție de adâncime
Am analizat apoi adâncimea și diametrul glomerularelor selectate aleatoriu din fiecare dintre cele 3 zone. Analizele morfometrice au arătat că glomerulii erau localizați în medie la 783 și 355 mm de capsula renală în JN și, respectiv, SN. După cum sa raportat anterior, am observat că mărimea glomerulilor variază în funcție de adâncimea lor. În special, volumul glomerular al JN a fost de 3 ori mai mare decât cel al SN și MN (Figura 2d).
Reconstrucție 3D a nefronului
Am urmărit apoi evoluția spațială a întreguluinefronide la PT la CNT. Vederea globală a 3D-ului lor (Tridimensional) reconstrucția a confirmat că forma nefronului diferă între SN, MN și JN (Figura 3a; Film suplimentar S7). Această diferență sa datorat în principal structurii PT. În plus, am observat că HL avea o organizare spațială 3D diferită. În special, TL și TAL au fost separate mai departe în JNs decât în SN și MN (Figura 3b). Analizele morfometrice au arătat că JN-urile au fost la nivel global de 2-ori mai lungi decât SN-urile (Figura 3c). Lungimea crescută a fost distribuită proporțional în toate segmentele, cu excepția TAL și DCT, care tindeau să aibă o lungime absolută similară în toate tipurile de nefroni (Figura 3d). Acest lucru a sugerat că alungirea nefronului este un proces surprinzător de omogen.
Vasele arcuate influențează convoluția PT juxtamedulară
Pentru a obține o perspectivă mai cuprinzătoare arinichistructura, am profitat de colorarea cu Griffonia simplicifoliaagglutinin, care ne-a permis să urmărim vasele arcuate și ramurile lor în vasele radiate corticale (Figura 4a; Filmul suplimentar S8). Interesant este că 3D concomitent (Tridimensional) reconstrucția nefronilor și a vaselor a arătat că vasele arcuate tind să fie într-o organizare spațială paralelă surprinzătoare cu tubii din apropiere. În special, am observat că calea urmată de JN-uri specifice (JN-uri constrânse) tinde să urmeze calea vasului din apropiere (Figura 4b; Film suplimentar S9). În mod remarcabil, această părtinire (observată doar într-un subset de JNnefroni) a explicat eterogenitatea mare a formelor PT (Figura suplimentară S6). Analizele morfometrice au arătat că PT-urile „constrânse” au fost semnificativ mai lungi și mai sinuoase (dreptitate redusă) decât cele „neconstrânse” (Figura 4c și d). Este demn de remarcat faptul că părțile întortocheate atât ale SN-urilor, cât și ale MN-urilor au fost poziționate deasupra vaselor arcuate și nu au fost constrânse.
Cistanche-boală cronică de rinichi
Tubii tind să se așeze în planuri
Interesant, o inspecție a 3D (Tridimensional) forme denefronia indicat că au tendința de a se afla în planuri (Figura 5a; Film suplimentar S10). Pentru a cuantifica acest parametru și pentru a evalua posibila părtinire statistică a acestei conformații, am măsurat tendința generală a tubilor de a se îndoi în afara planului definit de buclele lor. Măsurătorile noastre au arătat că, în comparație cu un model simulat de mers aleator generat cu același set de unghiuri măsurate consecutive și lungime între puncte consecutive (Figura 5b), tubii au avut tendința de a evolua cu o abatere mai mică de la un plan (Figura 5c). Acest lucru a indicat faptul că tubulistended pentru a restricționa calea lor de-a lungul unui plan. Diferențele observate au fost foarte semnificative statistic (P <>
Reconstrucția nefronului 3D dezvăluie un model specific pentru dezvoltarea chisturilor
Pentru a determina dacă protocolul nostru permite urmărirea nefronilor în țesuturile patologice dezorganizate, am caracterizat formele și distribuția spațială a chisturilor la șoarecii jack, un model utilizat pe scară largă de NPHP și boală chistică.31–33 3Imaginile D au arătat că, în ciuda aspectul chisturilor proeminente, general 3D (Tridimensional) cursul nefronilor nu a diferit semnificativ de cel al șoarecilor de control (film suplimentar S11). În mod similar, analizele morfometrice au confirmat că lungimea globală anefroni, volumul glomerular și lungimea fiecărui segment de nefron au fost comparabile cu cele ale șoarecilor de control (Figura suplimentară S7). De notat, din cauza dezvoltării chistului, nu am reușit să diferențiem TL de TAL în HL. Toți nefronii au dezvoltat chisturi fusiforme (Filme suplimentare S11 și S12). Una dintre caracteristicile cele mai izbitoare a fost observația că dilatările chistice fuziforme au avut loc în mai multe locații de-a lungul aceluiași segment de nefron (Filme suplimentare S12 și S13). În mod intrigant, am observat că chisturile nu s-au dezvoltat niciodată în membrele PT și HL descendente (Figura 6a; Film suplimentar S12). În contrast, acestea au fost detectate predominant în membrele ascendente HL, DCT, CNT și în partea superioară a CD-urilor, în continuitate cu CNT (Figura 6a; Film suplimentar S12). În special, am observat că DCT, precum și segmentele CNT, au avut o probabilitate deosebit de crescută de a dezvolta chisturi în părțile lor mai distale (Figura 6b). Analizele morfometrice cantitative ale imaginilor de reconstrucție 3D au arătat că volumul total de chist pe nefron a fost deosebit de mare în CNT (Figura 7a). În plus, am observat că măririle chistului în HL și DCT au fost mai mari în JN decât în SN și MN (Figura 7a; Film suplimentar S12). În plus, incidența chisturilor a fost semnificativ mai mare la JN decât la celelalte tipuri denefroni(Figura 7b). Am observat, de asemenea, că distanța medie dintre glomerulare (calculată pe cei mai apropiati 5 glomeruli) tinde să fie deosebit de crescută la șoareci inchistici, în special în cortexul mai superficial (Figura suplimentară S8).
Figura 4|Vasele determină forma nefronului. (A)Tridimensionalreconstrucția arhitecturii vaselor de la vasele arcuate la vasele radiate corticale. Bară ¼ 200 mm. (b) Imagini reprezentative ale tubilor proximali juxtamedulari „neconstrânși” (panoul superior) și „constrânși” (panoul inferior). Bară ¼ 100 mm. (c,d) Cuantificarea (c) lungimea și (d) dreptatea tubilor proximali juxtamedulari „neconstrânși” și „constrânși”. Datele sunt exprimate ca medie±SEM. Testul Mann-Whitney: „constrâns” versus „neconstrâns”:*P < 0.05,="" ***p=""><>
3D (Tridimensional) reconstrucția a numeroase chisturi a arătat că acestea erau extrem de variabile ca formă și volum (Figura 6c; Filme suplimentare S11 și S13). În membrul ascendent HL, chisturile aveau o formă fuziformă cu un diametru mic. În DCT, chisturile aveau o formă destul de sferică și mai mare și erau intercalate printre tubulii nedilatați. Interesant este că tranziția între DCT și CNT a fost caracterizată sistematic printr-o structură normală nedilatată. În schimb, în CNT, am observat sistematic o structură chistică dilatată adiacentă direct în contact cu CD. Interesant, în CD, această structură s-a micșorat progresiv la o dimensiune normală a tubului. Mai distal, nu au mai putut fi detectate chisturi în porțiunea adiacentă CD. O altă caracteristică consecventă a fost organizarea spațială particulară a chisturilor din membrul ascendent al HL. De fapt, deși chisturile erau mai adânci și mai aproape de bucla în SN, acestea au fost mai superficiale și mai aproape de DCT în JN (Figura 6c). Din nou, chisturile au ocupat o poziție intermediară în MNs (Figura 6c).
Figura 5|Tubulii nefronici tind să evolueze ca o structură plată. (a) O cale tipică a unui tub proximal nefron. Această cale ilustrează tendința sa de a se întinde într-un plan. Planaritatea evoluției căii poate fi văzută mai bine atunci când este rotită și aliniată corespunzător cu punctul de vedere al observatorului (vezi reprezentarea din dreapta a aceluiași segment tubular, care, în partea stângă, este reprezentată pe un unghi diferit) . (b) Reprezentarea schematică a unui traseu tubular compus din 4 segmente (între 5 puncte care definesc o cale tubulară dată prezentată ca exemplu). Gradul în care căile tind să iasă „din planul lor” poate fi reprezentat de unghiul indicat aici ca „beta”. (Continuare)
Figura 5|(Continuare) Acest unghi este măsurat între segmentul p3-p4 în raport cu planul (definit de punctele imediat precedente p3, p2 și p1) și reprezentat printr-un dreptunghi gri închis în schemă. Calculul unghiurilor beta a fost apoi calculat recursiv împreună cu setul de puncte dintr-o cale tubulară. Pentru a evalua amploarea părtinirii acestor unghiuri beta, am simulat o mers aleator (Monte Carlosimulation [MCs]) utilizând același set de unghiuri alfa consecutive ale fiecărei căi tubulare (măsurate între toate segmentele consecutive). Această mers aleatorie a generat o cale cu un set identic de unghiuri alfa și unghiuri beta randomizate. (c) Grafice de vioară ale distribuției globale a unghiurilor beta și rezultatul MC în tubul proximal (PT), membrul subțire (TL) al buclei Henle, membrul ascendent gros (TAL) al buclei Henle, tubul contort distal (DCT) ), și tubul conjunctiv (CNT). MCs, P <>
DISCUŢIE
Metodele histologice tradiționale sunt limitate în capacitatea lor de a detecta modificări patologice care afectează forma globală anefroni. Aici, vă prezentăm o abordare puternică bazată pe curățarea problemelor, care are potențialul de a aborda întrebări crucialerinichiarhitectură cu detalii spațiale fără precedent în condiții normale și patologice. Rezultatele noastre au confirmat existența a 3 tipuri de nefroni, care diferă în funcție de locația, forma și dimensiunea lor, în concordanță cu specificul lor funcțional. Mai mult, am demonstrat că nefronstendul se află în planuri și se adaptează la organizarea spațială a navei. În mod intrigant, când am aplicat această tehnică unui model de boală chistică de rinichi, am observat că chisturile se dezvoltă în toți nefronii, dar numai în anumite segmente. Interesant, am arătat că forma chistului variază în funcție de segmentul nefronului și că de-a lungul aceluiași nefron, chisturile se intercalează cu tubii normali nedilatați. În total, aceste rezultate oferă primul 3D (Tridimensional) caracterizarea amenajării spaţiale anefroniși vasele și, în mod important, oferă baza pentru înțelegerea unui proces patologic, cum ar fi ascystogeneza.
Curățarea optică a rinichilor este o provocare din cauza nivelurilor ridicate de autofluorescență și a densității celulare. Prin compararea diferitelor protocoale de curățare, am identificat în BABB o tehnică puternică de implementare a vizualizării și reconstrucției structurilor situate în cea mai adâncă parte arinichi, adică medulara. În plus, BABB este rapid și scalabil și, odată șters, mostrele pot fi stocate luni înainte de achiziționarea imaginii. Un alt avantaj principal al acestei tehnici este costul redus. Agenții de curățare pot avea ca rezultat micșorarea sau mărirea structurilor.9–17 Cu toate acestea, deoarece aceste modificări ale mărimii rinichilor sunt izotrope, nu se așteaptă ca măsurătorile relative să fie afectate sau să influențeze interpretarea lor. Una dintre cele mai importante limitări este adnotarea structurilor care necesită foarte mult timp. Cu toate acestea, există un număr tot mai mare de tehnici bazate pe învățarea profundă care ar trebui să depășească rapid această limitare.
În concordanță cu rezultatele obținute prin tehnicile clasice, studiul nostru a arătat că nefronii diferă ca formă și lungime în funcție de poziția lor. În special, am observat că JN-urile au PT convoluți mai dezvoltate și glomeruli mai mari și sunt de 2 ori mai lungi decât SN. Lungimea crescută este rezultatul unui proces armonios, deoarece alungirea afectează proporțional toate segmentele nefronice. De asemenea, am observat că JN-urile au HL mai mare. În total, aceste date arată în mod clar că microanatomia SN și JN este semnificativ diferită și că MN-urile prezintă caracteristici intermediare. Interesant este că studiile fiziologice au arătat cănefronisunt de asemenea diferite din punct de vedere funcțional.2 Evenimentele morfogenetice care stau la baza acestor diferențe nu sunt încă cunoscute. Este, prin urmare, tentant să speculăm că structura particulară a JNs poate explica specificul funcțiilor lor.
Interesant, prin furnizarea pentru prima dată 3D (Tridimensional) reconstrucţia denefroniși vasele din jur, am descoperit o constrângere spațială între vasele arcuate și un subgrup de nefroni. Astfel, se poate crede că vasele pot dicta modul în care nefronii se lungesc în timpul dezvoltării.34,35 Inspecția formelor 3D ale nefronilor combinată cu simulări computaționale a arătat, de asemenea, că nefronii nu se amestecă niciodată și că fiecare nefron tinde să se așeze într-un plan. Semnificația funcțională a acestei observații rămâne de elucidat.
Dezvoltarea chistului în timpul polichisticuluirinichiboala este încă un proces intrigant. NPHP, o afecțiune patologică caracterizată prin dezvoltarea chistului, este cea mai frecventă boală genetică care cauzează boala renală în stadiu terminal la copii și adolescenți. Douăzeci de gene NPHP au fost identificate până în prezent.36 Printre acestea, NEK8 codifică un membru al familiei de kinaze A niciodată asociate inmitozei, care joacă un rol în funcția ciliară și progresia ciclului celular.37 Nek8 a fost inițial caracterizată ca gena mutată la șoarecii jck.32 În special, s-a demonstrat că amutarea în același domeniu proteic duce la NPHP9 la oameni.38 2Studiile D au sugerat că dezvoltarea chistului diferă dramatic între diferitele forme de boală polichistică de rinichi.27,29 În special, în NPHP, chisturile par a fi derivate. exclusiv din CD și DCT.31 Deși informative, aceste studii imunohistochimice nu pot argumenta împotriva posibilității ca pierderea markerilor tubulari specifici39 să explice în mod artificial această observație. Astfel, 3D-ul nostru (Tridimensional) studiul furnizează prima dovadă clară că dezvoltarea chistului este un proces care poate implica doar segmente nefronice specifice. Interesant, deși NIMA (Never In mitozgene A)-Related Kinase 8 (NEK8) este exprimată în citoplasma tuturor segmentelor de nefron, expresia sa în cili este limitată la DCT și CD. Deoarece numai aceste segmente sunt predispuse să dezvolte chisturi,31 putem postula că întreruperea funcției ciliare NEK8 este evenimentul crucial pentru formarea chistului. În mod intrigant, am observat, de asemenea, că chisturile fuziforme sunt în continuitate cu tubii normali nedilatați. Faptul că o mutație recesivă a liniei germinale duce la un fenotip patologic doar într-un subset de celule sugerează că un eveniment secundar ar putea declanșa dezvoltarea chistului în aceste celule, așa cum se sugerează pentru polichistul autosomal dominant.rinichiboala.40,41
Figura 6 |Tridimensional(3D) reconstrucția nefronului arată că chisturile se dezvoltă numai în anumite segmente de nefron. (a) Imagini 3D reprezentative cu redarea volumului chistului a unui nefron întreg (panourile din stânga) de la glomeruli până la canalul colector în cortexul superficial (albastru), cortexul mijlociu (verde) și regiunea juxtamedulară (roșu) la șoarecii jack. Segmentarea nefronilor (panourile din dreapta) pentru cele 3 tipuri diferite denefroni. Bară=150 mm. (b) Probabilitatea de a dezvolta chisturi în diferitele segmente de nefron la șoarecii jack. (Continuare)
Figura 6|(Continuare) Axa orizontală este o lungime normalizată a nefronilor corespunzătoare la 50 de bins (tubul proximal [PT], turcoaz; Henleloop [HL], alb; tubul contort distal [DCT], roz; tubul de legătură [CNT], galben). (c) Imagini reprezentative de reconstrucție a chisturilor 3D cu redarea volumului de chisturi a membrului ascendent al HL (panouri stânga), DCT (panouri din mijloc) și CNT și canale colectoare corticale (CCD) (panourile din dreapta) în superficial (panourile superioare), mijlocul (panourile de mijloc) panouri) și nefroni juxtamedulari (panouri inferioare) la șoarecii jack. Bară= 50 mm.
Figura 7|Caracterizarea distribuției și volumului chistului în tot nefronul. (a) Cuantificarea volumului total al chistului (suma chisturilor per nefron) pentru fiecare segment de nefron (buclă Henle [HL], albă; tubul contort distal [DCT], roz; tubul de conectare [CNT], galben) și (b) lungimea tubului ocupată de chisturi pentru fiecare tip de nefron (superficial: albastru; mijlociu: verde; juxtamedular: roșu) la șoareci. Datele sunt exprimate ca medie±SEM. Analiza varianței urmată de testul Tukey-Kramer: nefron juxtamedular [JN] versus nefron superficial [SN]: #P < 0.05;="" jn="" versus="" nefron="" mediu="" [mn]:="" *p="">< 0,05,="" **p=""><>
De asemenea, am observat că mărirea chistului este mai predominantă în JN decât în SN, cel puțin având în vedere chisturile care se localizează între PT și CNT. În mod consecvent, s-a raportat că, în contextul glomerulosclerozei, leziunile glomerulare sunt întâlnite mai frecvent în JN decât în SN. a se deteriora este o ipoteză interesantă care merită investigații suplimentare.
Pe scurt, descriem o nouă tehnică de imaginerinichiîn 3D (Tridimensional) cu specificitate și rezoluție moleculară suficientă pentru a înregistra direct distribuția spațială și cantitativă a structurilor interne etichetate în mod specific (nefroni, vase și chisturi). Având în vedere confortul, viteza și capacitatea de cuantificare directă, anticipăm că această tehnică va deveni un instrument puternic pentru înțelegerea fiziopatologiei rinichilor.
METODE
animale
Toate procedurile pe animale au fost aprobate de „Services Vétérinairesde la Prefecture de Police de Paris” și de comitetul de etică al Universității Paris Descartes. Au fost utilizați șoareci FVB/N de două luni (n=20) pentru a seta starea experimentală pentrurinichicurățare. Studiul a fost apoi efectuat pe șoareci masculi jack în vârstă de 2-săptămâni (n=4) și pe tovarășii de control (n=3).
Pregătirea țesuturilor renale
Înainte de ucidere, șoarecii au fost perfuzați, prin cateterism intracardiac, cu 25 ml de soluție salină heparinizată (1000 UI/l), urmată de 75 ml de paraformaldehidă 4% în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS). Experimentele au fost efectuate sub anestezie cu xilazină (Rompun 2%, Bayer, Leverkusen, Germania, 6 mg/g greutate corporală) și ketamina (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, Franța, 120 mg/g greutate corporală).
Pentru studii de compensare,rinichiau fost fixate în 4% paraformaldehidă timp de 4 ore și încorporate în 4% agaroză și secțiuni de 1.5-mm grosime care înconjoară hilul renal au fost tăiate și depozitate în PBS la 4%.grad. Secțiunile de rinichi au fost mai întâi colorate și apoi curățate.
Pentru studii imunohistochimice pe secțiuni subțiri, rinichii au fost fixați în paraformaldehidă 4% peste noapte și au fost tăiate secțiuni încorporate în parafină și 4-mm.
Colorarea
Colorare periodică cu acid-Schiff. 1.5-mmrinichiSecțiunile au fost incubate în acid periodic pur sau 1:100 diluat cu PBS-Schiff timp de 5 minute la temperatura camerei înainte de curățare.
Imunohistochimie pe secțiuni subțiri încorporate în parafină. Secțiuni de patru micrometri de rinichi încorporați în parafină au fost încălzite pentru recuperarea antigenului și incubate peste noapte la 44 gradecu lectine cuplate cu flfluorocrom pentru a urmări tubii (aglutinină de arahide de rodamină [RL-1072-5] și aglutinină de germeni de grâu de rodamină [RL{-1022-5], Vector Laboratories, Burlingame, CA, diluată la 1:200) și segmente- anticorp primar specific pentru a descrie segmente tubulare distincte (lectină de Lotus tetragonolobus biotinilată [B-1325], Vector Laboratories, diluată la 1:100; anti-Calbindin D28K[D-4] de șoarece, Santa Cruz, Heidelberg, Germania, diluat la 1:200; capră anti-AQP2 [C-17], Santa Cruz, diluat la 1:200). A doua zi, secțiunile au fost incubate cu anticorpul secundar timp de 1 oră la temperatura camerei (conjugat Alexa Fluor 488 [S32354], Invitrogen; Alexa Fluor 488 anti-capră [A-11055], Invitrogen; AlexaFluor anti-șoarece 488 [A-21202], Invitrogen, Carlsbad, CA; toate diluate la 1:500) înainte de a fi colorate cu 40,6-diamidino-2-fenilindol. Toate imaginile au fost achiziționate cu un microscop Nikon Eclipse E800 (Champignysur Marne, Franța) și preparate folosind software-ul Fiji (versiunea 1.50). Colorarea cu lectină pe secțiuni groase. Grosimea de 1.5-mmrinichisecțiunile au fost incubate la 44 gradetimp de 1 lună în Texas Red sau lectine cuplate cu izotiocianat de fluoresceină: aglutinină de arahide (RL-1072-5) și aglutinină din germeni de grâu (RL-1022-5), diluate la 1:100 în 0,1% azidă PBS și 0,1% Triton-X. Secțiunile au fost apoi spălate în fiecare zi timp de 2 săptămâni cu PBS înainte de curățare.
Cistanche-funcția rinichilor
Curățare optică
Pentru curățarea cântarilor, 1,5-mmrinichisecțiunile au fost incubate în ScaleA2 (4 M uree, 0,1% Triton X{-100, 10 procente glicerol) sau ScaleB4 (8 Murea, 0,1% Triton X{-100 ) timp de 2 săptămâni, până la 1 an, la 4grad.
Pentru curățarea BABB, secțiuni de rinichi de 1,5-mm au fost deshidratate în clătiri succesive cu etanol la temperatura camerei. Probele au fost apoi incubate în BABB (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) într-un raport de 1:2 timp de cel puțin 2 zile la 4 grade.
Achiziție de imagini prin microscopie cu doi fotoni
Țesuturile au fost fotografiate cu gel apos pe un microscop multifoton inversat (LaVision BioTec) echipat cu un laser Mai Tai HP Titanium-Sapphire (Spectra-Physics, Santa Clara, CA) (Figura suplimentară S1A). Lungimea de undă de excitație a fost de 815 nm la 8% din putere. Am folosit un 20Xobiectiv de imersie în apă (XLUMPLFL20XW,Olympus [Tokyo, Japonia]; deschidere numerică, 0,95; distanță de lucru, 2,0 mm). Pentru achiziția fluorescenței, am folosit un detector nedescanat la 80% cu un filtru trece-bandă de 593/40 nm.
Primul pas a constat în achiziția de imagini mozaic 2D la stiva z din mijloc prin utilizarea parametrilor de achiziție suboptimali (400 mm x 400 mm și 1011 x 1011 pixeli, cu 10% suprapunere și o medie liniară la 2) pentru a ghida selecția celor mai relevante câmpuri centrale (Figura suplimentară S9A ). Odată ce grila XY și câmpurile de interes z au fost definite, parametrii au fost ajustați pentru a obține imagini de înaltă calitate. O astfel de abordare a redus regiunea de interes la5X12 câmpuri pe stivă z. Apoi, am achiziționat 850 z stive/slices optice (1-mm dimensiunea pasului) care înconjoară hilul renal în partea de mijloc arinichisecțiune.
Cusătura, procesarea și urmărirea imaginilor Fiecare stivă a fost împărțită conform metodei dezvoltate de Preibischet al.,43, care permite îmbinarea unei colecții mari de imagini utilizând pluginul „Grid/Collection stitching” al software-ului Fiji (HTTP://Fiji. sc/Fiji). Deoarece am observat o schimbare importantă între 2 imagini adiacente după coasere, am scris un program personalizat de potrivire în Python. Acest program compensează deplasarea imaginii, permițându-ne să aliniem corect imaginile (Figura suplimentară S9B). Imaginile cusute-corectate au fost analizate utilizând versiunea Imaris 8.4.2 (Bitplane, Zurich, Elveția). Tuburile și vasele au fost urmărite utilizând modul manual al pachetului de trasoare de filament al Imaris și s-au alăturat printr-o extensie Imaris pe care am dezvoltat-o cu MATLAB(https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone_Alăturare_ Filament_Tool.zip?dl=0) (Figura suplimentară S9C). Glomerulele și chisturile au fost reconstruite 3D folosind modul manual al pachetului de suprafață Imaris. 3D (Tridimensional) organizarea spațială a glomerulilor a fost afișată folosind modul manual al pachetului spots al Imaris.
Morfometrie
Lungimea segmentului tubular, lungimea nefronului și dreptatea au fost determinate utilizând pachetul de urmărire a filamentului Imaris. Conform software-ului Imaris, dreptatea a fost cuantificată ca raport între distanța dintre 2 puncte și lungimea traseului segmentului nefron. Treizeci și unu de PT și 12 întreginefroniau fost reconstruiți și măsurați la 3 șoareci de tip sălbatic, în timp ce 37 de PT și 17 nefroni întregi au fost reconstruiți și măsurați la 4 șoareci jack. Volumele chisturilor și glomerulare au fost determinate folosind „pachetul de suprafață” al Imaris. Treizeci și unu și, respectiv, 34 de glomeruli au fost măsurați la șoareci de tip sălbatic și respectiv jack. Au fost măsurate în total șaptezeci și patru de chisturi.
Unghiurile „în afara planului” ale spirelor tubulare (indicate ca „beta”) au fost măsurate între plan (definit prin 3 puncte consecutive) și direcția cu următorul al patrulea punct consecutiv în spațiu (Figura 5b). Pentru a evalua semnificația statistică a părtinirii observate, am simulat distribuția unghiurilor beta cu rotația aleatorie a unghiurilor beta (simularea Monte Carlo) în structuri care erau compuse din aceleași segmente cu același set de unghiuri alfa.
Pentru calcularea probabilității de a dezvolta o leziune chistică împreună cu segmentele de nefron, am reprezentat fiecare nefron printr-un set de puncte din spațiu. Fiecare punct a fost adnotat cu privire la prezența chistului față de structura normală și tipul de segment. Probabilitatea la fiecare lungime standardizată (setată la 50 de bins) a fost calculată ca raport între numărul de puncte cu adnotare chistică și numărul total de puncte din bin.
Pentru calculul interdistanței glomerulare medii, am considerat pentru fiecare glomerul interdistanța glomerulară medie calculată pe cei mai apropiați 5 glomeruli.
Analize de date și statistici
Datele sunt exprimate ca medie ± SEM. Diferențele dintre grupurile experimentale au fost evaluate utilizând analiza varianței urmată, când este semnificativă (P < {{0}}.05),="" de="" testul="" tukey-kramer.="" când="" au="" fost="" comparate="" doar="" 2="" grupuri,="" a="" fost="" utilizat="" testul="" mann-whitney.="" analizele="" statistice="" au="" fost="" efectuate="" folosind="" software-ul="" graph="" prism="" (sandiego,="" ca,="" versiunea="">
DEZVĂLUIRE
Toți autorii au declarat că nu există interese concurente.
MULȚUMIRI
Mulțumim Laboratorului Experimentare Animale et Transgeneze (LEAT), Histologie și Platforme Imagistice ale Structurii Federative deRecherche Necker pentru asistența tehnică. Mulțumim lui Pierre Isnard, Marie-Claire Gubler și Nicolas Kuperwasser pentru lectura critică a manuscrisului. Această lucrare a fost susținută de Institut National de laSanté et de la Recherche Médicale, Université Paris Descartes, Assistance Publique – Hôpitaux de Paris, Agence Nationale de laRecherche, Whoami Laboratoire d'Excellence Whoam I, RochePharma Research and Early Development (Basel, Elveția) și Institut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (Paris, Franța).
CONTRIBUȚIILE AUTORILOR
TB, NG și MZ au proiectat și efectuat experimentele și au analizat datele. FB, LT, MGT și SG au efectuat și unele experimente și au analizat datele. MB și CN au efectuat experimentele cu șoarece. TB și MZ au contribuit, de asemenea, la scrierea manuscrisului. GF a revizuit manuscrisul. FT și MP au furnizat cadrul conceptual și au conceput studiul, au supravegheat proiectul și au scris lucrarea.
Cistanche-Arhitectura tridimensională a rinichilor nefroni
MATERIAL SUPLIMENTAR
Fișier suplimentar (PDF)
Figura S1. Configurare experimentală, procedură de achiziție și procesare a imaginilor.
Figura S2. Limitele semnalului de autofluorescență în rezoluțiile XY și z.
Figura S3. O imagine bidimensională a tranziției dintre PT și TL pe 4-mm încorporate în parafinărinichisecțiuni.
Figura S4. O imagine bidimensională a tranziției dintre TAL și DCT pe secțiuni de rinichi încorporate în parafină de 4-mm.
Figura S5. O imagine bidimensională a tranziției dintre DCT și CNT pe secțiuni de rinichi încorporate în parafină de 4-mm.
Figura S6. Reconstrucția tridimensională dezvăluie 3 forme diferite de tubuli proximali.
Figura S7.Tridimensionalreconstrucția relevă că lungimea și segmentareanefroninu sunt afectate de chisturi.
Figura S8. Densitatea glomerulilor în control și chisticerinichi.
Figura S9. Procedura de achizitie si procesarea imaginilor post-tratament.Tabelul S1. Comparația metodelor de curățare. Fișier suplimentar (filme)
Filmul S1. Colorarea cu lectină îmbunătățește considerabil rezoluția și raportul semnal-fond.
Filmul S2. Trasarea traseului unui tubul.
Filmul S3. Reconstrucție tridimensională a unui rinichi curat care arată joncțiunea dintre tubul proximal și limbul subțire al ansei Henle.
Filmul S4. Reconstrucție tridimensională a unui rinichi curat care arată joncțiunea dintre membrul ascendent gros al Henleloop și tubul contort distal.
Filmul S5.Tridimensionalreconstrucția unui defrișatrinichicare arată joncțiunea dintre tubul contort distal și tubul de legătură.
Filmul S6. Forma și dimensiunea tubilor proximali diferă în funcție de adâncimea lor.
Filmul S7. Reconstrucția tridimensională a nefronului la șoarecii control.
Filmul S8. Trasarea traseului unui vas de la un vas arcuat la un vas radiat acortical.
Filmul S9. Vasele arcuate modelează forma tubilor juxtamedulari proximali.
Filmul S10.Nefronitind să se întindă într-un avion.
Filmul S11. Reconstrucția tridimensională a nefronului prezintă un model specific pentru dezvoltarea chistului.
Filmul S12.Tridimensionalsegmentarea nefronului relevă faptul că chisturile se dezvoltă în segmente specifice de nefron.
Filmul S13. Amenajarea spațială și interrelația dintrenefronişi vasele într-un polichisticrinichi.
REFERINȚE
1. AR bogat. O vulnerabilitate nedescrisă până acum a glomerulilor juxtamedulari în nefroza lipoidă. Bull Johns Hopkins Hosp. 1957;100:173–186.
2. Bankir L, Bouby N, Trinh-Trang-Tan MM. Eterogenitatea nefronanatomiei. Kidney Int Suppl. 1987;20:S25–S39.
3. Christensen EI, Grann B, Kristoffersen IB, et al.Tridimensionalreconstrucția nefronului de șobolan. Am J Physiol Physiol. 2014;306:F664–F671.
4. Zhai XY, Birn H, Jensen KB și colab. Reconstrucție digitală tridimensională și ultrastructură a tubului proximal al șoarecelui. J Am Soc Nephrol.2003;14:611–619.
5. Zhai XY, Thomsen JS, Birn H, et al. Reconstituirea tridimensională a nefronului de șoarece. J Am Soc Nephrol. 2006;17:77–88.
6. Puelles VG, Moeller MJ, Bertram JF. Putem vedea clar acum: opticalclearing șirinichimorfometrie. Curr Opin Nephrol Hypertens.2017;26:179–186.
7. Seo J, Choe M, Kim SY. Tehnici de curățare și etichetare pentru țesuturi biologice la scară largă. Celulele Mol. 2016;39:439–446.
8. Spalteholz W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen undtierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang:Über Knochenfärbung. Leipzig, Germania: S. Hierzel; 1914.
9. Hama H, Kurokawa H, Kawano H și colab. Scala: o abordare chimică pentru imagistica prin fluorescență și reconstrucția creierului transparent de șoarece.Nat Neurosci. 2011;14:1481–1488.
10. Ertürk A, Becker K, Jährling N, și colab.TridimensionalImagistica organelor curățate cu solvent folosind 3DISCO. Nat Protoc. 2012;7:1983–1995.
11. Kuwajima T, Sitko AA, Bhansali P, et al. ClearT: o metodă de curățare fără detergent și solvenți pentru țesutul neuronal și non-neuronal.Dezvoltare. 2013;140:1364–1368.
12. Ke MT, Imai T. Curățarea optică a probelor de creier fix folosind SeeDB. CurrProtoc Neurosci. 2014;66:2.22.1–2.22.19.
13. Chung K, Deisseroth K. CLARITATE pentru cartografierea sistemului nervos. NatMethods. 2013;10:508–513.
14. Tomer R, Ye L, Hsueh B, Deisseroth K. Advanced CLARITY pentru imagistica rapidă și de înaltă rezoluție a țesuturilor intacte. Nat Protoc. 2014;9:1682–1697.
15. Yang B, Treweek JB, Kulkarni RP, et al. Fenotiparea unicelulare în țesutul transparent intact prin curățarea întregului corp. Celulă. 2014;158:945–958.
16. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D, et al. Imagistica întregului creier cu rezoluție cu o singură celulă folosind cocktail-uri chimice și analiză computațională. Cell.2014;157:726–739.
17. Alaentalo T, Asayesh A, Morrison H, et al. Imagistica moleculară tomografică și cuantificarea 3D în organele de șoarece adulți. Nat Methods.2007;4:31–33.
18. Parra SG, Chia TH, Zinter JP, et al. Microscopie multifotonica a organelor de șoarece clarificat. J Biomed Opt. 2010;15:036017.
19. Renier N, Wu Z, Simon DJ, et al. iDISCO: o metodă simplă și rapidă de a marca prin imuno mostre de țesut mari pentru imagistica de volum. Celulă. 2014;159:896–910.
20. Lee H, Park JH, Seo I, et al. Aplicarea îmbunătățită a tehnologiei de curățare a țesuturilor electroforetice, CLARITY, la organele solide intacte, inclusiv creierul, pancreasul, ficatul,rinichi, plămâni și intestine. BMC Dev Biol. 2014;14:1–7.
21. Iversen BM, Amann K, Kvam FI, et al. Creșterea presiunii capilare glomerulare și dimensiunea mediază glomeruloscleroza în cortexul juxtamedular SHR. Am J Physiol Physiol. 1998;274:F365–F373.
22. Angelotti ML, Antonelli G, Conte C, Romagnani P. Imaging the kidney: from light to super-resolution microscopy. Nephrol Dial Transplant.2021;36:19–28.
23. Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al. Validarea unei metode tridimensionale de numărare și dimensionare a podocitelor din glomeruli întregi. J Am Soc Nephrol. 2016;27:3093–3104.
24. Pannabecker TL, Dantzler WH, Layton HE, Layton AT. Rolultridimensionalăarhitectura mecanismului de concentrare a urinei medulei interne renale. Am J Physiol Physiol. 2008;295:F1271–F1285.
25. Saritas T, Puelles VG, Su XT, et al. Limpezirea optică în rinichi relevă remodelarea tubulară mediată de potasiu. Cell Rep. 2018;25:2668–2675.e3.
26. Schuh CD, Polesel M, Platonova E, et al. Imagistica combinată structurală și funcțională a rinichiului dezvăluie diferențe axiale majore în endocitoza tubului proximal. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2696–2712.
27. Braun DA, Hildebrandt F. Ciliopathies. Cold Spring Harb Perspect Biol.2017;9:a028191.
28. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC, et al. Polichisticrinichiboala. Nat Rev Dis Prim. 2018;4:50.
29. Wilson PD. Boala de rinichi cu chisturi multiple. N Engl J Med. 2004;350:151–164.
30. Laitinen L, Virtanen I, Saxén L. Modificări în modelul de glicozilare în timpul dezvoltării embrionare a rinichilor de șoarece, așa cum a fost relevat cu lectinconjugate. J Histochem Cytochem. 1987;35:55–65.
31. Smith LA, Bukanov NO, Husson H, et al. Dezvoltarea bolii polycystickidney la șoarecii juvenili cu rinichi chistici: perspective asupra patogenezei, anomaliilor ciliare și caracteristicilor comune cu boala umană. J AmSoc Nephrol. 2006;17:2821–2831.
32. Liu S, Lu W, Obara T, et al. Un defect al unei noi kinaze din familia Nek provoacă boală renală chistică la șoarece și la peștele-zebră. Dezvoltare.2002;129:5839–5846.
33. Franke M, Baeßler B, Bechtel J, et al. Cartografierea prin rezonanță magnetică T2 și imagistica ponderată prin difuzie pentru detectarea precoce a cistogenezei și răspunsul la terapie într-un model de șoarece de boală polichistică de rinichi.RinichiInt. 2017;92:1544–1554.
34. Barry DM, McMillan EA, Kunar B, et al. Determinanții moleculari ai specializării vasculare nefronului înrinichi. Nat Commun. 2019;10:5705.
35. Perretta-Tejedor N, Jafree DJ, Long DA. Comunicarea endotelial-epitelială în polichisticrinichiboala: rolul semnalizării factorului de creștere endotelial vascular. Semnal celular. 2020;72:109624.
36. Srivastava S, Molinari E, Raman S, Sayer JA. Multe gene-una boli?Genetica nefronoftizei (NPHP) si tulburari asociate NPHP.Front Pediatr. 2017;5:287.
37. Fry AM, O'Regan L, Sabir SR, Bayliss R. Reglarea ciclului celular de către familia NEK a protein kinazelor. J Cell Sci. 2012;125:4423–4433.
38. Otto EA, Trapp ML, Schultheiss UT, et al. Mutațiile NEK8 afectează localizarea ciliară și centrozomală și pot provoca nefronoftizare. J Am SocNephrol. 2008;19:587–592.
39. Wilson PD. Polaritatea apico-bazală în epiteliile bolii polichistice de rinichi.Biochim Biophys Acta. 2011;1812:1239–1248.
40. Happé H, Leonhard WN, van der Wal A, și colab. Leziunea tubulară toxică la rinichi de la șoarecii cu deleție Pkd1-accelerează cistogenia însoțită de polaritatea celulară plană dereglată și căile de semnalizare Wnt canonice. Hum Mol Genet. 2009;18:2532–2542.
41. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, et al. Un comutator critic de dezvoltare definește cinetica formării chistului renal după pierderea Pkd1. Nat Med. 2007;13:1490–1495.
42. Ikoma M, Yoshioka T, Ichikawa I, Fogo A. Mecanism of the uniquesusceptibility of deep corticale glomeruli of maturingrinichila scleroza glomerulară focală severă. Pediatr Res. 1990;28:270–276.
43. Preibisch S, Saalfeld S, Tomancak P. Cusături optime la nivel global oftiled 3D (Tridimensional) achizitii de imagini microscopice. Bioinformatica. 2009;25:1463–1465.
