Efecte noi ale terapiei combinate prin inhibarea piroptozei induse de caspază-1/Gasdermin D în nefrita lupică

Pentru mai multe informații:ali.ma@wecistanche.com

Heng Cao, Junyu Liang, Jing Liu, Ye He, Yini Ke, Yiduo Sun, Song Jiang și Jin Lin

ABSTRACT

Obiective: Terapia combinată cu micofenolat de mofetil, tacrolimus și steroizi este eficientă în obținerea remisiunii complete lanefrită lupică(LN). Terapia combinată a redus în mod unic caspaza-1 în comparație cu monoterapiile, care pot scinda gasdermina D (GSDMD) și a fost recent identificată capiroptozacălău. Prin urmare, am investigat dacă terapia combinată a permis suprimarea mediată de caspază-1/GSDMDpiroptozaîn LN (nefrită lupică).

Click pentru cistanche deserticola ma pentru nefrită

Metode: Exprimarea și activarea GSDMD au fost detectate în specimene de rinichi de la om și șoarece cu LN (nefrită lupică) folosind colorarea imunohistochimică și imunoblot. Podocitele primare izolate de la șoareci MRLlpr au fost incubate cu LPS plus ATP și pretratate cu monoterapie sau terapie combinată. Inhibarea caspazei-1/GSDMD indusăpiroptozaprin terapie combinată a fost evaluată la șoareci MRLlpr și specimene umane. Am fost examinat folosind un kit FAM caspaze-1 și citometrie în flux. Corelația dintrepiroptozaîn sângele periferic și a fost analizat indicele de activitate al bolii lupusului eritematos sistemic (SLEDAl).

Rezultate: Probe de țesut renal din LN (nefrită lupică) pacienții și șoarecii au prezentat niveluri de expresie și clivaj mult crescute ale GSDMD. În podocitele cultivate, tratamentul combinat a suprimat în mod semnificativ activarea NLRP3 și a caspazei-1 și a redus nivelurile N-terminale GSDMD. Terapia combinată a reprimat progresia bolii prin inhibarea mediată de caspază-1/GSDMDpiroptozaatât la om, cât și la șoareci MRL/LPR. Numerele de celule pozitive caspaze-1/PI din sângele periferic au fost corelate pozitiv cu SLE-DAl. LN (nefrită lupică) pacienții cu remisie completă și parțială au avut un număr remarcabil de celule pozitive pentru caspază-1/PI comparativ cu valoarea inițială. Ac-FLTD-CMK, un inhibitor derivat din GSDMD, a prevenit dezvoltarea LN (nefrită lupică).

Concluzie: terapia combinată a suprimat caspaza-1/GSDMD-mediatăpiroptozain vitro și in vivo și a redus progresia bolii.

Cuvinte cheie:nefrită lupică, piroptoza, caspază-1, gasdermin D, terapie

Terapie de tratament pentrupiroptoza

INTRODUCERE

Nefrita lupică(LN) este o inflamație a rinichilor care apare ca o consecință a bolii autoimune lupus eritematos sistemic (LES).LN (nefrită lupică) este o manifestare majoră la pacienţii care suferă de LES. Aproximativ 60 la suta dintre pacienti dezvolta aceasta afectiune, cu aproximativ 20 la suta progresand catre boala renala in stadiu terminal (IRST)(1). Terapia combinată cu micofenolat mofetil (MMF), inhibitori de calcineurină (CNI) și steroizi produce efecte complementare și, de asemenea, minimizează toxicitatea (2). Această terapie este recomandată ca tratament inițial pentru LN (nefrită lupică) și produce o eficacitate mai bună și o remisie mai completă în comparație cu ciclofosfamida intravenoasă (IVCY) și steroizii (3-5).

Pentru a investiga mecanismele moleculare și celulare ale terapiei combinate, a fost utilizată o analiză transcriptomică cuprinzătoare într-un model murin de LN. (nefrită lupică). Șoarecilor MRL/LPR li sa administrat singur MMF, tacrolimus sau prednison ca monoterapie sau combinații cu trei medicamente. Profiluri ale expresiei genelor în rinichii șoarecilor cu LN (nefrită lupică)a dezvăluit mecanisme potențiale care ar putea explica efectele aditive și sinergice ale terapiei combinate în comparație cu monoterapiile. Una dintre cele 45 de gene reglate în jos care sunt modulate în mod unic prin terapia combinată este caspaza-1 (6). Este activat de inflamazomi, care sunt oligomeri multiproteici alcătuiți din NLRP3, pro-caspază-1 și proteină asemănătoare specului asociată apoptozei (ASC), cu un domeniu de afinitate caspază integrat. Inflamazomul NLRP3/ASC/caspază-1 a fost recunoscut ca un contributor cheie la patogeneza LN (nefrită lupică). Inflamazomul NLRP3 determină tulburări autoinflamatorii prin activarea caspazei-1, inițiind generarea de citokine proinflamatorii, de exemplu IL-1, despre care se știe că declanșează disfuncția podocitelor în LN(7-9).

Caspaza activă-1 scindează gasdermina D(GSDMD) în legătura dintre domeniile sale N- și C-terminale. Apoi, domeniul N-terminal facilitează formarea porilor în membrana celulară, stimulează celulapiroptozași producția de citokine IL-1 și IL-18 (10). Studiile emergente au arătat că GSDMD-mediatpiroptozaparticipă la progresia bolilor, inclusiv encefalomielita autoimună (11), scleroza multiplă (12), hepatita alcoolică (13) și boala inflamatorie intestinală (14). În plus, inhibarea genetică sau farmacologică a caspazei-1/GSDMD are s-a demonstrat că protejează rinichii de leziuni în modelele murine de boală renală diabetică (15, 16) și, de asemenea, după leziuni renale acute (17-19). In orice caz,piroptozaîn LN (nefrită lupică)este încă slab definit până în prezent(20). Am emis ipoteza că terapia combinată a conferit efecte benefice în LN (nefrită lupică)) prin inhibarepiroptozaindusă de caspază-1/GSDMD.

În studiul de față, a fost investigată activarea caspazei-1 și GSDMD în țesuturile renale, precum și efectele terapiei combinate asupra caspazei-1/GSDMD dependente.piroptozainhibarea la șoarecii MRL/LPR și la pacienții cu LN (nefrită lupică). Potenţiale corelaţii alepiroptozaau fost, de asemenea, evaluate cu indicele de activitate a bolii SLE (SLEDAI) și răspunsurile la tratament.

Tratament pentrupiroptoza

MATERIALE ȘI METODE

Studiază Populația

Cohorta de studiu a fost compusă din pacienți diagnosticați prin biopsie cu LN (lupusnefrită) Mai puțin sau egal cu 6 luni înainte de înscriere. Intervalul de vârstă al pacientului a fost de 18-65 ani și toate au îndeplinit criteriile de clasificare ale Colegiului American de Reumatologie pentru LES (2l, 22) și ale Societății Internaționale de Nefrologie/Renal Pathology Society (2003). Pacienții au fost recrutați de la Școala de Medicină a Universității Zhejiang și de la Școala de Medicină a Universității Nanjing care aveau proteinurie (mai mare sau egală cu 1,5 g/zi) și concentrații de creatinine serice mai mici sau egale cu 265,2 umol/L. Criteriile de excludere au inclus: un pacient a fost tratat anterior cu doze mari de metilprednisolon; medicamente biologice (care vizează molecule patogene specifice) sau terapie combinată; plasmafereză curentă sau tratament cu globulină intravenoasă în decurs de 12 săptămâni de la screening; funcții hepatice anormale; infecții active curente; și o tumoare malignă în decurs de 4 săptămâni de la începerea studiului. LN (lupusnefrită) pacienții au primit terapie cu puls cu metilprednisolon timp de 3 zile la o doză de 0,5 g/zi. Odată ce terapia cu puls cu metilprednisolon a fost finalizată, grupul de combinație cu prednison (0,6 mg/kg/zi), MMF (0,5 g, două doze/zi) și tacrolimus (2 mg, s-au administrat două doze/zi pentru un total de 4 săptămâni. Apoi, dozele de prednison, care erau încă combinate cu MMF (0,5 g, două doze/zi) și tacrolimus (2 mg, două doze/zi), au fost reduse cu 5 mg/zi la fiecare 2 săptămâni până a fost atinsă o doză de întreținere de 10 mg/zi(4). Remisiunea completă (CR) a fost luată ca o concentrație de proteină urinară de 24-h Mai mică sau egală cu 0,4 g, absența sedimentelor active de urină, o concentrație de albumină seric mai mare sau egală cu 35 g/L și creatinina normală (23). Remisiunea parțială (PR) a fost considerată ca o scădere mai mare sau egală cu 50 la sută a concentrației de proteine ​​urinare de 24-h la Mai puțin sau egală cu 3,5 g, o concentrație de albumină seric mai mare sau egală cu 30 g/ L și o creștere normală sau mai mică sau egală cu 25% a concentrației de creatinine serice față de valoarea inițială. Consiliul nostru de evaluare instituțională a aprobat studiul (Nr. IIT20200410A) și toți pacienții au furnizat consimțământul scris înainte de înscriere.

Modele animale

Șoarecii femele MRL/emoji-FasPr(MRL/LPR) au fost furnizați de SLAC Laboratory Animal Co.Ltd (Shanghai, China), toți șoarecii au fost împărțiți aleatoriu cu ajutorul unui generator de numere aleatorii, 5 șoareci în fiecare grup și fiecare cușcă . Aceștia au fost tratați pe cale orală la vârsta de 8 săptămâni, cu o combinație de 0,5 mg/kg tacrolimus (MCE HY{-13756), 50 mg/kg MMF (MCE HY-B0199) și 1 mg/kg. kg de prednison (MCE HY-B0214) sau vehicul zilnic, timp de un total de 8 săptămâni, așa cum s-a descris anterior(6). Ac-FLTD-CMK a fost sintetizat de MCE și 10 mg/kg au fost injectați ip zilnic. Toate tratamentele au fost orbite față de participanții responsabili pentru următoarea detectare. Raportul albumină-creatinină în urină (UACR) a fost determinat utilizând Albuwell M și Creatinina Companion (Excell, Phil, US). Specimenele de rinichi au fost fixate în paraformaldehidă 4% înainte de colorarea histologică și imunohistochimică și extragerea cortexelor renale pentru analiza imunoblot. Utilizarea șoarecilor a fost aprobată de Comitetul nostru instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor (nr.2019-883).

Izolarea glomerulilor de șoareci și cultura podocitelor

Glomerulii au fost purificați din rinichii șoarecilor femele C57 și MRL/LPR de 12-în vârstă de o săptămână, așa cum s-a descris mai înainte(24). Șoarecii anesteziați au fost perfuzați cu margele magnetice preîncălzite la 37 de grade C. Rinichii au fost îndepărtați și tocați pe gheață în 1 mm³. Apoi, țesuturile renale au fost digerate la 37 de grade cu 1 mg/ml colagenază și 100 U/ml DNază I timp de 30 de minute, apoi au fost filtrate de două ori cu 100-μm strecuratoare pentru celule Falcon (431752, BD). După mai multe spălări cu soluție HBSS de 4 grade (H1025, Solarbio) și centrifugare ușoară la 200 g timp de 5 minute, glomerulii care conțineau mărgele au fost colectați folosind suportul magnetic (HY-K0200, MCE) și spălat cu soluție HBSS de trei ori. Glomeruli izolați au fost cultivați pe vase de cultură acoperite cu colagen de tip I (C3867, Sigma-Aldrich) în 5% CO, la 37 de grade, conform metodei descrise de Jeffrey (25). Podocitele de pasaj 2 au fost utilizate în experimentul in vitro.PiroptozaDetectarea inducției, citotoxicității și secreției IL-1

Podocitele de la șoareci MRL/LPR au fost amorsate cu 1 mg/ml LPS (tell-pb5lps, In InvivoGen) rezolvat în Opti-MEM timp de 4 ore, apoi au fost urmate de stimulare 5mM ATP (tlrlatpl, gena In Vivo). Podocitele de la șoarecii C57 au fost tăiate ca martor normal. Monoterapiile tacrolimus (10μM), MMF (luM) și prednison (10μM) sau terapia combinată au fost pre-incubate cu celule timp de 1 oră înainte de amorsarea LPS. Citotoxicitatea după stimulare a fost determinată prin utilizarea unui kit de detectare a citotoxicității (11644793001, Roche) conform instrucțiunilor producătorului. Supernatantul după stimulare a fost colectat și măsurat utilizând kitul ELISA IL-1 mouse-ului (BMS6002, Invitrogen) conform instrucțiunilor producătorului.

Anticorpi și reactivi

Nivelurile de caspază-1(sc-398715, Santa Cruz Biotech), GSDMDC1 (sc-81868, Santa Cruz Biotech) au fost evaluate conform instrucțiunilor producătorului.Piroptozaîn sângele periferic a fost măsurat folosind FAM FLICAMCaspase-1 Kit (Bio-Rad, SUA) prin citometrie în flux.

Analize statistice

Analizele statistice au fost efectuate folosind GraphPad Prism(vers. 8.0) iar datele sunt date ca medie ± SD. Au fost efectuate două comparații de grup utilizând testul t Student și analize de corelație folosind corelația lui Pearson. P. cu două cozi<0.05 was="" considered="" statistically="">

Tratament pentrupiroptoza innefrită lupică (LN)

REZULTATE

GSDMD-mediatPiroptozaEste activat în rinichii afectați de LN (lupusnefrită)

Pentru a investiga dacă GSDMD a contribuit la patogeneza LN (lupusnefrită), am testat mai întâi nivelul de expresie a proteinei GSDMD în specimene de rinichi prelevate din LN (lupusnefrită) pacienţi. Analiza imunohistochimică a evidențiat niveluri de expresie remarcabil crescute ale GSDMD în probele de biopsie renală prelevate din LN (lupusnefrită) pacienți cu tip IV, V, I plus Vand IV plus V, și comparativ cu subiecții sănătoși. GSDMD a fost universal exprimat în podocite glomerulare, celule tubulare și celule interstițiale infiltrate în LN (lupusnefrită) pacienţi. Zona cu colorare pozitivă (săgeți roșii) și negativă (săgeți negre) a fost mărită (Figura 1A). Apoi a fost estimat procentul zonei GSDMD pozitive în rinichi (Figura 1B). Rezultate similare au fost găsite în rinichii șoarecilor MRL/LPR și a martorilor de tip sălbatic. Analiza imunoblotting a confirmat expresia și clivajul mult crescute ale GSDMD în specimenele de rinichi ale șoarecilor MRL/LPR (Figura 1C). GSDMD în podocitele glomerulare, celulele tubulare și celulele interstițiale infiltrate a fost crescut la șoarecii MRL/LPR în comparație cu șoarecii de control (Figura 1D). Aceste date au sugerat că mediat de GSDMD a fost activat în țesutul renal afectat de LN (lupusnefrită).

FIGURA 1|GSDMD este puternic crescut și scindat în rinichii pacienților și șoarecilor afectați de LN (nefrita lupusă).

(A) Colorarea imunochimică a GSDMD în specimene renale prelevate de la subiecți sănătoși și LN (lupusnefrită), colorația pozitivă (săgeți roșii) și negativă (săgeți negre) au fost mărite.

(B) Cuantificarea zonelor pozitive GSDMD este afișată în tipul III plus V, IV, IV plus V, V LN (lupusnefrită) pacienţi şi subiecţi sănătoşi.

(C) Analiza imunoblot a domeniului N-terminal clivat de lungime completă și a domeniului C-terminal GSDMD în cortexul renal de la trei perechi de șoareci martor și MRL/LPR.

(D) Colorarea imunochimică a GSDMD în specimene de rinichi prelevate de la martori și șoareci MRL/LPR.

*p < {{0}},05,="" **p="">< 0,01.="" ln="">lupusnefrită), lupusnefrită; FL, lungime completă; NT, domeniu N-terminal; CT, domeniul C-terminal.

Tratamentul combinat suprimă GSDMD-mediatPiroptozaActivarea în podocite primare in vitro

Pentru a investiga efectele inhibitoare ale terapiei combinate asuprapiroptoza, am aplicat metoda de stimulare LPS plus ATP pentru a inducepiroptozaîn podocite de la șoareci MRL/LPR, luând podocite de la șoareci C57 de tip sălbatic ca martor normal. Podocitele de la șoareci MRLlpr au fost amorsate timp de 4 ore cu LPS și ulterior tratate timp de 4 ore cu ATP, un stimul folosit în mod obișnuit pentru GSDMD-mediatpiroptozaactivare(26). În comparație cu controlul normal, podocitele au prezentat ulterior caracteristici morfologice piroptotice, cum ar fi umflarea și barbotarea celulelor. Pretratamentul cu terapie combinată a ameliorat semnificativ caracteristicile morfologice piroptotice și citotoxicitatea (Figura 2A). LPS plus ATP au indus citotoxicitatea podocitelor. În mod comparabil, terapia combinată a scăzut semnificativ citotoxicitatea și secreția IL-1 în supernatant indusă de stimularea LPS plus ATP (Figurile 2B, C). Pentru a verifica în continuare activarea mediată de GSDMDpiroptoza, am analizat inflamazomii canonici și activarea GSDMD folosind imunoblot. În concordanță cu modificările morfologice piroptotice și cu citotoxicitatea, LPS plus ATP au activat semnificativ NLRP3, caspaza -1 și au scindat GSDMD în podocite (Figura 2D). Tratamentul combinat a suprimat în mod semnificativ activarea NLRP3 și a caspazei-1 și a redus nivelul N-terminalului GSDMD. În special, monoterapiile cu tacrolimus, MMF sau prednison au suprimat LPS plus ATP au stimulat citotoxicitatea celulară și secreția L-1, dar terapia combinată a arătat un efect inhibitor mai semnificativ asupra Caspazei-1 și GSDMD. Aceste rezultate au furnizat dovezi care susțin opinia că tratamentul combinat a ameliorat mediat de GSDMDpiroptozaprin suprimarea activării NLRP3 și a caspazei-1.

FIGURA 2|Tratamentul combinat ameliorează piroptoza în podocite in vitro.

(A) Caracteristicile piroptotice au fost expuse în podocite primare cultivate după incubate cu LPS plus ATP și pretratate cu tratament combinat. Săgețile indicau celule care prezintă caracteristici asemănătoare piroptotice.

(B) Supernatanții din celulele provocate au fost analizați pentru moartea celulei, măsurată prin secreția de LDH.

(C) Supernatanții din celulele provocate au fost analizați pentru eliberarea IL-1b.

(D) Analiza imunoblotting a expresiei NLRP3, caspazei-1, GSDMD-NT și ASC după tacrolimus, MMF, prednison sau tratament combinat după activarea inflamazomului NLRP3.

*p < {{0}}.05;="" **p="">< 0,01;="" ***p="">< 0,001;="" ****p="">< 0,0001.="" ldh,="" lactat="">

DSMO, dimetil sulfoxid, FK506, tacrolimus; MMF, micofenolat mofetil; PNS, prednison; COM, terapie combinată; ASC, proteină asemănătoare petei asociată apoptozei.

Tratamentul combinat a suprimat caspaza-1/Indus de GSDMDPiroptozaîn MRL/LPR Mice

Șoarecilor MRL/LPR în vârstă de opt săptămâni li sa administrat o combinație de MMF, tacrolimus și prednison sau vehicul de control. În concordanță cu un studiu anterior (6), după tratament timp de 8 săptămâni, nu a fost găsită nicio diferență în ceea ce privește mortalitatea sau greutatea corporală între grupul de vehicul și grupul de tratament combinat. Spre deosebire de grupul vehicul, terapia combinată a fost foarte eficientă în prevenirea proteinuriei, glomerulosclerozei și infiltrației celulelor imune interstițiale renale (Figura 1 suplimentară).

Apoi, am examinat nivelurile de expresie a caspazei-1 și GSDMD în grupurile de terapie combinată și de control cu ​​vehicul. Analiza imunohistochimică a arătat că expresia caspazei interstițiale glomerulare și renale-1 și GSDMD a fost semnificativ scăzută în grupul de terapie combinată (Figura 3A). Analiza de imunoblotare a constatat, de asemenea, o scădere a expresiei și a clivajului caspazei-1 și GSDMD în cortexele renale ale grupului de tratament combinat (Figura 3B). Mai mult, celulele dublu pozitive cu caspază-1/iodură de propidiu (PI) au fost numărate utilizând citometrie în flux și unpiroptozaFAM Caspase-1kit. Rezultatele au evidențiat o reducere marcată a numărului de celule din sângele periferic caspaze-1*/PI' la șoarecii MRL/LPR care au primit tratamentul combinat în comparație cu șoarecii MRL/LPR tratați cu vehicul. (Figurile 3C, D). În plus, tratamentul combinat a redus semnificativ și concentrația serică Ii (Figura 3E). Astfel, am ajuns la concluzia că tratamentul combinat a suprimat caspaza-1/GSDMD indusăpiroptozaîn rinichii și celulele sanguine ale LN (lupusnefrită) șoareci.

FIGURA 3|Tratamentul combinat a atenuat piroptoza mediată de caspaza-1/GSDMD la șoarecii MRL/LPR.

(A) Colorarea imunochimică a GSDMD și a caspazei-1 în specimenele de rinichi de șoareci MRL/LPR. În comparație cu vehiculul de control, expresia caspazei-1 și GSDMD au fost inhibate semnificativ în grupul de tratament combinat.

(B) Analiza imunoblot a GSDMD și caspazei de lungime completă și scindate-1 în specimenele de cortex renal de șoareci MRL/LPR; compararea rezultatelor din grupul de tratament cu vehicul și combinat.

(C) FACS de celule dublu pozitive caspaze-1/PI din sângele periferic de la șoareci MRL/LPR cărora li sa administrat sau nu un tratament combinat.

(D) Cuantificarea celulelor dublu pozitive de caspază-1/PI din sângele periferic al șoarecilor MRL/LPR cărora li sa administrat sau nu o terapie combinată.

(E) Cuantificarea concentrațiilor serice de IL{{0}}b la șoarecii MRL/LPR cărora li sa administrat sau nu un tratament combinat. ####P < 0,0001.="" facs,="" sortarea="" celulelor="" activate="" prin="" fluorescență;="" ct,="" terapie="">

Terapia combinată a suprimat caspaza-1/GSDMD indusăPiroptozaîn LN (lupusnefrită) Pacienții

Între ianuarie 2020 și iunie 2020, 47 de pacienți cu LN (lupusnefrită) au fost înrolați și au finalizat 43 de 24-săptămâni de terapie combinată. Boala inițială și datele demografice ale cohortei înscrise sunt enumerate în Tabelul suplimentar 1. Cuantificarea caspazei-1/iodură de propidiu (celulele PI dublu pozitive au fost efectuate la pacienții cu LN (lupusnefrită) tip III, IV, V, III plus V, IV plus V și în controale sănătoase folosind apiroptozaKit FAM Caspase-1 și citometrie în flux. În comparație cu controalele sănătoase, numărul de celule dublu pozitive caspaze-1/PI din sângele periferic a fost crescut (Figurile 4A, B). Am examinat, de asemenea, celulele caspaze-1/PI dublu pozitive după 24-săptămâni de terapie și la momentul inițial. După 24-săptămâni de terapie de inducție, incidența CR și PR a fost de 39,5% (17/43) și, respectiv, 32,6% (14/43). Numerele de celule dublu pozitive ale caspazei-1/PI din sângele periferic ale pacienților cu CR și PR au fost reduse remarcabil în comparație cu valoarea inițială (Figura 4C). De asemenea, am identificat o corelație între caspaza-1 indusăpiroptozași SLEDA; datele au arătat în mod clar că raportul caspază-1/PI pozitiv în sângele periferic a fost corelat pozitiv cu SLEDAI (Figura 4D). Ac-FLTD-CMK, un inhibitor derivat din GSDMD, a prevenit dezvoltarea LN (lupusnefrită).

FIGURA 4|Terapia combinată a atenuat piroptoza mediată de caspază-1-la pacienții cu LN (nefrită lupică).

(A) FACS de celule dublu pozitive caspaze-1/PI din sângele periferic al LN (lupusnefrită) pacienţi trataţi cu sau fără terapie combinată.

(B) Cuantificarea celulelor dublu pozitive caspaze-1/PI din sângele periferic de tip III, IV, V, III plus V și IV plus V LN (lupusnefrită) pacienţi şi subiecţi sănătoşi.

(C) Cuantificarea celulelor dublu pozitive caspaze-1/PI din sângele periferic al LN (lupusnefrită) pacienți la momentul inițial, CR, PR și non-remisie după terapia combinată.

(D) Analiza corelației raporturilor de celule dublu pozitive caspaze-1/PI cu SLE-DAI.

**p < 0.01.="" facs,="" sortarea="" celulelor="" activate="" prin="" fluorescență;="" ln="">lupusnefrită), lupusnefrită; CR, remisie completă; PR, remisie parțială; SLE-DAI, indicele de activitate al bolii lupusului eritematos sistemic.

Un studiu recent a constatat că GSDMDhmice a dezvoltat o depunere renală crescută de C3 și IgG, leziuni renale mai severe și o mortalitate sporită într-un model de LES indus de imiquimod.17 Pentru a clarifica în continuare rolul GSDMD în LN (lupusnefrită), șoarecii MRL/LPR au fost tratați cu Ac-FLTD-CMK21 începând cu vârsta de 8-săptămâni, cu vehiculul în ceea ce privește controlul. După 8-săptămâni de tratament, nu a fost găsită nicio diferență în ceea ce privește mortalitatea sau greutatea corporală între vehicul și grupul tratat cu Ac-FLTD-CMK. În comparație cu șoarecii de control al vehiculului, șoarecii MRL/LPR tratați cu Ac-FLTD-CMK au avut un raport albumină-creatinină în urină mai mic (Figura 5A), o concentrație mai mică de creatinine serice (Figura 5B), glomeruloscleroza redusă (Figura 5C) și CD3 infiltrarea celulară pozitivă, CD4 și CD68 (Figura 5D). Rezultatele imunohistochimiei au arătat o expresie redusă a GSDMD (Figura 5D) și secreția IL-1 serice suprimată determinată prin ELISA (Figura 5E). În mod colectiv, datele au sugerat că Ac-FLTD-CMK a inhibatpiroptozaîn rinichii afectați de LN (lupusnefrită).

FIGURA 5|Ac-FLTD-CMK, un inhibitor derivat din GSDMD, a prevenit dezvoltarea LN (nefrita lupica).

(A) Raportul albumină-creatinină din urină a fost calculat la șoarecii MRL/LPR cărora li sa administrat sau nu un inhibitor GSDMD.

(B) Creatinina serică la șoarecii MRL/LPR cărora li sa administrat sau nu un inhibitor GSDMD.

(C) Imagini reprezentative ale specimenelor de rinichi colorate cu Acid periodic-Schiff (PAS) și cuantificarea procentului de glomeruloscleroză.

(D) Colorarea imunochimică a CD3, CD4, F4/80 și GSDMD. (E) Cuantificarea concentrațiilor serice de IL-1b la șoarecii MRL/LPR cărora li sa administrat sau nu un inhibitor GSDMD.

Datele sunt prezentate ca medie ± SEM. #p < {{0}},05,="" ##p=""><>

DISCUŢIE

Terapia combinată este o strategie promițătoare din cauza ratei mai ridicate de RC și de răspuns general, a unui timp mai scurt până la remisie și a mai puține efecte secundare. Până acum, mecanismele moleculare de bază ale terapiei combinate nu au fost cunoscute. Recent, Fu et al.(6) au tratat șoareci MRL/LPR cu monoterapii sau terapie combinată și au efectuat o analiză transcriptomică cuprinzătoare pe rinichi întregi. Interesant este că ei au descoperit că terapia combinată, dar nu și monoterapiile, au suprimat expresia caspazei-1 în mod specific și unic.

Inflamazomul NLRP3/ASC/caspază-1 este acum recunoscut ca un contributor cheie la patogeneza LN (lupusnefrită). Inflamazomii NLRP3 din podocite sunt activați la șoarecii predispuși la lupus și, de asemenea, la pacienții cu LN (lupusnefrită). Când inflamazomii NLRP3 au fost suprimați cu un inhibitor de caspază-1, proteinuria, leziunile histologice renale și ștergerea procesului podocitelor s-au dovedit a fi ameliorate la șoarecii predispuși la lupus(8). Huang şi colab. (27) a raportat că NLRP3 a fost exprimat în celulele tubulare ale LN (lupusnefrită) clasa IV și că activarea NLRP3 a fost corelată pozitiv cu scorul indicelui de activitate pentru pacienții cu LN. S-a dovedit că caspaza-1 joacă un rol vital în lupus și disfuncția vasculară și, prin urmare, este o țintă potențială pentru noi intervenții terapeutice(28). Medicamentele experimentale emergente, cum ar fi RIP3(29), antagoniştii receptorului P2X7(30), inhibitorii GSK-3 (31) şi un agonist Nrf2 (32) au inhibat dezvoltarea LN (lupusnefrită) la șoarecii MRL/LPR prin modularea activității inflamazomului NLRP3/ASC/caspază-1, ceea ce evidențiază importanța și criticitatea inflamazomului NLRP3/ASC/caspază-1 în LN. Concentrațiile serice crescute de IL-18 sunt corelate cu severitatea bolii și cu gradul de afectare/implicare renală la pacienții cu LES(33). Din câte știm, se pare că familia gasdermin ar putea fi esențială pentru dezvoltareapiroptoza, dar au existat puține dovezi pentru prezența GSDMD/GSDME la pacienții cu LES.

În general, am examinat activarea și exprimarea GSDMD în specimenele de biopsie renală prelevate din LN (lupusnefrită) pacienți și șoareci MRL/LPR. GSDMD a fost puternic indus și scindat în podocite glomerulare și celule tubulare și celule interstițiale infiltrate. Ulterior, șoarecilor MRL/LPR li s-a administrat o combinație de MMF, tacrolimus și prednison sau vehicul. În comparație cu grupul de control cu ​​vehicul, activarea caspazei-1 și a GSDMD a fost redusă în grupul de tratament combinat. Gradul depiroptozaîn sângele periferic a fost, de asemenea, mult mai scăzută în LN (lupusnefrită) pacienţi după administrarea terapiei combinate. În plus,piroptozaîn sângele periferic a fost corelat pozitiv cu SLEDAI, ceea ce a sugerat căpiroptozaîn sângele periferic ar putea acționa ca un marker semnificativ pentru activitatea LES. Astfel, am emis ipoteza că terapia combinată ar putea conferi efecte benefice în LN (lupusnefrită) prin inhibarepiroptozaindusă de caspază-1/GSDMD. Studiile anterioare asupra structurii cristaline ale caspazei-1 într-un complex cu Ac-FLTD-CMK au dezvăluit multe interacțiuni enzimă-inhibitor care au împiedicat recunoașterea GSDMD de către caspază-1. Cu toate acestea, am descoperit că Ac-FLTD-CMK, care acționează ca un inhibitor derivat din GSDMD, a inhibatpiroptozaîn LN (lupusnefrită), care ar putea fi indusă de un mecanism diferit.

Recent, într-un model murin indus TLR7-de SLE(34), șoarecii GSDMD-/- au dezvoltat un grad mai mare de afectare a rinichilor și mortalitate crescută, ceea ce a sugerat inițial că ștergerea GSDMD ar avea un efect protector și ar fi asociat cu inflamație sistemică și producție de autoanticorpi cu o mortalitate crescută asociată. Șoarecii cu deficit de GSDMD dezvoltă o depunere mai proeminentă a unui complex imunitar glomerular în specimenele de rinichi și proteinurie mai mare în comparație cu șoarecii de tip sălbatic. Secreția sporită de HMGB1 extracelular a fost găsită și în GSDMD-/limfocite, sugerând că necroza/piroptozaa avut loc când GSDMD a fost absent.

Caspaza-1 declanșeazăpiroptozaprin clivaj GSDMD. În schimb, în ​​celulele cu deficit de GSDMD sau cu GSDMD scăzut, caspaza-1 declanșează apoptoza și apoi necroza secundară dependentă de GSDME șipiroptoza. Când activitatea GSDMD este absentă după terapie, GSDME ar putea, de asemenea, să schimbe apoptoza mediată de caspază{0}}lapiroptoza(35,36). În plus, activarea caspazei-8 a fost mult îmbunătățită la macrofagele care aveau deficit de GSDMD. Activarea semnificativă a caspazei-8 a fost găsită și în LN cu deficit de GSDMD indus de TLR7- (lupusnefrită) soareci(34). Astfel, în absența GSDMD, este probabil ca caspaza-1 să coopereze cu caspaza-8 pentru a determina apoptoza mediată de caspază-3-GSDME să treacă lapiroptozaîn LN (lupusnefrită), o ipoteză care necesită investigații experimentale suplimentare.

Există mai multe limitări în studiul actual. În primul rând, pe baza datelor actuale, am verificat că terapia combinată ar putea suprimapiroptoza, dar alte tratamente, cum ar fi terapia duală cu steroizi și MMF, steroizi și tacrolimus sau anticorpi anti-CD20 ar putea avea, de asemenea, efecte comparabile. În al doilea rând, mecanismul molecular exact al efectului de inhibiție al terapiei combinate asupra caspazei-1 nu este bine explorat. Nu în ultimul rând, observăm relația dintre celulele dublu pozitive caspaze-1/PI din sângele periferic cu SLE-DAI și schimbarea înainte și după tratamentul terapiei combinate într-un LN retrospectiv (lupusnefrită) cohorta de pacienti. Valoarea predictivă clinică a celulelor dublu pozitive caspaze-1/PI pentru activitatea bolilor și răspunsul la tratament trebuie investigată în continuare într-o cohortă prospectivă mai mare.

În general, am identificat că terapia combinată a conferit efectele sale benefice prin suprimarea induse de caspaza-1/GSDMDpiroptozaîn LN (lupusnefrită), care a oferit o nouă perspectivă asupra mecanismelor celulare implicate. Într-adevăr, terapia combinată a suprimat expresia caspazei-1 în mod specific și unic. Inhibarea farmacologică sau genetică a NLRP3 și a caspazei-1 a îmbunătățit funcția renală și a suprimat autoimunitatea în LN (lupusnefrită). Rolul patofiziologic al caspazei-1 în LN (lupusnefrită) este demnă de studii suplimentare, iar terapiile care vizează GSDMD la pacienții cu LN (lupusnefrită) trebuie evaluate foarte atent.

Metoda de tratament pentrupiroptoza

REFERINȚE

1. Saxena R, Mahajan T, Mohan C.lupusNefrită: Actualizare curentă.Arthritis Res Ther (2011)13:240.doi: 10.1186/ar3378

2. An Y, Zhang H, Liu Z. Individualizing Therapy inlupusNefrită. Kidney Int Rep (2019)4:1366-72.doi: 10.1016/j.ekir.2019.08.005

3. Bao H, Liu ZH, Xie HL, Hu WX, Zhang HT, LiLS. Tratament cu succes de clasa V plus IVlupusNefrităCu terapia multițintă. J Am Soc Nephrol (2008)19:2001-10.doi: 10.1681/ASN.2007121272

4. Liu Z, Zhang H, Liu Z, Xing C, Fu P, Ni Z, et al.Multitarget Therapy for Induction Treatment oflupusNefrită: Un studiu randomizat, Ann Intern Med (2015)162:18-26. DOI: 10.7326/M14-1030

5. Zhang H, Liu Z, Zhou M, Liu Z, Chen J, Xing C și colab.Multitarget Therapy for Maintenance Treatment oflupusNefrită. J Am Soc Nephrol(2017)28:3671-8.doi:10.1681/ASN.2017030263

6. Fu J, Wang Z, Lee K, Wei C, Liu Z, Zhang M, et al. Analiza transcriptomică descoperă noi mecanisme sinergice în terapia combinată pentrulupusNefrită. Kidney Int(2018)93:416-29.doi: 10.1016/j.kint.2017.08.031

7. Ummarino D.lupusNefrită: NLRP3 Inflamazomul aprinde disfuncția podocitelor. Nat Rev Rheumatol(2017)13:451.doi: 10.1038/Orpheum. 2017.9